Name: 内皮管形成アッセイに適用可能な線維芽細胞由来3Dマトリックスシステム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 学ぶ線維芽細胞由来3Dマトリックスの作製法。アスコルビン酸刺激によりin vivoに近い細胞外基質を生成し、脱細胞化後に内皮細胞を培養して管形成を観察できます。細胞-基質相互作用の研究に有用です。

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このプロトコルの開発は、PI12/02037、PI15/02101、PI17/01847、PI18/01034 および RD12/0036/0041 Instituto de Salud Carlos III からサポートされました。フォンド・ヨーロッパ・デ・デサロロ地域(FEDER) によって;「CIBER de Cancer」によって, CB16/12/00273 と CB16/12/00446, サルド・カルロス3世-フェーダーのインスティトゥートから;そして、フンダシオン・シエンティフィカAECC(膵臓癌を標的とする多面的なアプローチ)によって。クリスティーナ・ペーニャは、サルド・カルロス3世のミゲル・サーブト契約を受領しています。M.オードは英語のテキストを手伝いました。この研究を通じて、ラボメンバーの皆様の助けとアドバイスに感謝します。

ヒト組織サンプルは、マドリードのラモン・イ・カハル病院の研究倫理委員会の承認を得て得られた。
1. ソリューションの準備
<ol><li>0.2%ゼラチン溶液を調製する:PBSの500 mLにゼラチン1gを加える。溶液をオートクレーブし、4°Cに保ちます。使用前に0.22μmフィルタでフィルターを適用してください。</li>
	<li>1%グルタルアルデヒドを調製する:25%グルタルアルデヒド原液1mLを24mLのPBSに加える。使用前に0.22μmフィルタでフィルターを適用してください。</li>
	<li>1 Mエタノールアミンを調製する:使用前に0.22μmフィルターで滅菌H2Oフィルターでエタノールアミン溶液を調製します。 メモ:エタノールアミンにはセキュリティキャップが付いていますので、針と注射器が必要です。</li>
	<li>アスコルビン酸を調製する:50mg/mLの原液アスコルビン酸(光感受性)の0.1 mLを100mLの培地に加える。</li>
	<li>リシスバッファーを準備する:NH4OHの20 nMでPBS 0.5%トリトン100Xを準備します。使用直前にNH4OHを追加してください。</li>
	<li>PBSペン/ストレップを準備する:100 U/mLペンと100 μg/mLストレップにペン/ストレップのストックソリューションを希釈します。</li>
	<li>10% FBS で DMEM を準備する: DMEM の 500 mL に 10% FBS を追加します。100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン、0.1 mg/mL ノルモシン、0.25 μg/mL アンホテリシン B を補足してください。</li>
	<li>2%BSA熱変性を調製する:無菌水の100 mLにBSAの2gを追加します。沸騰したお湯を7分間温めます。</li>
	<li>抗生物質でFBSを準備する:200 U/mLペニシリン、200 μg/mLストレプトマイシン、100 μg/mLゲンタマイシン、2.5 g/mLアンホテリシンBを含むFBSを補う。</li>
</ol>2. 細胞培養製剤
<ol><li>不死化線維芽細胞株<ol>
<li>培養組換えテロメラーゼトランスフェクト不死ヒト包皮線維芽細胞(BJ-hTERT、ATCC CRL-4001)をDMEMで10%FBSで、37°Cおよび5%CO2で維持する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>内皮細胞<ol>
<li>ヒト臍静脈内皮細胞(HUVECs、ATCC PCS-100-013)を2%FBSを含有するEBM-2培地中で培養し、37°および5%CO2で維持する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>線維芽細胞原発培養 メモ:CAFの設立と文化のために、私たちのグループが以前に公開したプロトコルは6に従いました。<ol>
<li>簡単に言えば、組織サンプルを約2〜3mm3の小片に切断し、高濃度の抗生物質を有するFBSで種子を切断する。</li>
