Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Tomatrod Transformation Efterfulgt af podning med Ralstonia Solanacearum for ligetil genetisk analyse af bakteriel visnesygdom
Summary March 11th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her præsenterer vi en alsidig metode til tomatrodtransformation efterfulgt af podning med Ralstonia solanacearum for at udføre ligetil genetisk analyse til undersøgelse af bakteriel visnesygdom.
Transcript
Denne protokol er betydelig, fordi det giver forskerne mulighed for at udføre ligetil genetisk analyse af bakteriel visne sygdom i tomat. Den største fordel ved denne teknik er, at manipulation af genekspression og efterfølgende analyser kan udføres på kort tid og med de små krav til udstyr og plantevækst plads. Dette er metode er meget alsidig, og det kan anvendes til andre afgrøder planter til at udføre både patogen inokulering og andre fysiologiske analyser.
For at opretholde steriliteten under manipulation af planter in vitro, er det vigtigt at holde pladerne lukket, når de er uden for flowhætten. Dette er en nem teknik, men det kræver flere trin for manipulation. Visualiseringen af denne metode vil bidrage til at se små tricks, der er vanskelige at forklare i manuskriptet, hjælpe andre forskere til at gennemføre metoden i deres laboratorier.
Bidrage til at demonstrere denne procedure vil være Achen Zhao, en kandidat studerende. Efter sterilisering og vask af tomatfrø, overføre dem til halv styrke Murashige og Skoog medium uden saccharose. Hold frøene i mørke ved en temperatur mellem 25 og 28 grader Celsius i tre dage.
Placer autoklavede 8,5-kvadrat-centimeter filtre inde ni-kvadrat-centimeter petriskåle, der indeholder halv styrke Murashige og Skoog medium, og sted seks spirede tomatfrø på hver plade. Forsegle pladen med Micropore tape, og inkubere de spirede frø ved 25 til 28 grader Celsius i tre til fire dage. Dyrk Agrobacterium rhizogener MSU440 i fast LB medium med passende antibiotika i to dage ved 28 grader Celsius før plantens transformation.
Ved hjælp af en steril skalpel, skære radikel og bunden af hypocotyl af tomat planter. Brug plast tips eller en skalpel klinge til at høste A.rhizogenes biomasse fra overfladen af LB medium, og forsigtigt dyppe skåret tomat planter i den bakterielle biomasse. Efter dette, dække tomat planter med en to-centimeter-by-fire-centimeter halvcirkelformet filter papir for at holde en høj luftfugtighed og lette overlevelse og nye rod udvikling.
Det er vigtigt at holde planterne i høj luftfugtighed i et miljø, der tillader transpiration. For at gøre dette skal du dække frøplanterne med filterpapir og lukke pladen med Mikroporetape. Opbevar de omdannede tomatplanter i seks til syv dage i et vækstkammer ved en temperatur mellem 25 og 28 grader Celsius.
Brug derefter en steril skalpel til at skære de nye behårede rødder, og lad planterne til at producere nye behårede rødder. Når anden generation af nye behårede rødder vises, skal du fjerne filterpapiret oven på planterne og forsegle pladen med Mikroportape igen. For at visualisere DsRed fluorescens eller andet udstyr til plantein vivo billeddannelse, markere de positive transformerede rødder, som kan identificeres ved den røde fluorescens.
Brug en skalpel til at fjerne de negative ikke-transformerede rødder, som kan identificeres ved deres mangel på rød fluorescens. Overfør de planter, der viser rød fluorescens til en ny plade, der indeholder halvstyrke Murashige og Skoog medium for at lette udviklingen af den transformerede rod som hovedroden. Hold de planter, der ikke viser rød fluorescens i samme plade for at kontrollere fremkomsten af fluorescerende rødder i senere tidspunkter.
Dæk frøplanter med en to-centimeter-by-fire-centimeter halvcirkel filter papir, forsegle pladen, og inkubere planter for at lade dem udvikle nye behårede rødder. Forbered podning potter, hvor overfladen af rødderne vil blive udsat for den bakterielle inokulum ved først iblødsætning af podning potter med vand, hælde overskydende vand, og derefter placere dem i en plastik plantning bakke. Ved hjælp af pincet overføres de valgte planter med transformerede rødder til vaccinationspotterne.
