Applicazione di rumore stocastico per la valutazione della sensibilità mediale del neurone del nucleo in vitro

Questo protocollo è una delle prime dimostrazioni dell’applicazione diretta del rumore elettrico ai singoli neuroni nelle fette di tessuto. Per osservare le risposte neuronali agli stimoli elettrici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che siamo in grado di valutare uno specifico insieme di parametri di stimolo sui singoli neuroni.

Questa tecnica consente l’ottimizzazione dei parametri di stimolo per indirizzare particolari tipi neuronali funzionali. Ciò ha implicazioni per lo sviluppo di terapie migliori per la disfunzione dell’equilibrio. Prima di iniziare l’estrazione del tronco encefalico, Equilibry s-ACSF con CARPOGEN e raffreddare la soluzione a meno 80 gradi Celsius per 25 minuti fino a quando non si è formato un liquame di ghiaccio.

Dopo che la soluzione si è raffreddata, utilizzare una lametta da barba arrotondata numero 22 per fare un’incisione cutanea sagittale nel cranio di un topo C-57 nero da tre a cinque settimane e utilizzare l’estremità appuntita di un paio di forbici modello standard per fare una piccola incisione, a partire dalla lambda, lungo la sutura sagittale. Usando un paio di curve poco profonde Pierson von Jours, rifletti attentamente le ossa parietali ed esoccipitali riparate e fai il bagno al cervello in s-ACSF ghiacciato. Quindi, isolare il cervello dal forebrain e dal suo racchiuso disossato usando una lama di rasoio dritta numero 11 per tagliare il solco esoccipitale parietale e alla negula caudale.

Montare il ventrale dello stelo cerebrale isolato e scendere su un blocco di polistirolo trapezoidale tagliato pervicosamente e utilizzare un pezzo di carta velina per rimuovere qualsiasi liquido in eccesso da tutto il tessuto sezionato. Utilizzare la colla cianoacrilato per fissare il blocco di polistirolo allo stadio di taglio con il tronco encefalico attaccato rostrale e verso il basso. Utilizzare una velocità avanzata di 0,16 millimetri al secondo e un’ampiezza di vibrazione di tre millimetri per ottenere 200 micrometri fette trasversali dell’MVN.

Quindi utilizzare una pipetta rifilata in plastica per trasferire le fette di tessuto su un disco di carta da filtro incarbinginato ACSF a 25 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Per l’elettrofisiologia del morsetto a celle intere, tirare prima micro pipette con una resistenza finale che varia da tre a cinque mega Oms se riempite con una soluzione interna a base di potassio e poste nella vasca da bagno. Per ottenere registrazioni di patch patch a cellule intere da singoli neuroni nell’MVN, trasferire una singola fetta di tessuto dalla camera di incubazione alla camera di registrazione di un set elettrofisiologico standard e utilizzare un filo di nylon su un peso a forma di U per fissare la fetta.

Perfondere continuamente la camera di registrazione con ACSF carbonginato a 25 gradi Celsius a una portata di tre millilitri al minuto e riempire una micro pipetta con soluzione interna. Applicare una piccola quantità di pressione positiva utilizzando una pipetta per allontanare i detriti dalla punta della pipetta. Usando un obiettivo di potenza inferiore, localizzare l’MVN prima di passare a un’alta potenza per localizzare i singoli neuroni all’interno dell’MVN.

Prima di violare il tessuto con la pipetta, applicare una piccola quantità di pressione positiva per spingere i detriti lontano dalla punta della pipetta e utilizzare il micro manipolatore per spostare la pipetta verso il neurone selezionato. Una piccola fossette dovrebbe formarsi sulla membrana neuronale. Rilasciare la pressione positiva e applicare una piccola quantità di pressione negativa.

Una volta raggiunta una tenuta da un giga Om, applicare una leggera pressione negativa corta e acuta al supporto della pipetta attraverso la porta di aspirazione per rompersi la membrana e creare una configurazione a celle intere. Quindi ottenere registrazioni di morsetti di corrente a cella intera secondo protocolli standard. Per applicare il rumore stocastico e sinusoidale ai singoli neuroni del nucleo vestibolare mediale, impostare l’intervallo di ampiezze da tre a 24 amplificatori pico per determinare la soglia neuronale e la velocità di cottura e raggruppare le intensità di stimolo più alte e più basse per determinare la soglia sensoriale.

Successivamente, calcola il tasso di attivazione medio nel periodo di 10 secondi, durante il quale verrà iniettato il passaggio di corrente depolarizzante per ogni singolo livello di corrente. Usa i valori medi della velocità di fuoco per generare un tasso di attivazione rispetto al plottaggio corrente. Quindi eseguire un’analisi di regressione lineare per determinare il gradiente della linea di adattamento migliore per determinare il guadagno neuronale.

Né il rumore sinusoidale né quello stocastico cambiano i tassi di cottura del basilico dei neuroni MVN rispetto al controllo di nessuna registrazione del rumore. In questo esperimento, il livello di rumore selezionato di 6 amplificatori pico è sotto soglia, in quanto si può osservare che la velocità media di cottura inizia ad aumentare dalla soglia sperimentale di 12 amplificatori pico. Questa soglia è stata determinata obiettivamente raggruppando i livelli di stimolo al di sopra e al di sotto della soglia sperimentale.

Il guadagno neuronale è stato valutato sottosondo i neuroni a una suite di passaggi di corrente depolarizzante da zero a 50 amplificatori pico in 10 incrementi di amplificatore pico con e senza rumore. Infatti, il rumore sinusoidale e stocastico applicato alle ampiezze di sotto soglia di sei amplificatori pico può alterare il guadagno dei neuroni MVN. I parametri di stimolo stabiliti possono essere applicati al nervo innovando i singoli neuroni per fornire stimoli più naturalistici.