		<li>最初の線維芽細胞が現れたら、細胞維持のために培地をFBM培地に交換してください。 メモ:組織の起源に応じて、細胞培養物は容易に汚染され得る。抗生物質を補充したPBSでサンプルを洗浄し、汚染度の高い組織(例えば、結腸6)を用いて、30〜45分間振る。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 線維芽細胞由来の3Dマトリックス(カステロ・クロスおよびクキエルマン16から適応)
<ol><li>6ウェルプレートの各ウェルに0.2%ゼラチン溶液を2mL加え、37°Cで1時間、または4°Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>ゼラチンを吸引し、PBSの2 mLで洗浄する。</li>
	<li>1%グルタルアルデヒドの2 mLを追加し、RTで30分間インキュベートし、グルタルアルデヒドはゼラチンを架橋します。</li>
	<li>グルタルアルデヒドを吸引し、2mLのPBSで井戸を5分間洗浄します。</li>
	<li>1 M エタノールアミンを 2 mL 加え、RT で 30 分間インキュベートすると、残りのグルタルアルデヒドをブロックするように作用します。</li>
	<li>エタノールアミンを吸引し、2mLのPBSで井戸を5分間洗浄します。</li>
	<li>10% FBS で DMEM を 1 mL 追加します。培地がすぐにピンク色になったら、培地を取り出し、2mLのPBSで洗浄し、10%FBSでDMEMを再度1mL加えます。</li>
	<li>線維芽細胞懸濁液の種子1mLは、各ウェルに5 x 105細胞を有する。各井戸の総容積は2 mLになります。</li>
	<li>培養細胞は合流100%に達するまでに達する。次に、培地を取り出し、DMEMを10%FBSに50μg/mLアスコルビン酸で交換し、使用する場合は追加の処理を行います。</li>
	<li>新鮮なDMEMと10%FBS、50 μg/mLアスコルビン酸を2日ごとに6日間交換してください。 注:追加の治療が使用される場合(例えば、PDGF-BB、TGF-βおよび/または他の成長因子)、アスコルビン酸処理が追加されるのと同じ日にそれらを追加する。</li>
	<li>最後のアスコルビン酸処理の2日後に培地を取り出し、2mLのPBSで洗浄する。</li>
	<li>ゆっくりと1mLのリシス緩衝液を加え、37°で予熱し、各井戸に加える。線維芽細胞がリンパが出るまでRTで5〜10分間インキュベートする(顕微鏡下で観察可能)。</li>
	<li>慎重に、lysisバッファーを除去することなく、PBSの2 mLを追加します。次いで、PBSの約2.5mLを吸引する。合計 3 回のワッシュに対して 2 回繰り返します。</li>
	<li>最終的に、2.5 mL の PBS を取り出し、ペン/ストレップ(それぞれ 100 U/mL および 100 μg/mL)で PBS を 2 mL 追加します。フィルムでシールし、最大3ヶ月間4 °Cに保ちます。 メモ:実験によっては、生成された行列の長期保存が結果に影響を与える場合があります。できるだけ早く行列を使用することをお勧めします。コラーゲン観察などの構造アッセイにマトリックスを使用する場合、マトリックスを固定し、より長い期間保存することができます。このプロトコルは、6ウェル培養プレート用に示されています。他のプレートを使用することができますが、反応量と細胞懸濁液濃度は、井戸面積に応じて再計算する必要があります。</li>
</ol>4. チューブ形成アッセイ
<ol><li>最大合流になるまで EBM-2 2% FBS で HUVEC 細胞を成長させます。</li>
	<li>8時間FBSなしで媒体をEBM-2に置き換えます。</li>
	<li>細胞を播種する前に行列を準備します。<ol>
<li>冷蔵庫からマトリックスを取り出し、RTで1時間置きます。</li>
		<li>熱変性2%BSAの2 mLを加算して行列をブロックします。37 °Cで1時間インキュベートする。</li>
		<li>BSAを吸引し、2mLのPBSで洗浄する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>以前に3D線維芽細胞由来マトリックスでコーティングされた6ウェルプレートの各ウェル上のFBS枯渇培地中の種子2 x 105 HUVEC細胞。</li>
	<li>内皮細胞を37°Cで16時間インキュベートする。</li>
	<li>標準的な明視野顕微鏡でチューブ状の構造形成を20-40倍の倍率で調べます。</li>
</ol>

<ol><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li>
<li>Kular, J. K., Basu, S., Sharma, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix%3A+Structure%2C+composition%2C+age-related+differences%2C+tools+for+analysis+and+applications+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix: Structure, composition, age-related differences, tools for analysis and applications for tissue engineering.</a> Journal of Tissue Engineering. 5, (2014).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li>
<li>Erdogan, B., Webb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts+modulate+growth+factor+signaling+and+extracellular+matrix+remodeling+to+regulate+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts modulate growth factor signaling and extracellular matrix remodeling to regulate tumor metastasis.</a> Biochemical Society Transactions. 45 (1), 229-236 (2017).</li>
<li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-kB-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kB-Dependent Manner.</a> Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).</li>
<li>Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colon+Cancer-associated+Fibroblast+Establishment+and+Culture+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Colon Cancer-associated Fibroblast Establishment and Culture Growth.</a> Bio-protocol. 6 (7), e1773(2016).</li>
<li>Herrera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+activation+on+3D-matrices+derived+from+PDGF-BB-stimulated+fibroblasts+is+mediated+by+Snail1%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell activation on 3D-matrices derived from PDGF-BB-stimulated fibroblasts is mediated by Snail1.</a> Oncogenesis. 7 (9), 76(2018).</li>
<li>MacColl, E., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Metalloproteinases+as+Regulators+of+Vein+Structure+and+Function%3A+Implications+in+Chronic+Venous+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Matrix Metalloproteinases as Regulators of Vein Structure and Function: Implications in Chronic Venous Disease.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 410-428 (2015).</li>
<li>Shian, S. G., Kao, Y. R., Wu, F. Y. H., Wu, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Invasion+and+Angiogenesis+by+Zinc-Chelating+Agent+Disulfiram%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Invasion and Angiogenesis by Zinc-Chelating Agent Disulfiram.</a> Molecular Pharmacology. 64 (5), 1076-1084 (2003).</li>
<li>Neri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+invasion+driven+by+extracellular+matrix+remodeling+is+dependent+on+the+properties+of+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer cell invasion driven by extracellular matrix remodeling is dependent on the properties of cancer-associated fibroblasts.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 142 (2), 437-446 (2016).</li>
<li>Du, P., Subbiah, R., Park, J. H., Park, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+morphogenesis+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+on+cell-derived+macromolecular+matrix+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Vascular morphogenesis of human umbilical vein endothelial cells on cell-derived macromolecular matrix microenvironment.</a> Tissue Engineering. (Part A), (2014).</li>
<li>Bignon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysyl+oxidase-like+protein+2+regulates+sprouting+angiogenesis+and+type+IV+collagen+assembly+in+the+endothelial+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lysyl oxidase-like protein 2 regulates sprouting angiogenesis and type IV collagen assembly in the endothelial basement membrane.</a> Blood. 118 (14), 3979-3989 (2011).</li>
<li>Huang, L., Xu, A. M., Liu, S., Liu, W., Li, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts+in+digestive+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts in digestive tumors.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (47), 17804-17818 (2014).</li>
<li>Herrera, A., Herrera, M., Peña, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+Snail1+in+the+tumor+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">The emerging role of Snail1 in the tumor stroma.</a> Clinical and Translational Oncology. 18 (9), 872-877 (2016).</li>
<li>Sheng, Y., Fei, D., Leiiei, G., Xiaosong, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Matrix+Scaffolds+for+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Extracellular Matrix Scaffolds for Tissue Engineering and Regenerative Medicine.</a> Current Stem Cell Research & Therapy. 12 (3), 233-246 (2017).</li>
<li>Castelló-Cros, R., Cukierman, E. Stromagenesis during tumorigenesis: characterization of tumor-associated fibroblasts and stroma-derived 3D matrices. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCastell%C3%B3-Cros%2C+R+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 522, 275-305 (2009).</li>
</ol>

著者らは利益相反を宣言しない。

マトリックスは、不死化線維芽細胞または原発性線維芽細胞培養物で生成することができる。線維芽細胞は、高い成長速度とストレス耐性を有するインビトロ培養で維持することが容易です。それらは死後の組織3から単離することもできるが、汚染は組織の起源に応じて制限される可能性がある。
ここでの3Dマトリックスモデルは、ECM組成と繊維配向を正常に研究するための新しい効果的なシステムを提供しています。また、線維芽細胞活性化状態、遺伝子/タンパク質発現、他の細胞型との相互作用などの分析にも適しています。患者から線維芽細胞で生成されたマトリックスは、腫瘍における間質関連メカニズムのパーソナライズされた研究を可能にすることを強調することが重要です。例えば、このアプローチは、ECMが重要な役割を果たす化学抵抗性の研究に適用することができる。このタイプの研究の翻訳は、臨床現場での患者の治療のための意思決定に役立ち、パーソナライズされた医療を実施する可能性があります。
3D マトリックス プロトコルは面倒です...

細胞外マトリックス(ECM)は、あらゆる種類の組織に存在する動的構造である。これは、細胞接着、移行、および通信1に不可欠な繊維のネットを作成するタンパク質と多糖で構成されています。ECM組成物は、組織によって異なる。I型コラーゲンは最も一般的な構造タンパク質であるが、コラーゲンタイプII、III、V及びXIは種々の組織2にも見られる。線維芽細胞によって生成されるフィブロネクチンは、細胞接着2に必要である。さらに、エラスチン、ラミニンおよび表面受容体のような他の構造分子は、繊維アセンブリを媒介し、異なるECM組織2に特異的であるインテグリンと呼ばれる。ECMは細胞足場として重要な役割を果たし、生理学的および病理学的プロセス1の両方に関与することもできる。ECMの異常は、ECM組成およびその組織を変化させる癌などの病態で観察される。腫瘍において、ECMは、腫瘍微小環境(TME)の非細胞成分、線維芽細胞、免疫細胞、内皮細胞、ペリサイトおよび様々な可溶性因子などの細胞成分の複合体ミリューを表す。TMEは癌の進行および転移を促進することが知られている;癌関連線維芽細胞は、腫瘍間質における主要な細胞型として、このプロセス3に参加する。正常な線維芽細胞とは異なり、CAFは永久的な活性化において、ECMタンパク質および成長因子の分泌の増加を示す(例えば、増殖因子β、TGF-βの形質転換)、ならびにα平滑筋アクチン(α-SMA)および線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)4のようないくつかのマーカーのより高い発現を示す。しかし、CFは異種細胞集団であり、異なるレベルの活性化またはマーカー発現5を示す。その後、線維芽細胞由来行列の組成および構造は、線維芽細胞の状態および特性に依存すると仮定することができる。
この文脈において、この方法論の目的は、in vivo ECM設定と同等の線維芽細胞によるECM生成のための適切なインビトロモデルを確立することである。このアプローチは、ECMが媒介する化学抵抗や遊走などの腫瘍細胞機能のさらなる研究のためのインビトロ翻訳方法論として提案する。我々のグループが他の場所で発表したように、CFは新鮮な組織サンプルから得ることができるが、培養中のCAFの生存率は限られており、その細胞通過数は6を減少させられることに留意しなければならない。さらに、患者のサンプルから確立されたCAF一次培養物はマトリックス生成に使用することができる。線維芽細胞における遺伝子発現の操作は、マトリックス組成、繊維配向などに対する可能な影響を評価するために、様々なインビトロ行列を生成する興味深い方法でもあります。これらの線に沿って、我々のグループは最近、様々な導出行列7の組成および繊維配向におけるカタツムリ発現線維芽細胞の役割を報告した。
さらに、CFおよびECMは血管系に関与しており、血管生成および花瓶外層8の一部としてである。ECMリモデリングは血管新生を誘発する;マトリックスメタロプロテイナーゼ(MmP)は、このプロセス9、10に寄与する最も重要な酵素タイプであると思われる。ECMを生成する一次細胞の組織血管形成には、ECM高分子、ECMに含まれる残留成長因子、マトリックス弾性、およびマトリックス厚さが内皮細胞活性化に関与する因子として記載されている。腫瘍において、低酸素症はECM剛性および内皮芽世代12を増加させる。また、CAFは、腫瘍間質13における血管新生を刺激する血管内皮増殖因子(VEGF)および血小板由来増殖因子(PDGF)を分泌する。この分野では、in vitroマトリックス生成を使用して、異なる実験条件下で血管新生プロセスまたはMMP作用を研究することができる。したがって、生体内マトリックスの最も類似したインビトロ再生は、血管新生またはマイクロ環境細胞相互作用におけるECMの役割を調査するための貴重なツールであり得る。
アスコルビン酸を用いた培養線維芽細胞の刺激は、マトリックス沈着を増強し、ECMを生成し、生体内行列で類似の生成方法として受け入れられている。不死化線維芽細胞株は容易に培養され、PDGF-BB、腫瘍壊死因子α(TNF-α)またはTGF-β14のような多様な増殖因子によって活性化される。TME内では、CAFはECM4の主要成分としてタイプIコラーゲンとフィブロネクチンを合成する。同様に、これらの成分は、インビトロ生成線維芽細胞由来行列の主要成分として見られる(図1)。
生体内ECMをシミュレートするインビトロ方法論は異なります。ECM繊維の混合物を用いたコーティング培養皿の使用は過去数年間に拡張されたが、この2Dアプローチは架橋ゲル(例えば、マトリゲル)1のような3D構造の改善を必要とする。Matrigel のようなセットアップは、3D マトリックスをシミュレートするための標準的な方法となっています。フィブリンはまた、行列を生成する際の代替手段であるが、ECM1の強度と耐久性の点で失敗します.他のECM成分と組み合わせて使用されるコラーゲンは、上記の問題のいくつかを修正します。しかしながら、これらのコラーゲンゲルは、配向できる繊維を有する強いネットワークを形成するが、非常に異種であり、実験の繰り返し1において問題となり得る。それにもかかわらず、実験の目的に応じて、マトリゲルまたは他のヒドロゲルの使用がより適切であると仮定しなければならない(例えば、ゲル収縮を容易に検出できるマトリックス収縮研究において)。
生成されたマトリックスの潜在的な免疫原性は、いくつかの細胞タイプの実験における問題である可能性があります。従って、我々の方法を用いた場合にECM発生細胞による免疫応答の可能性を低減するために、マトリックスは脱細胞化され洗浄されるが、細胞断片除去は合計15でなかった。理想的なECMは、細胞培養と互換性があり、細胞信号と通信して反応できる必要があります。私たちの手順は、ECM生産中に難なく変化の導入を可能にします(例えば、線維芽細胞刺激成長因子を追加)。