Dæk bakken med plastfolie eller et gennemsigtigt låg, og hold dem på 25 til 28 grader Celsius med 65% fugtighed. Tag dækslet ud efter fem eller seks dage. Grow Ralstonia i fem LB flydende medium i en orbital shaker ved 28 grader Celsius, med omrystning ved 200 rpm, indtil den stationære fase.
Mål den optiske tæthed ved 600 nanometer for at bestemme bakterietallene. Bakteriekulturen fortyndes med vand til en OD600 på 1. Placer 16 til 20 vaccination potter, der indeholder omdannet tomatplanter i en vaccinationsbakke.
Hæld derefter 300 milliliter fortyndet bakteriel inokulum i bakken, og lad planterne suge i inokulum i 20 minutter. Derefter skal du forberede en ny bakke med et lag pottejord. Flyt de podede potter ind i den nye bakke, og placer bakkerne i et vækstkammer med 75% fugtighed, en temperatur mellem 26 og 28 grader Celsius, og en fotoperiode på 12 timers lys og 12 timers mørke.
Her omdannes tomatrødder og podes med Ralstonia for at udføre simpel genetisk analyse til undersøgelse af bakteriel visnesygdom. Udviklingen af sygdomssymptomer spores i tomatplanter med rødder omdannet med en tom vektor og dem, der omdannes med en RAI konstruktion rettet mod tomat CESA6. Data om sygdomsindekset indsamles fra samme forsøgsenhed over tid efter en vilkårlig skala fra nul til fire og følger ikke en gaussisk fordeling, hvilket udelukker brugen af standardtest for parametriske data.
Som en standardtilgang anvendes en U Mann-Whitney, tosidet, ikke-parametrisk test for at sammenligne både kontrol- og infektionskurverne. Ifølge denne analyse synes forskellen mellem medianerne af begge kurver at være ikke-signifikant. Det er også muligt at kvantificere området under sygdomsfremdriftskurven, hvilket gør det muligt at kombinere flere observationer af sygdomsfremdrift i en enkelt værdi.
Området under sygdommens fremskridtskurve viser en højere værdi for kontrolplanter sammenlignet med tomat CESA6 RNAi planter i slutningen af infektionsprocessen, hvilket indikerer, at tomat CESA6-tavshed planter er mere modstandsdygtige over for Ralstonia infektion end kontrol planter. Konfidensintervaller giver mulighed for med stor sandsynlighed at anslå en række værdier, hvor populationsværdien for en given variabel findes. Som det ses her, området af 95% tillid interval for kontrol og infektion kurver skøn en højere chance for resistens, når CESA6 er bragt til tavshed.
Sygdom indeks værdier kan omdannes til binære data, overvejer en sygdom indeks lavere end to svarende til nul og en sygdom indeks lig med eller højere end to svarende til en. Dette gør det muligt at repræsentere en overlevelseskurve efter Ralstonia-vaccination. Forskellene i overlevelsesraten mellem kontrol- og de inficerede planter er ikke statistisk signifikante i henhold til den statistiske test Gehan-Breslow-Wilcoxon.
Ekspressionen af CESA6 analyseres derefter i to tilfældigt udvalgte transformerede rødder før vaccinationstrinnet, hvilket viser, at den øgede modstand mod Ralstonia korrelerer med det reducerede udtryk for CESA6. Efter to runder af udvælgelse, en transformation sats på 35 til 40%kan opnås, og denne værdi kan øges ved at udføre yderligere udvælgelse runder. Under udførelsen af denne procedure, er det vigtigt at holde planterne dækket med et stykke filterpapir for at opretholde høj luftfugtighed og for at forsegle pladerne med Micropore for at sikre gasudveksling.
Efter rodtransformationen kan mange af behandlingerne anvendes til at studere planteresponsen ved observation af rodfysiologi eller ved hjælp af molekylærbiologi, cellebiologi eller biokemi. Hovedsageligt, denne teknik vil give forskere med begrænsede ressourcer til at udføre genetisk analyse af bakteriel infektion i tomat rødder.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE