Name: Differentiatie van muisborst epitheel HC11 en EpH4 Cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Leer differentiatie-inductie van muizenborst-epitheelcellen HC11 en EpH4 voor kankerbiologie. Deze methode helpt onderzoekers signaaltransductiepaden te bestuderen en therapeutische doelen te identificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De HC11 cellijn werd vriendelijk verstrekt door Dr. D. Medina (Houston, TX). De auteurs zijn dr. Andrew Craig van Queen's University dankbaar voor vele reagentia en waardevolle suggesties. EpH4 cellen waren een geschenk van Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick leverde uitstekende technische ondersteuning voor 3D-cultuurstudies.
De financiële steun van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), de Canadian Institutes of Health Research (CIHR), de Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), de Canadian Breast Cancer Research Alliance , de Ontario Centres of Excellence, de Breast Cancer Action Kingston (BCAK) en de Clare Nelson legaat fonds door middel van subsidies aan LR is dankbaar erkend. BE ontving subsidiesteun van CIHR, CBCF, BCAK en Cancer Research Society Inc. PTG wordt ondersteund door een Canada Research Chair, Canadian Foundation for Innovation, CIHR, NSERC en Canadian Cancer Society. MN werd ondersteund door een studentenschap van het Terry Fox Training Program in Transdisciplinary Cancer Research van NCIC, een Graduate award (QGA), en een Dean's Award van Queen's University. MG werd ondersteund door postdoctorale beurzen van het Us Army Breast Cancer Program, het Ministerie van Onderzoek en Innovatie van de provincie Ontario en de Advisory Research Committee van Queen's University. VH werd ondersteund door een CBCF doctoraatsbeurs en een postdoctorale beurs van de Terry Fox Foundation Training Program in Transdisciplinaire Cancer Research in samenwerking met CIHR. Hanad Adan ontving een NSERC zomerstudentenschip. BS werd ondersteund door een Queen's University graduate award.