<table><tbody><tr><td>水酸化アンモニウム (NH4OH)</td><td>Roth</td><td>A990.1</td><td></td></tr><tr><td>アンホテリシン-B</td><td>コーニング</td><td>30-003-CF</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Σ</td><td>A7906-50G</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ修正イーグル培地 (DMEM)</td><td>コーニング</td><td>10-014-CVR</td><td></td></tr><tr><td>内皮基礎培地 (EBM)</td><td>ロンザ</td><td>CC-3121</td><td>使用前にサプリメントを追加</td></tr><tr><td>してください 内皮細胞基礎培地サプリメント(EGM-2)</td><td>ロンザ</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>エタノールアミン</td><td>シグマ</td><td>411000-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Biowest</td><td>S181B-500</td><td>使用前に熱不活性化</td></tr><tr><td>線維芽細胞成長基礎培地 (FBM)</td><td>ロンザ</td><td>CC-3131</td><td>使用</td></tr><tr><td>前にサプリメントを追加してください線維芽細胞増殖培地サプリメントと成長因子(FGM-2)</td><td>ロンザ</td><td>CC-4126</td><td></td></tr>ウ<tr><td>シ皮膚からのゼラチン</td><td>シグマ</td><td>G9391-100G</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>シグマ</td><td>g5882L</td><td></td></tr><tr><td>-アスコルビン酸</td><td>シグマ</td><td>A92902-100G</td><td>感光性</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td>ロン<td>ザ</td><td>BE17-605E</td><td></td></tr><tr><td>ノルモシン</td><td>Invivogen</td><td>3ANT-NR-2</td><td></td></tr><tr><td>ペンシル/ストレプトマイシン (ペン/連鎖球菌</td>)<td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Roth</td><td>3051</td><td></td></tr><tr><td>組換えテロメラーゼトランスフェクト不死化ヒト包皮線維芽細胞 (BJ-hTERT)</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-4001</td><td></td></tr><tr><td>ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-013</td><td></td></tr></tbody></table>

内皮管形成アッセイに適用可能な線維芽細胞由来3dマトリックスシステム

Fibroblast-Derived 3D Matrix System Applicable to Endothelial Tube Formation Assay

