Name: Mesure quantitative des protéines synthétisées intrathéquement chez les souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Découvrez une méthode optimisée pour collecter le liquide céphalo-rachidien et le sang chez la souris, permettant de quantifier la synthèse intrathécale des protéines et d'évaluer l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique.

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Les auteurs remercient le personnel du Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) de Dartmouth pour les soins qu'ils ont soignés aux souris utilisées pour ces études. Le Fonds de recherche De Bornstein a financé cette recherche.

Tous les travaux sur les animaux utilisent des protocoles examinés et approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de la Geisel School of Medicine de Dartmouth.
1. Collection de fluides
REMARQUE : Le sérum et le CSF sont exigés. Deux protocoles pour chaque collecte de fluides sont nécessaires pour la survie et l'autopsie.
<ol><li>Collecte de sérum et de CSF en utilisant des procédures de survie REMARQUE : Pour la collecte de fluide de survie, la collecte de sérum devrait précéder la collection de CSF car c'est une procédure moins envahissante. CSF doit être obtenu dans la semaine suivant le tirage du sérum.<ol><li>Procédure de saignement rétro-orbital e pour la collecte de sérum. REMARQUE: Cette procédure est pour le saignement de survie des souris14. La procédure décrite s'applique à n'importe quel âge, sexe et souche de souris. Étant donné que les règles de l'IACUC stipulent qu'un volume sanguin maximal de 1 % du poids corporel peut être enlevé en tant qu'un seul prélèvement sanguin, il est recommandé que la procédure ne soit effectuée que sur des souris pesant plus de 15 g.<ol>
<li>Déplacez les cages contenant des souris de la grille à une zone de travail appropriée. Préparer la machine à gaz d'anesthésie en allumant le compteur d'oxygène à 1 L/min.</li>
			<li>Placer l'animal dans la chambre d'induction et fermer le couvercle hermétiquement. Allumez le vaporisateur d'isoflurane à 3,5 % et surveillez l'animal jusqu'à ce qu'il soit couché.</li>
			<li>Retirez l'animal de la chambre et évaluez le niveau d'anesthésie par réflexe de pédale, c'est-à-d., pincement ferme de pied. Assurer une profondeur adéquate de l'anesthésie avant d'effectuer la procédure: l'absence de réponse à une pincée ferme indique une anesthésie adéquate.</li>
			<li>Retenez la souris anesthésiée en saisissant la peau lâche derrière les oreilles avec le pouce et l'index de la main non dominante. Enbulge les yeux en utilisant l'index pour dessiner la peau au-dessus de l'œil et le pouce pour dessiner la peau sous les yeux.</li>
			<li>Placez la pointe d'une pipette Pasteur dans la douille de l'œil sous le globe oculaire(figure 1, panneau gauche), en dirigeant la pointe à environ 45 degrés vers le milieu de la prise oculaire(figure 1, panneau droit). Faites pivoter la pipette entre les doigts pendant le passage vers l'avant. Appliquer une pression douce, puis libérer jusqu'à ce que le sang pénètre dans la pipette. REMARQUE : La quantité maximale de sang qui peut être retirée à un moment donné de cet endroit est d'environ 1% du poids corporel, par exemple, 0,2 ml d'une souris de 20 g.</li>
			<li>Retirez délicatement le capillaire pour éviter les blessures à l'œil et placez le sang recueilli dans un tube centrifugeur de 1,5 ml. Fermez la paupière et appliquez une légère pression avec de la gaze pour éviter d'autres saignements. Une fois complètement alerte et mobile (généralement de 3 à 5 min), retournez la souris dans sa cage de retenue.</li>
			<li>Laisser le sang coaguler de 30 à 60 min à température ambiante (RT), puis centrifuger le sang pendant 10 min à 2 000 x g dans une centrifugeuse réfrigérée de 4 oC. À l'aide d'une technique de pipette propre, recueillir le sérum dans un nouveau flacon de 0,5 ml étiqueté. Congeler immédiatement la fiole de sérum à -80 oC.</li>
		</ol></li>