1. Beplating HC11 Cellen
<ol><li>In een laminaire stroomkap met behulp van steriele technieken bereiden een fles met 50 mL HC11 celmedium: RPMI-1640 met 10% foetaal runderserum (FBS), 5 μg/mL insuline en 10 ng/mL EGF (zie Tabel met materialen).</li>
	<li>Plaat ongeveer 400.000 cellen per 3 cm petrischaal: Pass twee 10 cm, 50% confluent Petri gerechten in twintig 3 cm gerechten in HC11 medium. De cellen moeten goed worden verspreid, maar drogen moet worden vermeden.<ol>
<li>Zuig het medium aan in een kolf met behulp van een vacuümpomp.</li>
		<li>Voeg 250 μL trypsine toe (zie Materiaaltabel)per plaat van 10 cm. Wervel en raak de plaat vanaf de zijkanten terwijl het horizontaal blijft om de trypsine te verspreiden en de aangesloten cellen te verjagen</li>
		<li>Observeer onder fase contrast microscopie met een 4x doel om ervoor te zorgen dat de cellen zijn begonnen los te maken van de randen voordat pipetteren.</li>
		<li>Aanzuigen ongeveer 1,5 mL hc11 medium in een steriele, 9 inch Pasteur pipet en spuit het verticaal tegen de cellen. Draai de petrischaal tijdens het spuiten om alle cellen los te maken. U moet snel werken om te voorkomen dat het drogen van de cellen.</li>
		<li>Breng alle cellen naar de fles met het HC11 medium en wervel.</li>
		<li>Pipetteer 2 mL celvering in elke 3 cm petrischaal. Rock de petrischaaltjes dwars om gelijkmatig te verspreiden. Plaats de cellen in een 37 °C, 5% CO2 incubator.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De volgende dag, of wanneer cellen zijn ~ 90-100% confluent, aanzuigen van het medium, en vervang het met medium met FBS en insuline, maar ontbreekt EGF.</li>
</ol>2. Differentiatie inductie, monitoring en kwantificering van HC11 Cellen
<ol><li>Voeg na het kweken van de cellen in medium het ontbreken van EGF voor 24 uur toe, voeg het differentiatiemedium (HIP medium) toe tot tien platen van 3 cm: RPMI-1640 aangevuld met 10% FBS, 1 μg/mL Hydrocortison (zie Tabel met materialen), 5 μg/mL Insulin en 5 μg/mL Prolactin (zie Tabel met materialen) voor maximaal 10 dagen.</li>
	<li>Houd de andere tien platen van 3 cm als regelaars: Verander op een medium met 10% FBS en 5 μg/mL insuline zonder EGF en HIP.</li>
	<li>Verander het medium om de 2-3 dagen in zowel HIP-behandelde cellen als besturingselementen. Pipeter het medium zorgvuldig om ervoor te zorgen dat cellen niet loskomen.</li>
	<li>Om differentiatie te controleren (d.w.z. de vorming van "koepels"), observeer de cellen onder fasecontrastmicroscopie(figuur 1A, linkerpaneel). Als de cellen groene fluorescentie-eiwit (GFP) uitdrukken, observeer dan fluorescentiemicroscopie (excitatie = 485/20; emissie = 530/25; vergroting 240x; 20x objectief) (figuur 1A, rechterpaneel).</li>
	<li>Om de mate van differentiatie te kwantificeren, extract eiwitten uit een petrischaaltje elk van HIP-behandelde cellen en controles, eenmaal per dag gedurende een totaal van 10 dagen en sonde westerse vlekken voor β-caseïne (zie Tabel met materialen) ( Figuur1B).<ol>
<li>Schraap de cellen op ijs met 1,5 mL ijskoude fosfaatbufferde zoutlijn (PBS) in een 1,8 ml plastic centrifugebuis.</li>
		<li>Pellet de cellen op 350 x g,1 min, 4 °C.</li>
		<li>Was de pellet snel 2x met ijskoude PBS. Giet eventuele resten af.</li>
		<li>Maak een lysisbuffer: 50 mM HEPES (pH = 7,4), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7, 1% NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 0,5 mM fenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF), 10 μg/mL aprotinine, 10 μg/mL leeptupin16. Voeg 100 μL per petrischaal van 3 cm toe.</li>
		<li>Verhelder het lysaat door centrifugeren op 10.000 x g voor 10 min in de kou.</li>
		<li>Bepaal de eiwitconcentratie (zie Materiaaltabel)en laad 10-20 μg eiwit uit elk monster op een 10% polyacrylamide-SDS-gel.</li>
		<li>Elektrofore voor 15 uur bij 45 V, of bij 100 V voor ~2-2,5 uur.</li>
		<li>Breng over op een nitrocellulose of PVDF-membraan met behulp van een elektroblotting transfer-apparaat (zie Tabel met materialen).</li>
		<li>Blok met 5% runderserumalbumine (BSA) in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 (TBST).</li>
		<li>Voeg het primaire antilichaam, geit anti-β-caseinverdunde 1:2.000 of muis anti-β actine verdund 1:1.000 (zie Tabel met materialen).</li>
		<li>Was 3x met TBST, 5 min elke keer.</li>
		<li>Voeg het secundaire antilichaam, mierikswortel peroxidase (HRP) gekoppelde ezel anti-geit verdund 1:2.500, of HRP gekoppeld paard anti-muis antilichaam verdund 1:10.000.</li>
		<li>Was 3x met TBST, 5 min elke keer.</li>
		<li>Voeg ECL-reagentia toe aan het membraan volgens de instructies van de fabrikant (zie Tabel met materialen).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Beplating en 3D-groei van EpH4-cellen in EHS-matrix
LET OP: De matrix is vloeibaar bij temperaturen <10 °C en vast bij temperaturen boven. Bewaar bij -80 °C. Ontdooi bij 4 °C de nacht voor gebruik. Pre-chill de weefselkweekplaten en pipet tips bij -20 °C voorafgaand aan de behandeling en houd de matrix, platen en pipet tips op ijs om te voorkomen dat het stollen.
<ol><li>Kweek EpH4-cellen in 2D in RPMI-1640 medium met 10% FBS en 5 μg/mL insuline (EFG is niet vereist).</li>
	<li>Bereid EpH4 groeimedium aangevuld met 10% (v/v, 3.500 μL) of 20% (v/v 2.000 μL) matrix in twee conische buizen van 50 mL. Blijf op ijs tot ze klaar zijn voor gebruik.</li>
	<li>Coat 10 putten (elk 1 cm2) van een 24-putplaat met 150 μL onverdunde matrix. Verdeel de matrix met een pipettip. Vermijd het creëren van bubbels. Tik voorzichtig op de zijkanten van de plaat terwijl u deze horizontaal houdt om ervoor te zorgen dat de matrix gelijkmatig over de onderkant van de put wordt verdeeld.</li>
	<li>Incubeer de 24 putplaat bij 37 °C gedurende 1 uur om de matrix te laten stollen.</li>
	<li>Trypsinize EpH4 cellen zoals hierboven beschreven voor HC11 cellen en tel ze met een hemocytometer. Breng 5 x 104 cellen per put over op een steriele conische centrifugebuis van 1,5 m L en draai op 250 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Trek het medium voorzichtig aan en plaats de buis op ijs.</li>
	<li>Hersuspendecellen in 350 μL EpH4 groeimedium aangevuld met 20% matrix met behulp van een 1 ML pipet tip terwijl de conische buis op ijs blijft. Vermijd bubbels. Het is belangrijk om een eencellige vering te garanderen.</li>
	<li>Zodra de onderste laag matrix is gestold (de matrix moet lijken doorschijnend en lichter van kleur in vergelijking met de eerste coating van de putten), voeg de 350 μL van de cel suspensie aan elke gecoate goed en plaats in een CO2 incubator op 37 ° C voor ~ 1 h om de 20% matrix laag te stollen.<ol>
<li>Observeer de cellen microscopisch in fasecontrast met een 4x doelstelling. Enkele cellen moeten zichtbaar zijn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg 200 μL EpH4 medium met 10% matrix toe bovenop de 350 μL cellen die in 20% matrix zijn opgehangen. Incubeer bij 37 °C.</li>
</ol>4. Differentiatie Inductie van EpH4-cellen geteeld in 3D (figuur 2)
OPMERKING: Naast differentiatie kunnen EpH4-cellen ook tubulogenese ondergaan wanneer ze worden gestimuleerd met HGF (hepatocyte groeifactor) in de 3D-cultuur. Buisvormige uitwassen kunnen worden gezien na 10 dagen van HIP en HGF stimulatie.
<ol><li>Begin met differentiatie-inductie van EpH4 cellen 1 dag na beplating in de matrix. Verwijder voorzichtig 150 μL van het bovenste medium met 10% matrix uit de putten met behulp van een plastic pipet tip. Voeg 200 μL EpH4 medium met HIP en 10% matrix toe.</li>
	<li>Vervang het 10% matrix-HIP medium om de 2 dagen gedurende maximaal 10 dagen. Kweek controlecellen in hetzelfde 10% matrixmedium zonder HIP.</li>
	<li>Monitor de mammosfeervorming in fasecontrast(figuur 3A, onderste paneel).</li>
</ol>5. Tubulogenese inductie van EpH4-cellen geteeld in 3D(figuur 3A en 3C)
<ol><li>Bereid 24 putplaten en EpH4-cellen voor groei in matrix zoals beschreven in de stappen 3.1–3.9. De dag na het beplaten van de cellen in de matrix, verwijder 150 μL EpH4 medium met 10% matrix uit de putten met behulp van een plastic pipet tip. Voeg 200 μL EpH4-medium toe dat 10% matrix, HIP en 20 ng/mL HGF bevat (zie Tabel met materialen).</li>
	<li>Vervang het 10% matrix/HIP/HGF medium om de 2 dagen gedurende maximaal 12-14 dagen.</li>
	<li>Monitor tubulivorming microscopisch met behulp van een doelstelling van 20x of 40x(figuur 3A, rechterpaneel).</li>
</ol>6. Kwantificering van differentiatie: westelijke blotting voor β-caseine
<ol><li>Voorzichtig pipet uit de 10% matrix-HIP medium uit de putten. Spoel de 20% matrixlaag 2x af met 350 μL ijskoude PBS. De sferoïden moeten nog steeds aanwezig zijn in de matrixlaag.</li>
	<li>Voeg 700-1.000 μL ijskoude PBS met 1 mM ethyleenvormigetetraaminetetraacetic zuur (EDTA) direct in de putten. Maak de onderste laag van de 100% matrix voorzichtig los van de put met een pipettip om sferoïden in die laag terug te krijgen. Schud zachtjes gedurende 30 min bij 4 °C.</li>
	<li>Breng de sferoïde suspensie voorzichtig over op een conische buis. Spoel de putten met ~ 500 μL PBS-EDTA om eventuele resterende sferoïden in de putten te herstellen en toe te voegen aan de conische buis.</li>
	<li>Rock on ice voor nog eens 30 min. Zorg ervoor dat de matrix volledig is opgelost. Als zichtbare matrixklontjes worden gezien, voegt u meer PBS-EDTA toe of schudt u langer.</li>
	<li>Centrifugeer de oplossing om de sferoïden 5 min op 350 x g te pelleteren.</li>
	<li>Aanzuigen van de supernatant, lyse de sferoïden in ijskoude lysis buffer, en sonde voor β-casein, cyclische D1, en p120RasGAP door Westerse vlekken als in stap 2.5 boven16. Als primaire antilichamen gebruikt u de anti-β-caseine verdund van geiten anti-β-caseine verdund 1:2.000, konijn anti-cyclin D1 verdund 1:2.000, en muis anti-p120 verdund 1:2.000. Voor secundaire antilichamen, gebruik HRP gekoppeld ezel anti-geit verdund 1:2.500, HRP gekoppeld ezel anti-konijn verdund 1:2.500, en HRP gekoppeld paard anti-muis verdund 1:10.000.</li>
</ol>

<ol><li>Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engaged+for+survival%3B+from+cadherin+ligation+to+Stat3+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Jaks-Stat%22%5BJournal%5D)">Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation.</a> Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).</li>
<li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+HC11+mouse+breast+epithelial+cell+differentiation+by+the+E-cadherin%2FRac+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis.</a> Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).</li>
<li>Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolactin+regulation+of+beta-casein+gene+expression+and+of+a+cytosolic+120-kd+protein+in+a+cloned+mouse+mammary+epithelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line.</a> The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).</li>
<li>Humphreys, R. C., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stably+transfected+HC11+cells+provide+an+in+vitro+and+in+vivo+model+system+for+studying+Wnt+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function.</a> Cell growth & differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).</li>
<li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((differentiation+and+survival+of+HC11+mammary+epithelial+cells%3A+diverse+effects+of+receptor+tyrosine+kinase-activating+peptide+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors.</a> European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).</li>
<li>Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+epithelial+cell+differentiation+in+vitro+is+regulated+by+an+interplay+of+EGF+action+and+tenascin-C+downregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation.</a> Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2445-2456 (1995).</li>
<li>Arbeithuber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+5+expression+in+mouse+mammary+gland+cells+is+not+driven+by+promoter+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation.</a> BioMed Research International. 2015, 460598(2015).</li>
<li>Morrison, B., Cutler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Mammary+Epithelial+Cells+form+Mammospheres+During+Lactogenic+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1265(2009).</li>
<li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+suppression+of+normal+mammary+epithelial+cells+by+wild-type+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53.</a> Oncogene. 9, 443-453 (1994).</li>
<li>Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+mammary+epithelial+and+fibroblastic+cell+clones+in+coculture+form+structures+competent+to+differentiate+functionally%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally.</a> Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).</li>
<li>Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+3-kinase+is+required+for+adherens+junction-dependent+mammary+epithelial+cell+spheroid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation.</a> Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).</li>
<li>Mroue, R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cultures+of+mouse+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).</li>
<li>Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+murine+mammary+epithelial+stem+cell-like+cells+shows+similarities+to+human+breast+cancer+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression.</a> Breast Cancer Research. 11 (3), 26(2009).</li>
<li>Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+EpH4+mammary+epithelial+cell+subpopulations+which+differ+in+their+morphogenetic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).</li>
<li>Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+differentiation+regulated+by+MicroRNA-200a+in+mammary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands.</a> PLoS One. 8 (6), 65127(2013).</li>
<li>Arulanandam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac%2FCdc42+and+Stat3%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).</li>
<li>Geletu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+cadherins+control+survival+through+the+gp130%2FStat3+axis%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis.</a> BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).</li>
<li>Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+R%28h%29oads+to+Stat3%3A+Stat3+activation+by+the+Rho+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases.</a> Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).</li>
<li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+structure%2C+to+survival%3A+Stat3+activation+by+cadherin+engagement%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement.</a> Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).</li>
<li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Differentiation+of+HC11+Mouse+Breast+Epithelial+Cells+by+the+Signal+Transducer+and+Activator+of+Transcription-3%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3.</a> Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).</li>
<li>Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+growth+factor%2Fscatter+factor+induces+a+variety+of+tissue-specific+morphogenic+programs+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells.</a> Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).</li>
<li>Starova, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Role+of+cell+adhesion+microevironment+and+the+Src%2FStat3+axis+in+autocrine+HGF+signaling+during+breast+tumourigenesis%22">Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis</a>. , Queen's University. M.Sc. Thesis (2008).</li>
<li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rasleu61+blocks+differentiation+of+transformable+3T3+L1+and+C3HT1%2F2-derived+preadipocytes+in+a+dose-+and+time-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner.</a> Cell Growth & Differentiation. 8, 11-21 (1997).</li>
<li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Housekeeping+gene+products%3B+levels+may+change+with+confluence+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells.</a> Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).</li>
<li>Vultur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li>
<li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li>
<li>Hoskin, V. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22A+novel+regulatory+role+of+Ezrin+in+promoting+breast+cancer+cell+invasion+and+metastasis%22">A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis</a>. , Queen's University. Ph.D. Thesis (2015).</li>
<li>Su, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+confluence-induced+activation+of+signal+transducer+and+activator+of+transcription-3+%28Stat3%29+triggers+epithelial+dome+formation+via+augmentation+of+sodium+hydrogen+exchanger-3+%28NHE3%29+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).</li>
<li>Ostrovidov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+tissue+engineering%3A+methods+to+form+skeletal+myotubes+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).</li>
<li>Cass, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Novel+Stat3+and+Stat5+pathways+in+epithelial+cell+differentiation%22">Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation</a>. , Queen's University. Ph.D. thesis (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.

HC11 cellen zijn bij uitstek geschikt voor de studie van differentiatie in combinatie met neoplastische transformatie. Een bijkomend voordeel is dat HC11-cellen gemakkelijk te infecteren zijn met Mo-MLV-gebaseerde retrovirale vectoren om een verscheidenheid aan genen uit te drukken. In onze handen, EpH4 cellen waren moeilijker te infecteren met dezelfde retrovirale vectoren dan HC112.
Cell-to-cell contact en groeiarrestatie zijn belangrijke voorwaarden voor HC11 celdiff...

In normale weefsels of tumoren, cellen hebben uitgebreide mogelijkheden voor hechting aan hun buren in een driedimensionale organisatie, en dit wordt nagebootst in cultuur door hoge dichtheid celgroei. Cel-op-cel hechting wordt voornamelijk bemiddeld via cadherinreceptoren, die cel- en weefselarchitectuur definiëren. Interessant is dat onlangs werd aangetoond dat cadherinen ook een krachtige rol spelen bij signaaltransductie, vooral bij overlevingssignalering1. Paradoxaal genoeg bleken sommige van deze cel-op-cel hechtingssignalen afkomstig van cadherinen onlangs te worden gedeeld door zowel differentiatie als neoplasie2. Hier beschrijven we methoden voor inductie en beoordeling van differentiatie in twee representatieve soorten muisborst epitheliale cellijnen, HC11 en EpH4.
De HC11 muisborst epitheliale cellijn kan een nuttig model voor de studie van epitheelceldifferentiatie. HC11 cellen zijn een COMMA-1D-afgeleide cellijn, afkomstig van de borstklier van een halfzwangere Balb/c muis3. In tegenstelling tot andere COMMA-1D afgeleide klonen, de HC11 kloon heeft geen behoefte aan exogene toegevoegde extracellulaire matrix of coteelt met andere celtypes voor de in vitro inductie van het endogene β-caseingen door lactogene hormonen3. Deze cellijn is op grote schaal gebruikt in differentiatiestudies omdat het belangrijke kenmerken van het normale borstepitheel heeft behouden: HC11-cellen kunnen het kanaalepitheel gedeeltelijk reconstrueren in een gewist borstvetpad4. Bovendien kunnen ze zich onderscheiden in een tweedimensionale (2D) cultuur wanneer ze worden gekweekt tot samenvloeiing aan een plastic petrischaaloppervlak in aanwezigheid van een steroïde zoals Hydrocortison of Dexamethason, naast Insulin en Prolactin (HIP medium) die epidermale groeifactor (EFG) missen, een remmer van differentiatie5,6,7. Onder deze omstandigheden produceren HC11-cellen melkeiwitten zoals β-caseïne en WAP, die binnen 4 dagen na inductie door westerse vlekken kunnen worden gedetecteerd. Tegelijkertijd vormt een deel van hc11 cellen rudimentaire borstklierachtige structuren die op een stochastische manier "koepels" worden genoemd. Koepels zijn zichtbaar 4-5 dagen na inductie en geleidelijk toenemen in omvang tot dag 10, gelijktijdig met een toename van β-caseine productie8. Interessant is dat HC11 cellen bezitten mutant p539, en dus vertegenwoordigen een preneoplastic staat. Om deze reden is het HC11-model bij uitstek geschikt om signaleringsnetwerken van differentiatie te bestuderen in combinatie met neoplasie in hetzelfde celsysteem.
EpH4 cellen, een afgeleide van IM-2 cellen, zijn een niet-tumorigene cellijn oorspronkelijk afgeleid van spontaan vereeuwigde muis borstklier epitheelcellen geïsoleerd van een mid-zwangere Balb / c muis10. EpH4 cellen vormen continue epitheelmonolagen in de 2D-cultuur, maar onderscheiden zich niet in klierachtige structuren10,11. Echter, na 3D-groei in een materiaal bestaande uit een mengsel van extracellulaire matrix eiwitten geproduceerd door EHS muis sarcoom cellen12 (EHS matrix, matrix, of Matrigel, zie Tabel met materialen), in aanvulling op stimulatie met HIP, EpH4 cellen kunnen recapituleren de eerste stadia van borstklier differentiatie. Onder deze omstandigheden vormen EpH4-cellen sferoïden (ook wel mammosferen genoemd) die apical-basale polariteit en een holle lumen vertonen, en die in staat zijn de melkeiwitten β-caseïne en WAP te produceren, vergelijkbaar met zogende borstepitheelcellen. In tegenstelling tot HC11 cellen, die ongedifferentieerd zijn, en sommige uitdrukken mesenchymale markers13, EpH4 cellen vertonen een zuiver luminale morfologie14. EpH4 cellen zijn ook gemeld aan melkeiwitten te produceren in 2D-cultuur door stimulatie met dexamethason, insuline, en prolacactine15. Deze aanpak sluit echter de studie uit van regelgevende effecten die de borstkliermicroomgeving in de 3D-cultuur nabootsen.