細胞外マトリックス(ECM)は、組織の細胞の主な支持体として機能する3次元足場である。その構造的機能に加えて、ECMはまた、細胞の遊走、増殖、および分化に関与する。線維芽細胞は、ECM繊維の配置と生産を修飾する細胞の主なタイプです。癌において、CAF(癌関連線維芽細胞)は永久的な活性化状態にあり、ECMリモデリングに参加し、腫瘍細胞の移行を促進し、腫瘍関連血管新生を刺激し、他のプロ腫瘍形成の役割の間で。この方法の目的は、不死化線維芽細胞またはヒト一次CAFを使用して、生体内行列に類似した繊維組成を有する3次元マトリックスを作成することです。線維芽細胞は、前処理された細胞培養プレートで培養され、アスコルビン酸刺激下で成長する。次いで、線維芽細胞を除去し、マトリックスをさらに細胞播種のためにブロックする。このECMモデルでは、線維芽細胞を活性化または改変して、細胞培養で効果を研究できる異なる種類のマトリックスを生成することができます。3Dマトリックスは、繊維分布を変更する可能性のある分解酵素や架橋酵素などの細胞シグナルによっても形成されます。この文脈において、血管新生は、上皮腫瘍細胞などの他の細胞型と共に研究することができる。

PDGF-BB刺激線維芽細胞は、より厚いECMを作成します。エレーラらは、PDGF刺激線維芽細胞が、より厚いマトリックスおよびより高い繊維配向7を生成する方法を示した。BJ-hTERT線維芽細胞をPDGFの有無にかかわらずインキュベートし、観察された代表的な領域は、PDGF刺激線維芽細胞によって産生されるマトリックス中のより整列した細胞分布を示した(図1a)。コラーゲンIおよびフィブロネクチンタンパク質発現は、PDGF刺激線維芽細胞に由来するマトリックスにおいて増加し(図1b)、その結果、マトリックス厚さが増加した(図1c)。また、コラーゲンIおよびフィブロネクチンは、方向性ヒストグラムに示すように平行パターンを示す(<strong class="...

この方法の目的は、その後の細胞アッセイのための天然足場として線維芽細胞由来の3D行列を得る。線維芽細胞は、前処理された培養プレートに播種され、マトリックス生成のためにアスコルビン酸で刺激される。マトリックスは、脱細胞化され、関連する細胞(例えば、内皮細胞)を培養するために遮断される。

内皮管形成アッセイに適用可能な線維芽細胞由来3Dマトリックスシステム

The extracellular matrix (ECM) is a three-dimensional scaffold that acts as the main support for cells in tissues. Besides its structural function, the ...