		<li>Collecte de CSF avec procédure de survie REMARQUE: Cette procédure est pour la chirurgie de survie, et il est basé sur le protocole publié par Liu et Duff en 200815. Les souris sont anesthésiés par un cocktail de kétamine (20 mg/mL), de xylazine (0,5 mg/mL) et d'acépromazine (0,5 mg/mL) administré par voie intrapéritone.<ol><li>Déplacez les cages contenant des souris du rack vers une zone de travail de chirurgie désignée. Préparer l'espace chirurgical dans un environnement stérile. Assurez-vous que tous les instruments et matériaux utilisés sont stérilisés avant la chirurgie.</li>
			<li>Peser la souris et calculer le volume d'anesthésie nécessaire (0,1 ml de cocktail d'anesthésie pour une souris de 20 g). Injecter l'anesthésie intrapéritone116. Après quelques minutes, testez la souris en pinçant le pavé pour assurer une anesthésie adéquate. Si plus d'anesthésique est nécessaire, injectez davantage 0,01 à 0,03 ml du cocktail anesthésique.</li>
			<li>Utilisez des ciseaux ou un rasage pour raser une petite zone de la tête, à l'extrémité caudale, médiale sur le crâne, pour exposer une zone de travail assez grande pour la collecte CSF. Placez la souris en position couchée sur l'instrument stéréotaxique, et stabilisez la tête en utilisant des barres d'oreille (Figure 2A). REMARQUE : La souris est posée de façon à ce que la tête forme un angle de près de 135 degrés avec le corps (Figure 2A). Une fois que l'animal est placé, un drapé chirurgical est employé pour maintenir un champ stérile au site chirurgical. Les rideaux adhésifs clairs sont préférés pour la collecte de CSF chez les souris, car ils permettent la visualisation directe et plus ciblée de l'animal.</li>
			<li>Swab le site chirurgical avec 30% de chlorhexidine diacétate. À l'aide d'un scalpel stérile, faire une incision sagittale de la peau inférieure à l'occiput pour exposer les muscles qui recèlent la cisterna magna.</li>
			<li>Par dissection émoussée avec des forceps, séparer le tissu sous-cutané et les muscles pour exposer la cisterna magna (Figure 2B). Utilisez des microrétracteurs pour maintenir les muscles à part (Figure 2B) et exposer la couche méningée dura mater sur la cisterna magna.</li>
			<li>Laver délicatement avec de la saline stérile tamponnée par le phosphate (PBS) pour éliminer toute contamination sanguine possible. Blot sécher le dura mater avec un coton-tige stérile et perforer doucement la membrane couvrant la cisterna magna avec une aiguille de 30 G. Insérez rapidement et doucement un petit tube capillaire en verre pour recueillir cSF (Figure 2C). REMARQUE : La pression intracrânienne permet à CSF de s'écouler spontanément dans le capillaire(figure 2C). Selon l'âge et la taille de la souris, environ 5 à 12 L de CSF sont obtenus à partir de chaque souris.</li>
			<li>Retirez soigneusement le tube capillaire de la membrane. Connectez le tube à une seringue de 3 ml à travers un tube en polyéthylène(tableau des matériaux)et injectez le CSF collecté dans un tube étiqueté de 0,5 ml (Figure 2D). Gardez les flacons dans la glace.</li>
			<li>Fermer l'incision en utilisant la suture de polydioxanone (PDS) avec l'aiguille jetable et en utilisant des sutures enterrées17. Nettoyez la zone de tout sang ou tissu séché.</li>
			<li>Injecter des souris, sous-cutanéeouillement ou intrapéritonement16, avec 0,05 à 0,1 mg/kg d'hydrochlorure de buprénorphine comme traitement analgésique. En outre, injecter sous-cutanée1 ml de saline stérile pour prévenir la déshydratation.</li>
			<li>Placez la souris dans une cage propre et chaude pour la récupération. Une fois que la souris est mobile et capable d'atteindre la nourriture et l'eau, placez la cage de nouveau sur le support.</li>
			<li>Centrifugeuse CSF pendant 10 min à 1 000 x g dans une centrifugeuse réfrigérée de 4 oC. Vérifier le degré de contamination sanguine par inspection visuelle pour l'identification de la xanthochromie et la présence d'une pastille rouge dans le fond du tube. Jetez les échantillons contaminés par le sang. REMARQUE : La formule utilisée pour la correction des quantités de protéines cSF dans les échantillons contaminés par le sang est basée sur des paramètres d'équation qui incluent la teneur en protéines dans le CSF et le sérum, l'hématocrit (HCT), et les globules rouges (RBC) comptent dans cSF et sang18. Cependant, une telle stratégie de correction ne peut pas être facilement appliquée aux spécimens de CSF de souris en raison du petit volume, limitant ainsi la stratégie de correction à une inspection visuelle.</li>