<table><tbody><tr><td>30% Acrylamide/0.8% Bis Solution</td><td>Bio Rad</td><td>1610154</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-Cyclin D1 antibody</td><td>rabbit, Santa Cruz</td><td>sc-717</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-p120 antibody</td><td>mouse, Santa Cruz</td><td>sc-373751</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-&beta; actin antibody</td><td>mouse, Cell Signalling technology</td><td>3700</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-&beta; casein antibody</td><td>goat, Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17971</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Bio Shop</td><td>APR600</td><td>Lysis Buffer</td></tr><tr><td>Bicinchoninic Acid Solution</td><td>Sigma</td><td>B9643-1L-KC</td><td>Protein Determination</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Bio Shop</td><td>ALB007.500</td><td>Protein Determination</td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate</td><td>Bio Rad</td><td>170-5061</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Copper(II) sulphate</td><td>Sigma</td><td>C2284-25ML</td><td>Protein Determination</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td><td>14952-500</td><td>Staining</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Shop</td><td>EDT001.500</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>Medium for HC11 Cells</td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>PAA</td><td>A15-751</td><td>Cell Culture Medium</td></tr><tr><td>Goat- Anti Rabbit-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2004</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Hepatocyte Growth Factor recombinant</td><td>Gibco</td><td>PHG0321</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>Cell Culture</td></tr><tr><td>Horse Anti-Mouse HRP</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>7076</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td>HIP Medium</td></tr><tr><td>insulin</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td>HIP Medium</td></tr><tr><td>Laminar-flow hood</td><td>BioGard Hood</td><td></td><td>Cell Culture</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Bio Shop</td><td>LEU001.10</td><td>Lysis Buffer</td></tr><tr><td>Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel)</td><td>Corning</td><td>CACB 354230</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-Goat HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8360</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88 Reagent</td><td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td><td>475904-100GM</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Multi-photon confocal microscope</td><td>Leica TCS SP2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Bio Shop</td><td>SOV850</td><td>Lysis Buffer</td></tr><tr><td>Na4P207</td><td>Sigma</td><td>125F-0262</td><td>Lysis Buffer</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio Shop</td><td>SOD001.1</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher Scientific</td><td>7681-49-4</td><td>Lysis Buffer</td></tr><tr><td>Nikon digital Camera</td><td>Coolpix 995</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Bio Rad</td><td>1620112</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>9016-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>30525-89-4</td><td>Staining</td></tr><tr><td>Phase Contrast Microscope</td><td>Olympus IX70</td><td></td><td>Cell Culture</td></tr><tr><td>Phenylmethylsuphonyl fluoride</td><td>Sigma</td><td>329-98-6</td><td>Lysis Buffer</td></tr><tr><td>pMX GFP Rac G12V</td><td>Addgene</td><td>14567</td><td></td></tr><tr><td>Prolactin</td><td>Sigma</td><td>L6520</td><td>HIP Medium</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>Cell Culture Medium</td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish 35</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900.</td><td>Cell Culture</td></tr><tr><td>Tissue Culture Plate-24 well</td><td>Sarstedt</td><td>83.1836.300</td><td>Cell Culture</td></tr><tr><td>Transfer Apparatus</td><td>CBS Scientific Co</td><td>EBU-302</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Tris Acetate</td><td>Bio Shop</td><td>TRA222.500</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>9002-07-7.</td><td>Cell Culture</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio Shop</td><td>TWN510.500</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Veritical Gel Electrophoresis System</td><td>CBS Scientific Co</td><td>MGV-202-33</td><td>Western Blotting</td></tr></tbody></table>