このプロトコルは、異なるタイプの培養物を見て、細胞外マトリックスとの相互作用を観察することを可能にする。この方法の主な利点は、あなたが得るマトリックスが線維芽細胞によって再生され、それは生体内で生成されるものと非常によく似ているということです。私たちは、この病気は、ベーキング皿から得る線維芽細胞を使用する場合には無関係になると考えています。これらの細胞から行列を確立することは、それがどのように影響するかを私たちに啓発することができます, 例えば, 永続的な状況.これらの方法は、例えば、マトリックスの妥当性から生存者に物理的研究に適用することができます。このプロトコルの視覚化では、摂起する必要があるステップのピペッティング技術を観察することが重要です。これらのメソッドを初めて試すとき、おそらく予想以上に時間がかかります。私たちのアドバイスは、あなたが事前にできる限り準備し、次のステップの準備のために期間を使用する方法です。原稿の指示に従って0.2%ゼラチン、1%グルタルアルデヒドおよび1モルエタノールアミン溶液を調製することから始めます。使用前に0.22マイクロメートルのフィルターを通して各溶液を実行することを確認してください。次に、アスコルビン酸およびリシスバッファーを調製する。原稿に記載されているようにPBSペンストレップを希釈し、10%FBSでDMEMを調製します。100ミリリットルの無菌水に2グラムのBSAを加え、沸騰した水浴で7分間温めることで、熱変性した2%BSAを準備します。次に、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、アンホテリシンB.Culture組換えテロメアを10%FBSでヒト包皮線維芽細胞とDMEMをトランスフェクトし、37°Cと5%の二酸化炭素でFBSを補った。一次線維芽細胞培養を確立するには、組織サンプルを約2〜3ミリリットルの小片に切り、高濃度の抗生物質でFPSに播種する。最初の線維芽細胞が現れたら、細胞維持のために培地をFBM培地に交換してください。6ウェルプレートの各ウェルに0.2%ゼラチン溶液の2ミリリットルを加え、摂氏37度または摂氏4度で一晩1時間インキュベートします。インキュベーション後、ゼラチンを吸引し、2ミリリットルのPBSでそれぞれをよく洗います。各ウェルに1%のグルタルアルデヒドを2ミリリットル加え、ゼラチンを架橋する30分間室温でプレートをインキュベートします。グルタルアルデヒドを吸引し、2ミリリットルのPBSで井戸を5分間洗浄します。残りのグルタルアルデヒドをブロックするには、1つのモルエタノールアミンを2ミリリットル加え、室温でプレートを30分間インキュベートします。エタノールアミンを吸引し、PBSでの使用を繰り返します。10%FPSでDMEMを1ミリリットル加えます。メディアがすぐにピンク色に変わったら、それを取り除き、PBSの2ミリリットルで井戸を1回洗い、DMEMの別のミリリットルを追加します。5 x 10で線維芽細胞懸濁液の1ミリリットルを各ウェルの5番目の細胞に播種し、100%合流するまで細胞を培養する。その後、培地を取り出し、10%FBSと1ミリリットルアスコルビン酸あたり50マイクログラムでDMEMに置き換えます。2日ごとに6日間培地を交換してください。最後のアスコルビン酸処理の2日後に培地を取り除き、2ミリリットルのPBSで井戸を洗います。洗剤の後、予熱した溶液バッファーを1ミリリットルゆっくりと加え、繊維芽細胞が溶けるまで5〜10分間室温でプレートをインキュベートする。溶液バッファーを取り除かずに、慎重に各ウェルにPBSの2ミリリットルを追加し、約2.5ミリリットルを吸引します。このプロセスを 2 回繰り返して、合計 3 回の操作を行います。最後の洗浄の後、ペンストレップでPBSを2ミリリットル加えます。フィルムでプレートを密封し、最大3ヶ月間摂氏4度に保ちます。HUVEC細胞とEMB-2を最大合流まで2%FBSで成長させます。その後、8時間FBSなしでEBM-2で媒体を交換してください。細胞の播種用のマトリックスを準備するには、冷蔵庫から取り出し、室温で1時間放置します。熱変性2%BSAの2ミリリットルを加えてマトリックスをブロックし、摂氏37度で1時間インキュベートします。その後、BSAを吸引し、2ミリリットルのPBSで洗浄します。第5種HUVEC細胞に第5種10を線維芽細胞由来マトリックスで被覆したプレートの各ウェルに。37°Cで細胞を16時間インキュベートし、20〜40倍の倍率で標準的な明視野顕微鏡でチューブ状の構造を調べます。このプロトコルは、線維芽細胞由来マトリックス形成に対するPDGF治療の影響を調べるために使用された。PDGFと共にインキュベートされたBGH第3の線維芽細胞は、PDGFなしでインキュベートされたものよりもマトリックス中でより整列した細胞分布を示した。コラーゲン1およびフィブロネクチンタンパク質発現は、PDGF刺激線維芽細胞由来のマトリックスにおいて増加し、その結果、マトリックス厚さが増加した。また、指向性ヒストグラムは、コラーゲン1とフィブロネクチンが平行パターンを示すことを示す。HUVEC細胞をPDGF刺激線維芽細胞由来の脱細胞化マトリックスに播種すると、刺激を受けた状態よりも毛細血管様構造が発達した。PDGF-BB刺激線維芽細胞に由来するマトリックスが内皮細胞活性化を促進することを確認する。この手順を実行する場合は、事前にソリューションを準備し、開始する前にセルの準備ができていることを確認することが重要です。内皮細胞の研究のほかに、マトリックスは上皮細胞で播種することができ、また、メディアや細胞傷害性薬物の状態などの外部要因への反応を観察することができます。腫瘍マクロ環境実験の設計において細胞外マトリックスの生成は極めて重要である。

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原発性前立腺細胞の分化のための迅速なフィルターを挿入ベースの3D培養システム

学ぶ線維芽細胞由来3Dマトリックスの作製法。アスコルビン酸刺激によりin vivoに近い細胞外基質を生成し、脱細胞化後に内皮細胞を培養して管形成を観察できます。細胞-基質相互作用の研究に有用です。

内皮管形成アッセイに適用可能な線維芽細胞由来3Dマトリックスシステム

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