			<li>À l'aide d'une technique de pipette propre, collectez le CSF dans un nouveau tube de 0,2 ml, laissant derrière lui le granule avec des cellules. Diluer CSF 1:3 avec PBS pour réduire la perte de volume due à l'aérosol. Congeler immédiatement le flacon de CSF à -80 oC.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Collecte de sérum et de FSC selon des procédures de non-survie REMARQUE : Pour la collecte de fluides non-survie, la collecte de CSF précède la collecte de sérum car la souris a besoin d'avoir une impulsion.<ol>
<li>Collection CSF chez necropsy REMARQUE : Cette procédure est pour la chirurgie de non-survie, et approximativement 10-20 l de CSF est obtenue de chaque souris. Un champ chirurgical stérile est recommandé, mais pas nécessaire pour la chirurgie de non-survie.<ol>
<li>Déplacez les cages contenant des souris de la grille à un espace de travail confortable. Suivez les étapes 1.1.2-1.1.2.7 et 1.1.2.11-1.1.2.12 pour la collecte CSF. Passez à la section 1.2.2 pour la collecte du sérum.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Collecte de sang par perforation intracardiaque (approche ouverte) REMARQUE : Les volumes de sang attendus sont d'environ 3 % du poids corporel, par exemple, 0,6 ml à partir d'une souris de 20 g.<ol>
<li>Après la collecte CSF assurez-vous que la souris est encore suffisamment anesthésié en pinçant le pavé. Si une réaction est observée, administrer une deuxième dose d'anesthésique. Si aucune réaction n'est observée, procédez.</li>
			<li>Placez l'animal sur le dos et écouvillonnez la peau sur l'abdomen avec 70% d'alcool. À l'aide de ciseaux chirurgicaux, ouvrez la cavité thoracique et exposez le cœur. Insérer une aiguille de 25 G (attachée à une seringue de 3 ml) dans le ventricule gauche et appliquer délicatement une pression négative sur le piston à seringues. Retirez l'aiguille après la collecte de sang.</li>
			<li>Effectuez une méthode secondaire d'euthanasie comme la décapitation ou la luxation cervicale pour s'assurer que l'animal est décédé.</li>
			<li>Poussez le piston de la seringue vers le bas et injectez le sang recueilli dans un flacon de 1,5 ml. Laisser le sang clotpendant de 30 à 60 min à RT, puis le centrifuger pendant 10 min à 2 000 x g dans une centrifugeuse réfrigérée de 4 oC.</li>
			<li>En utilisant la technique de pipette propre, recueillir le sérum dans un nouveau flacon de 0,5 ml étiqueté. Congeler immédiatement la fiole de sérum à un congélateur de -80 oC.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Analyse des protéines
<ol><li>Utilisez une méthode préférée, par exemple, la technologie Luminex, pour quantifier les protéines cibles et l'albumine dans les échantillons de sérum et de FSC assortis. REMARQUE : Ici, un exemple est donné avec la technologie magnétique DeLuminex, mais pratiquement n'importe quelle technique qui mesure des quantités de protéine, y compris les essais immunosorbent enzymatiques (ELISAs), peut être appliquée au protocole actuel. Idéalement, les échantillons de CSF et de sérum sont exécutés pour l'albumine et les protéines cibles sur la même plate-forme. Les conditions d'essai doivent être optimisées pour les étapes cruciales du protocole telles que la concentration d'accouplement de perles d'antigène, les dilutions d'échantillons de sérum et de CSF, les courbes standard les mieux adaptées pour chaque analyte et la composition tampon pour réduire la réactivité non spécifique. Si un kit commercial est utilisé pour la mesure des protéines, par exemple, le kit d'isotypage de l'immunoglobuline (Tableau des matériaux) utilisé pour obtenir des données présentées dansFigure 3, les instructions des fabricants doivent être suivies.<ol><li>Lors de la décongélation et avant l'analyse, centrifugez les échantillons de CSF et de sérum (2 000 x g pendant 10 min) et utilisez le supernatant pour empêcher l'engorgement des plaques de filtre et/ou de la sonde. Suivez la procédure d'assiduie fournie avec le kit pour les dilutions appropriées de l'échantillon. Sinon, déterminez la dilution appropriée pour chaque analyte et fluide. Diluer les échantillons dans PBS en conséquence. REMARQUE : S'il n'y a pas de directives ou d'instructions spécifiques, des dilutions pour chaque analyte et liquide doivent être établies avant le test d'étude, en déterminant les plages de dilution appropriées nécessaires pour obtenir des estimations de concentration qui se situent dans la plupart des gamme fiable d'une courbe standard. Connaître les caractéristiques de l'échantillon biologique à analyser, par exemple, les concentrations physiologiques et pathologiques dans le fluide, permet d'essayer différentes dilutions avec des échantillons de faible, moyenne, et haute teneur en analytes. Si l'étendue prévue des concentrations dans les échantillons est connue a priori, les dilutions peuvent être sélectionnées après avoir calculé combien de fois l'échantillon doit être dilué afin d'être dans la plage de courbe standard choisie. CAUTION: En calculant les facteurs de dilution, rappelez-vous que CSF a déjà été dilué 1:3.</li>
		<li>Préparer une courbe standard pour chaque protéine d'intérêt, par exemple, l'albumine et l'IgG utilisées pour générer des données dans la figure 3, en diluant en série les protéines standard de référence. Pendant la préparation des courbes standard, mélanger soigneusement chaque concentration plus élevée avant de faire la prochaine dilution. REMARQUE : Quelle que soit la méthode de quantification choisie, il est essentiel d'inclure une courbe standard chaque fois que l'analyse est effectuée pour estimer la concentration en protéines dans les échantillons. Le meilleur choix pour une norme de référence est une concentration épurée et connue de la protéine d'intérêt. Décider des dilutions spécifiques, ainsi que du nombre de points de données et de répliques utilisés pour définir la courbe standard, dépend du degré de non-linéarité dans la courbe standard.</li>
		<li>Sélectionnez les ensembles de perles magnétiques couplés à l'anticorps appropriés (Tableau des matériaux). Pour les flacons individuels de perles, sonicate chaque flacon pendant 30 s et vortex pendant 1 min. Préparer un « mélange de perles de travail » en diluant les stocks de perles à une concentration finale de 50 perles de chaque ensemble/l dans le tampon d'analyse/lavage (PBS, 1 % d'albumine de sérum bovin [BSA]). Ajouter 50 l de perles mélangées à chaque puits dans une assiette plate de 96 puits(tableau des matériaux). CAUTION: Les perles fluorescentes sont sensibles à la lumière. Par conséquent, ils doivent être protégés contre une exposition prolongée à la lumière tout au long de la procédure.</li>
		<li>Diagramme le placement des arrière-plans, des normes et des échantillons sur une feuille de travail de carte de puits.</li>
		<li>Ajoutez 50 ll de tampon d'analyse/lavage à chaque puits d'arrière-plan, et 50 l de chaque norme aux puits pour la courbe standard. Chargez 50 ml de chaque échantillon dilué dans les puits appropriés en dernier. Envelopper l'assiette de papier d'aluminium et couver d'agitation (800 tr/min) sur un shaker de plaque pendant 30 min à RT.</li>
		<li>Placez la plaque sur un aimant de poche (Table of Materials) et reposez la plaque sur l'aimant pendant 60 s pour permettre un réglage complet des perles magnétiques. Enlever le contenu du puits en décantant délicatement la plaque et en tapant sur les coussinets absorbants pour enlever le liquide résiduel.</li>
		<li>Laver la plaque en la retirant de l'aimant, en ajoutant 200 L de tampon d'assay/wash, en secouant pour 30 s, et enfin en le rattachant à l'aimant. Répéter le lavage 3x.</li>
		<li>Diluer l'anticorps de détection biotinylated, c.-à-d., anticorps étiquetés biotine élevés contre l'espèce hôte de protéine, à 4 'g/mL dans le tampon d'analyse/lavage. Ajouter 50 l l de l'anticorps de détection dilué à chaque puits. Couvrir l'assiette et couver pendant 30 min à RT sur le shaker à 800 tr/min. Placez la plaque sur l'aimant et répétez les étapes 2.1.6 et 2.1.7.</li>
		<li>Diluer la streptavidtine conjuguée à la phycoérythrine (PE) (SAPE) à 4 g/mL dans le tampon d'analyse/lavage. Ajouter 50 L de SAPE dilué à chaque puits. Couvrir l'assiette et couver pendant 30 min à RT sur le shaker à 800 tr/min. Placez la plaque sur l'aimant et répétez les étapes 2.1.6 et 2.1.7.</li>
		<li>Retirez la plaque de l'aimant et suspendez les perles dans 100 l de tampon d'assay/lavage. Lisez les puits à l'aide d'un double instrument de détection à flux laser qui permet de détecter l'ampleur de l'intensité de la fluorescence DE l'EP (FI). REMARQUE : Le signal, p. ex., FI, généré est proportionnel à la quantité d'antigène cible fixée à la surface des perles.</li>