differentiatie van muisborst epitheel hc11 en eph4 cellen

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Cadherinen spelen een belangrijke rol in de regulering van celdifferentiatie en neoplasie. Hier beschrijven we de oorsprong en methoden van de inductie van differentiatie van twee muisborst epitheliale cellijnen, HC11 en EpH4, en het gebruik ervan om complementaire stadia van borstklierontwikkeling en neoplastische transformatie te bestuderen.
De HC11 muisborst epitheliale cellijn is afkomstig van de borstklier van een zwangere Balb/c muis. Het onderscheidt wanneer gekweekt aan samenvloeiing die aan een plastic petrischaaloppervlak in middel met foetale kalfsserum en Hydrocortisone, Iknsulin en Prolactin (ship medium) wordt vastgemaakt. Onder deze omstandigheden produceren HC11-cellen de melkeiwitten β-caseïne en weizuureiwit (WAP), vergelijkbaar met zogende borstepitheelcellen, en vormen rudimentaire borstklierachtige structuren die "koepels" worden genoemd.
De EpH4 cellijn is afgeleid van spontaan vereeuwigde muisborstklier epitheelcellen geïsoleerd van een zwangere Balb/c muis. In tegenstelling tot HC11 kunnen EpH4-cellen zich volledig onderscheiden in sferoïden (ook wel mammosferen genoemd) wanneer ze worden gekweekt onder driedimensionale (3D) groeiomstandigheden in HIP medium. Cellen worden beproefd, opgehangen in een 20% matrix bestaande uit een mengsel van extracellulaire matrix eiwitten geproduceerd door Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muis sarcoom cellen, verguld op de top van een laag geconcentreerde matrix coating een plastic petrischaal of multiwell plaat, en bedekt met een laag van 10% matrix-bevattende HIP medium. Onder deze omstandigheden vormen EpH4-cellen holle sferoïden die apical-basale polariteit vertonen, een holle lumen, en β-caseine en WAP produceren.
Met behulp van deze technieken, onze resultaten aangetoond dat de intensiteit van de cadherin / Rac signaal is van cruciaal belang voor de differentiatie van HC11 cellen. Terwijl Rac1 is noodzakelijk voor differentiatie en lage niveaus van geactiveerde RacV12 verhoging differentiatie, hoge RacV12 niveaus blok differentiatie terwijl het induceren van neoplasie. EpH4-cellen daarentegen vertegenwoordigen een vroeger stadium in borstepitheeldifferentiatie, die wordt geremd door zelfs lage niveaus van RacV12.

Het is al lang bekend dat de differentiatie van epitheelcellen en adipocyten samenvloeiing en betrokkenheid van cadherinenvereist 2. Wij en anderen hebben aangetoond dat cel-op-cel hechting en betrokkenheid van E- of N-cadherine en cadherin-11, zoals gebeurt met de samenvloeiing van gekweekte cellen, leidt tot een dramatische toename van de activiteit van de kleine GTPases Rac en celdeling controle eiwit 42 (Cdc42), en dit proces leidt tot activering van interleukine-6 (IL6) familie cytokines en S...

We beschrijven technieken voor differentiatie-inductie van twee borstepitheellijnen, HC11 en EpH4. Terwijl beide foetale kalf serum, insuline, en prolacactine nodig om melkeiwitten te produceren, EpH4 cellen kunnen volledig onderscheiden in mammosferen in driedimensionale cultuur. Deze complementaire modellen zijn nuttig voor signaaltransductiestudies van differentiatie en neoplasie.

Differentiatie van muisborst epitheel HC11 en EpH4 Cellen

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

De HC11- en EpH4-cellen zijn epitheelcellijnen van muizenborsten die zich kunnen onderscheiden in de cultuur. Tegelijkertijd kunnen deze cellen worden getransformeerd door een aantal oncogenen. Deze cellen zijn ideaal voor de studie van de onderlinge relatie tussen differentiatie en de neoplastische transformatie.Deze technieken kunnen worden gebruikt in signaaltransductiestudies om doelen voor kankertherapie te ontdekken. Bijvoorbeeld, de kleine GTPase Rac en andere moleculen kunnen leiden tot transformatie van borstepepitheelcellen wanneer uitgedrukt in hoge niveaus, maar verrassend op lage niveaus, kunnen ze leiden tot differentiatie. Andere signaaltransducers kunnen zich op dezelfde manier gedragen.De beginselen kunnen ook van toepassing zijn op andere vormen van differentiatie wanneer celvloeiing een belangrijke rol speelt, bijvoorbeeld differentiatie van adipocyten of myobuizen. Iemand die deze techniek voor de eerste keer moet in gedachten houden dat beplating van de HC11 cellen belangrijk is. Dit komt omdat cel-naar-cel contact belangrijk is voor differentiatie.Een ander punt om op te letten is dat een goede extractie van EpH4-cellen uit de matrix van cruciaal belang is voor eiwitkwantificering, omdat eventuele residuen de eiwitbepaling beïnvloeden. Visuele demonstratie van deze methode is nuttig omdat sommige details van het protocol op papier moeilijk te beschrijven zijn. Begin met het bereiden van een fles van 50 milliliter HC11 celmedium volgens manuscriptaanwijzingen.Om de cellen plaat, aspirate het medium van vijf zes centimeter 50%confluent Petri gerechten en was de cellen met ongeveer 1,8 milliliter trypsine met behulp van een steriele negen inch katoen aangesloten Pasteur pipet. Voeg vervolgens 200 microliter trypsine per plaat toe en draai de plaat om de bijgevoegde cellen los te maken. Observeer de cellen onder fasecontrast microscopie met een 4X doelstelling om ervoor te zorgen dat ze zijn begonnen te verjagen.Dan aspirate ongeveer 1,5 milliliter HC11 medium met een steriele negen inch Pasteur pipet en spuit het verticaal tegen de cellen tijdens het draaien van de schotel om ervoor te zorgen dat spatten te voorkomen. Breng alle cellen naar de fles met HC11 medium en wervelen gelijkmatig te verspreiden in de fles. Dan aliquot de cel suspensie in 20 drie centimeter Petri gerechten door pipetting twee milliliter cellen per schotel.Rock de petrischaaltjes om de cellen te verspreiden en ze 's nachts uit te broeden op 37 graden Celsius en 5%koolstofdioxide. Op de volgende dag, wanneer de cellen 90 tot 100% confluent zijn, het medium aanzuigen en vervangen door medium met FBS, maar zonder EFG. Na het kweken van de cellen in medium zonder EGF voor 24 uur, voeg de differentiatie medium tot 10 gerechten en groeien de cellen voor maximaal 10 dagen houden van de andere 10 gerechten als controles.Verander het medium om de twee tot drie dagen met zowel HIP behandeld en controle cellen. Als u de differentiatie wilt controleren, moet u de cellen observeren met een fasecontrastmicroscopie. Gebruik fluorescentiemicroscopie als de cellen groene fluorescerende eiwitten uitdrukken.Bovendien kwantificeren van de mate van differentiatie door het extraheren van eiwitten uit de HIP behandelde en controlecellen eenmaal per dag en het uitvoeren van Western Blot analyse. Verzamel en plaats het EpH4 groeimedium, de EHS-matrix en twee conische buizen van 50 milliliter op ijs. Prechill de weefselkweek platen met pipet tips op min 20 graden Celsius en bereid EpH4 groeimedium aangevuld met 10 of 20%matrix in twee 50 milliliter conische buizen en houd ze op ijs tot klaar voor gebruik.Na het ophalen van de gepekaerde weefselkweekplaten bij min 20 graden Celsius, bedekt u 10 putten van de 24-putplaat met 150 microliters onverdund matrix door de matrix met een pipet te verspreiden. Vermijd het creëren van bubbels bij het verspreiden van de matrix. Tik vervolgens voorzichtig op de zijkanten van de plaat en broed de plaat een uur lang uit op 37 graden Celsius om de matrix te laten stollen.Bereid u ondertussen voor op de differentiatie door de EpH4-cellen goed te trypsiniseren zoals eerder beschreven en te zorgen voor eencellige suspensies na resuspensie van trypsinized cellen. Tel vervolgens de cellen in suspensie met een hemocytometer. Breng vijf keer 10 naar de vier cellen per put naar een 1,5 milliliter steriele kegelvormige centrifuge buis en draai ze op 250 keer g gedurende vijf minuten.Voorzichtig aspirate het supernatant medium en plaats de buis op ijs. Gebruik een 1 milliliter pipettip om de cellen opnieuw op te hangen in 350 microliter van EpH4 groeimedium aangevuld met 20%-matrix terwijl de buizen op ijs blijven om bubbels te voorkomen. Zodra de onderste laag is gestold, voeg de 350 microliters van cel suspensie aan elke gecoate put en plaats het in een koolstofdioxide incubator op 37 graden Celsius gedurende een uur om de 20% matrix laag te stollen.Observeer de cellen met fasecontrastmicroscopie om ervoor te zorgen dat enkele cellen zichtbaar zijn. Voeg vervolgens 200 microliter eph4-medium met 10% matrix erop toe en broed de plaat uit op 37 graden Celsius. Begin differentiatie inductie een dag na het plating van de cellen in de matrix.Verwijder voorzichtig 150 microliter van top 10%matrix medium en voeg 200 microliter van EpH4 medium met HIP en 10% matrix en voor controles voeg een 10% matrix medium zonder HIP. Vervang het medium om de twee dagen gedurende maximaal 10 dagen door mammosfeervorming te monitoren door fasecontrastmicroscopie. Om de differentiatie te kwantificeren, voorzichtig pipette uit de 10%-matrix HIP medium uit de putten en spoel de 20% matrix laag met 350 microliters van ijskoude PBS.Voeg vervolgens 70 tot 100 microliters ijskoude PBS toe met één millimolar EDTA direct in de putten en maak voorzichtig de onderste laag van 100% matrix los met een pipetpunt. Schud de plaat gedurende 30 minuten zachtjes op vier graden Celsius. Breng de sferoïde suspensie voorzichtig over naar een conische buis en spoel de putten af met 500 microliter PBS EDTA om eventuele resterende sferoïden terug te krijgen.Rock de buis nog eens 30 minuten op ijs om ervoor te zorgen dat de matrix volledig oplost. Als zichtbare matrixklontjes worden gezien, voeg dan meer PBS EDTA toe of schud langer. Centrifugeren de oplossing op 350 keer g om de sferoïden pellet.Dan aspirate de supernatant, lyse de sferoïden, en sonde de cellen voor beta-caseïne, cyclische D1, en p120RasGAP door westerse blotting. Er is een opvallende afhankelijkheid van differentiatie op de sterkte van het Rac-signaal in HC11-cellen. Terwijl endogene CRAC1 nodig is voor differentiatie en lage niveaus van mutatiegeactiveerde RacV12 een toename van differentiatiecapaciteit veroorzaken, leiden hoge RacV12-niveaus tot een blok van differentiatie en veroorzaken neoplasie.Toen de differentiatie-eigenschappen van EpH4-cellen werden onderzocht in een 3D-matrixcultuur, bleek dat de bèta-caseïneproductie piekte op acht tot tien dagen en de cyclische D1-expressie maximaal was op vier tot zes dagen na HIP-stimulatie. Om de positionering van individuele cellen te bepalen, werden ze bevlekt met DAPI en afgebeeld met confocale microscopie. Innerlijke celdood en vorming van holle lumen werd waargenomen in de mammospheres, terwijl toevoeging van HGF resulteerde in de vorming van buisvormige structuren.Iemand die deze techniek voor de eerste keer moet in gedachten houden dat de beplating van de HC11 cellen belangrijk is. Ook een goede extractie van de EpH4-cellen uit de matrix is van cruciaal belang voor eiwitkwantificering, omdat eventuele residuen de eiwitbepaling beïnvloeden. Deze techniek kan worden gebruikt om andere signaaltransducers te onderzoeken die zich op een vergelijkbare manier kunnen gedragen.Als er driver mutaties bij een kanker, dan is hun volledige remming niet nodig, omdat lage niveaus resterende daadwerkelijk zou leiden tot differentiatie.

differentiation-of-mouse-breast-epithelial-hc11-and-eph4-cells

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

HC11 lactogenic differentiatie kan worden gekenmerkt door de vorming van overkoepelde bedoelde structuren als mammospheres. De structuren kunnen worden opgesomd door de fase-contrast-microscopie om te helpen bij het kwantificeren van lactogenic differentiatie.

