Biology
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Isolamento e cultura degli adipociti maturi umani utilizzando le colture aggregate adipocite mature membrana (MAAC)
Chapters
Summary February 13th, 2020
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La coltura aggregata adipocite matura membrana (MAAC) è un nuovo metodo per coltivare adipociti umani maturi. Qui dettagliamo come isolare gli adipociti dall'adiposo umano e come impostare il MAAC.
Transcript
Una sfida nel campo della biologia adiposa è stata quella di mantenere l'adipocite maturo nella cultura. Abbiamo sviluppato un nuovo metodo che consente lo studio dell'adipocite a lungo termine attraverso grandi cambiamenti. La nostra tecnica di coltura dell'adipocite consente lo studio delle interazioni cellulari e si spera sia utile per lo sviluppo di nuovi trattamenti per il diabete e l'obesità.
È importante seguire attentamente il protocollo in quanto ci sono alcuni passaggi critici che hanno un grande impatto sulla qualità genica e sulla vitalità degli adipociti maturi. Ad esempio, prima della placcatura assicurarsi che tutti i lipidi liberi e il tampone di lavaggio siano stati rimossi altrimenti i lipociti potrebbero strapparsi quando gli inserti vengono invertiti. Dopo aver ricevuto il campione umano di tessuto adiposo sottocutaneo, posizionare il tessuto in un armadietto di sicurezza biologico sterile in una piastra di Petri di 15 centimetri.
Un piccolo volume di medio 199 al piatto. Utilizzare una pinzetta per afferrare grandi vasi fibrotici all'interno del tessuto e utilizzare il retro della punta di un paio chiuso di forbici per rottamare delicatamente l'adiposo lungo il vaso per rilasciare gli adipociti. Quando tutte le cellule sono state raccolte scartare i grandi pezzi di tessuto fibrotico e pesare il grasso tagliato.
Per rilasciare ulteriormente le cellule dal tessuto adiposo, trasferire 10 grammi di tessuto adiposo in una nuova piastra di Petri di 15 centimetri e utilizzare forbici curve per tritare accuratamente il grasso fino a diventare una miscela omogenea liscia senza grandi pezzi di adiposo. Quando tutto il grasso è stato lavorato, utilizzare un cucchiaio per trasferire 10 millilitri di tessuto tritato in singoli tubi da 50 millilitri e aggiungere 30 millilitri di tampone di digestione a ciascun tubo. Quindi posizionare i tubi in un incubatore di scuotimento a 37 gradi Celsius e 150 rotazioni al minuto per 30-35 minuti.
La digestione è completa quando la soluzione adiposa è omogenea, color albicocca e assente da pezzi di grandi dimensioni. Alla fine della digestione, decantare la soluzione di grasso digerita in un filtro a rete da 250 micrometri all'interno di un imbuto impostato in un pallone sterile da un litro. Quando l'intero volume delle sospensioni adipocite è stato eluso, spremere delicatamente il filtro a rete per aumentare la resa degli adipociti e lavare il filtro con da 50 a 100 millilitri di tampone di lavaggio prima di spremere nuovamente il filtro.
Trasferire la soluzione di adipocite isolata in un imbuto di separazione e aggiungere il tampone di lavaggio fino a quando l'imbuto non è quasi completamente riempito. Invertire delicatamente l'imbuto alcune volte per mescolare la sospensione adipocite con il tampone e lasciare riposare la sospensione per due o tre minuti fino a quando non vi è una netta separazione degli strati. Quando gli strati si sono separati, aprire l'ugello sull'imbuto ed eluire lentamente la soluzione inferiore in un pallone sterile.
Una volta rimossa tutta la collagenasi, raccogliere la soluzione di adipocite matura purificata in tubi conici da 50 millilitri e imballare leggermente le cellule mediante centrifugazione. Quindi, utilizzare una siringa da 10 millilitri dotata di un ago calibro 18 per rimuovere il tampone di lavaggio rimanente sotto la sospensione dell'adipocite e utilizzare una pipetta per rimuovere lo strato lipidico libero che galleggia sopra gli adipociti maturi. Per la semina degli adipociti maturi, posizionare il componente inserto a membrana permeabile capovolto su una superficie sterile e invertire delicatamente i tubi degli adipociti imballati alcune volte per garantire una distribuzione uniforme delle cellule.
Utilizzando una punta di pipetta ad ampio foro, aggiungere 30 microlitri di adipociti maturi imballati su ogni membrana. Invertire il pannello di inserimento in un movimento uniforme in modo che gli adipociti seminati si trovano nella parte inferiore degli inserti. Posizionare il pannello di inserti in una piastra da 24 porri contenente da 500 a 1.000 microlitri di mezzo completo di 37 gradi Celsius per pozzo.
Quindi, coprire il piatto e posizionare con cura il piatto in un incubatore di coltura tissutale. Ogni sette giorni di coltura, sostituire il mezzo tramite il foro di ritaglio in ogni inserto. Dopo una settimana di coltura, gli aggregati di adipociti maturi isolati dal tessuto adiposo sottocutaneo mantengono la caratteristica morfologia delle goccioline lipidiche unilocolari osservata solo negli adipociti maturi.
Il trattamento con gli agonisti PPAR-GAMMA pioglitazone e rosiglitazone si traduce in una maggiore espressione nei geni reattivi PPAR-GAMMA, mentre il trattamento con il dexametasone agonista del recettore glucocorticoide non ha alcun effetto su questi geni. Allo stesso modo, l'agonista del recettore glucocorticoide guida robustamente l'espressione genica dei geni bersaglio del recettore glucocorticoide, mentre gli agonisti PPAR-GAMMA non hanno effetti significativi su questi geni. Inoltre, il trattamento di sette giorni con gli agonisti PPAR-GAMMA induce robustamente l'espressione genica del gene specifico del grasso bruno, UCP1.
Il nostro nuovo modello adipocite in vitro può essere utilizzato per gli studi funzionali in adipociti maturi, tra cui assorbimento di glucosio, lipogenesi e lialisi. Con questa nuova tecnica di cultura degli adipociti siamo stati in grado di dimostrare che gli adipociti bianchi maturi umani possono trasferenziarsi in adipociti marroni.
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