		<li>Exporter des données brutes et créer des courbes standard en graphique signal de détection FI par rapport aux concentrations de protéines standard. Utilisez la courbe standard pour calculer la concentration de l'analyte dans les échantillons. REMARQUE : L'albumine est exprimée de préférence en g/dL, tandis que les protéines d'intérêt sont exprimées de préférence en mg/dL.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Calculs de l'indice intrathécal
<ol><li>Organisez les valeurs de concentration de protéines dans une feuille de calcul et analysez les résultats en appliquant les formules suivantes.</li>
	<li>Calculer Qalbumin: <img alt="Équation pour le quotient d’albumine, formule pour Q_albumin, relation entre le LCR et les taux d’albumine sérique." src="/files/ftp_upload/60495/60495eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> oùl'albumine CSF etl'albumine de sérum sont des concentrations d'albumine dans les spécimens assortis de sérum et de CSF, respectivement.</li>
	<li>Calculer laprotéineQ : <img alt="Équation du rapport de concentration en protéines Q_protein=(CSF_protein/Serum_protein), analyse biochimique." src="/files/ftp_upload/60495/60495eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> où lesprotéines CSF etles protéines sériques sont des concentrations de protéines cibles dans des échantillons de sérum et de FSC appariés, respectivement.</li>
	<li>Calculer l'indice protéique : <img alt="Formule de l’indice protéique, équation, Q_protein/Q_albumin, analyse biochimique." src="/files/ftp_upload/60495/60495eq3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 3">
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Les méthodes quantitatives pour l'évaluation des concentrations accrues de protéines De CSF sont des outils utiles dans la caractérisation de l'état physiologique et pathologique du SNC. Cependant, au-delà de la quantification fiable des niveaux de protéines CSF, la détection des protéines CSF nécessite une expression de résultats qui discrimine entre les fractions dérivées du sang et du SNC dans le CSF. Cependant, à ce jour, les tests de quantification des protéines couramment utilisés ne permettent pas de discriminatio...

Le liquide céphalo-rachidien (CSF), un liquide clair et incolore entourant le cerveau et la moelle épinière, détient une grande importance clinique et scientifique fondamentale. Le CSF préserve l'environnement électrolytique du système nerveux central (SNC), équilibre le statut systémique acide-base, fournit des nutriments aux cellules neuronales et gliales, fonctionne comme un système lymphatique pour le SNC, et transporte des hormones, neurotransmetteurs, cytokines et autres neuropeptides tout au long du SNC1. Ainsi, comme la composition du CSF reflète l'activité du SNC, ce fluide offre un accès précieux, bien qu'indirect, pour caractériser l'état physiologique et pathologique du SNC.
CSF a été utilisé pour diagnostiquer les conditions qui affectent le SNC depuis plus de cent ans, et pour la plupart de ce temps, il a été principalement étudié par les cliniciens comme un outil de diagnostic. Cependant, au cours des dernières années, les neurobiologistes ont reconnu le potentiel de la FSC pour l'étude de la physiopathologie du SNC. En particulier, plusieurs outils d'analyse des protéines à haut débit ont été introduits dans le domaine des neurosciences, ce qui a permis une étude détaillée de la composition des protéines du CSF, dans l'espoir que cette analyse pourrait aider à mieux comprendre les changements dynamiques. se produisent au sein du SNC.
Les développements technologiques dans les techniques d'immuno-analyse multiplex telles que Luminex et Simoa technologies2,3, fournissent aux chercheurs d'aujourd'hui la capacité de détecter des centaines de protéines à de très faibles concentrations. En outre, ces mêmes technologies permettent l'utilisation de petits volumes d'échantillons, favorisant ainsi des études chez les petits animaux, y compris les souris, dans lesquelles des volumes d'échantillons limités de CSF ont empêché des caractérisations détaillées du fluide jusqu'à récemment.