Muis uier epitheelcellen vorm Mammospheres Tijdens lactogenic Differentiatie

Een eenvoudige methode beschreven voor het analyseren effecten weefsel fibroblasten op geassocieerde epitheelcellen. De combinatie van deze methode en driedimensionale weefselkweek kan worden vergemakkelijkt analyse van cellen na isolatie van 3D. De techniek is voor cellen van verschillende maligne potentieel, waardoor systematisch onderzoek effecten van tumor-geassocieerde stroma op tumorcellen.

Isolatie van Borst epitheelcellen van drie-dimensionale Mixed-cel Spheroid Co-cultuur

Werkwijze voor menselijke mammaire chirurgische discard materiaal wordt beschreven. Verwerkte weefsel in de vorm van organoids, onbeperkt worden opgeslagen bevroren of in kweek zijn geplaatst voor lange termijn. Deze methode maakt experimentele onderzoek van normale menselijke epitheliale celbiologie en de effecten van exogene verstoringen.

Verwerking van de mens Vermindering mammoplasty en mastectomie weefsels voor Cultuur van de Cel

Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van primaire preneoplastische mammaire epitheelcellen afkomstig van genetisch gemanipuleerde muizen met borstkanker te bepalen of er correlaties tussen specifieke gedragsparameters en verschillende genetische laesies beoordelen.

Time-lapse imaging of Primary preneoplastische uier epitheelcellen afkomstig van de genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker

In de afgelopen jaren de vorming van kiemcellen middels in vitro kweekmethoden is aangetoond met behulp van verschillende soorten van somatische stamcellen. Dit artikel zal visueel presenteren de differentiatie van pasgeboren muizen afgeleide stamcellen om vroeg eicel-achtige cellen.

Differentiatie van pasgeboren muis Skin afgeleide stamcellen in Germ-achtige cellen<em&gt; In vitro</em

De indirecte immunofluorescentie protocol beschreven in dit artikel laat de detectie en de lokalisatie van eiwitten in de muis borstklier. Een complete methode wordt gegeven voor te bereiden borstklier monsters, om immunohistochemie uit te voeren, om de afbeelding van het weefsel secties met behulp van fluorescentie microscopie, en om beelden te reconstrueren.

Indirecte Immunofluorescentie op Bevroren Secties van Muis borstklier

Een ideaal model voor het bestuderen van de biologie van volwassen stamcellen is de muis haarfollikel. Hier presenteren we een protocol voor het isoleren van verschillende populaties van haarfollikelstamcellen en epidermale keratinocyten, met behulp van enzymatische vertering van de dorsale muishuid gevolgd door FACS-analyse.

Isoleren haarfollikel stamcellen en epidermale keratinocyten van Dorsale Mouse Skin

Dit protocol beschrijft methoden voor het zuiveren, kwantificeren en karakteriseren van extracellulaire vesicles (EVs) / exosomen van niet-aanhechtende / mesenchymale mammary epitheelcellen en voor het gebruik ervan om het vermogen van de borstkanker te overdragen naar luminale mammary epitheelcellen. EV's / exosomen afgeleid van stamachtige mammale epitheelcellen kunnen deze celeigenschap overbrengen aan cellen die de EV's / exosomen innemen.

Overdracht van Mammary Gland-vormende Vermogen Tussen Mammary Basal Epithelial Cellen en Mammary Luminale Cellen via Extracellulaire Vesicles / Exosomen

Muis prostaat organoïden vertegenwoordigen een veelbelovende context voor het evalueren van mechanismen die differentiatie reguleren. Dit artikel beschrijft een verbeterde aanpak om prostaat organoïden vast te stellen, en introduceert methoden om (1) eiwit lysaat van organoïden te verzamelen, en (2) de organoïden voor de confocale microscopie van de hele Mount te fixeren en te vlechten.

Evaluatie van de differentiatie capaciteit van muizen prostaat epitheelcellen met behulp van Organoid cultuur

Dit experimentele protocol beschrijft de isolatie van BCSC's uit borstkankercel- en weefselmonsters, evenals de in vitro en in vivo assays die kunnen worden gebruikt om bcsc-fenotype en -functie te beoordelen.

Isolatie en functionele beoordeling van menselijke borstkankerstamcellen uit cel- en weefselmonsters

De huidige studie rapporteert een eenvoudiger, tijdbesparend en economisch protocol om primaire menselijke borstepitheelcellen (HMEC's) efficiënt te isoleren en te laten groeien uit kleine hoeveelheden borstweefsel. Dit protocol is geschikt voor het snel produceren van primaire HMEC's, zowel voor laboratorium- als klinische toepassingen.

Isolatie en kweek van primaire menselijke borstepitheelcellen

Leer differentiatie-inductie van muizenborst-epitheelcellen HC11 en EpH4 voor kankerbiologie. Deze methode helpt onderzoekers signaaltransductiepaden te bestuderen en therapeutische doelen te identificeren.

Differentiatie van muisborst epitheel HC11 en EpH4 Cellen

Meer video's verkennen