Néanmoins, une mise en garde est que les protéines mesurées dans CSF peuvent dériver de la synthèse intrathécale et / ou la transudation du sérum en raison d'une interface sang-cerveau endommagée (BBI). Malheureusement, l'analyse des protéines de CSF seul ne peut déterminer la somme de ces deux composants. Pour faire la distinction entre les protéines transudées et les protéines produites par voie intrathéque, les mesures des protéines CSF à l'aide de tout outil d'analyse des protéines disponible doit être ajustée en fonction de la variabilité individuelle des concentrations de sérum ainsi que de l'intégrité de la barrière. Cependant, bien que cet ajustement soit couramment utilisé dans la pratique clinique, par exemple, l'indice IgG de CSF, qui a la sensibilité élevée pour détecter la synthèse intrathécale d'IgG4,5,6, à ce jour très peu d'études de recherche ont corrigé des concentrations de protéine de CSF pour la concentration de sérum et l'intégrité de barrière7,8.
Actuellement, l'approche Reibergram est le meilleur moyen de déterminer la fonction de barrière et la synthèse intrathécale des protéines. Il s'agit d'une évaluation graphique dans les diagrammes du quotient cSF/sérum qui analyse, de manière intégrée, à la fois la fonction barrière (dys) et la synthèse des protéines intrathécales, se référant à une protéine exclusivement dérivée du sang9,10. L'albumine protéique très abondante est généralement choisie comme protéine de référence parce qu'elle est produite seulement dans le foie et parce que sa taille, approximativement 70 kDa, est intermédiaire entre les petites et grandes protéines11. Le diagramme d'analyse a été défini pour la première fois par Reiber et Felgenhauer en 1987 pour les principales classes d'immunoglobulines (Igs)11, étant empiriquement basé sur les résultats obtenus à partir de l'analyse de milliers d'échantillons humains9. L'approche a ensuite été confirmée par l'application des deux lois de diffusion de Fick dans la théorie de la diffusion moléculaire/taux de débit12. Une telle théorie démontre la diffusion d'une protéine à travers la barrière a une distribution hyperbolique et peut expliquer quantitativement la dynamique des protéines dans le SNC9,13. Dans l'ensemble, l'avantage d'utiliser le Reibergram pour démontrer la synthèse des protéines intrathécales est qu'il identifie simultanément la fraction de protéines qui pénètre dans le CSF à partir du sérum ainsi que la quantité de protéines trouvées dans le CSF en raison de la production locale.
Le présent article et le protocole connexe décrivent l'ensemble de la procédure, du CSF et de la collecte de sang aux calculs finaux corrigeant les niveaux de protéine de CSF, pour la mesure quantitative de la synthèse intrathécale de protéine dans les modèles de souris de neurologique Troubles. Cette procédure fournit une ligne de base contre laquelle évaluer (1) l'origine pathophysiologique de toute protéine de CSF et (2) la stabilité et la signification fonctionnelle de l'intégrité de barrière. Cette procédure et ce protocole sont non seulement utiles pour évaluer les échantillons de CSF de souris, mais sont également utiles dans l'analyse de CSF dans une multitude de modèles animaux des maladies neurologiques et des patients humains.

<table><tbody><tr><td>Seringue à insuline de 1 mL</td><td>BD</td><td>329650</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 mL</td><td>BD</td><td>329622</td><td></td></tr><tr><td>aiguille de calibre 25</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>seringue de 3 mL</td> d’aiguille à insuline <td>de calibre 30 BD</td><td>309582</td><td></td></tr> de <tr><td>calibre 30</td><td>305106</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coussinets absorbants</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td></td>appropriée</tr><tr><td>Acépromazine</td><td>Patterson Vet Supply Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioPlex Laveuse magnétique portable</td><td>BioRad</td><td>171020100</td><td>Magnet</td></tr><tr><td>BioPlex MAGPIX Lecteur multiplex</td><td>BioRad</td><td>171015001</td><td></td></tr><tr><td>BioPlex Pro Flat Bottom Plates Anticorps</td><td>BioRad</td><td>171025001</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilated</td><td>Detection Anticorps Toute source</td><td></td> appropriée <td>L’anticorps doit être dirigé contre l’espèce de la protéine d’intérêt.</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de buprénorphine</td><td>PAR Pharmaceutique</td><td>NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>Tubes capillaires</td><td>Instrument de sutter</td><td>B100-75-10</td><td>OD : 1,0 mm, ID : 0,75 mm Verre borosilicaté 10 cm ; dessiné sur Bunsen pour réduire l’ID.</td></tr><tr><td>Tube à centrifuger, 0,2 mL</td><td>VWR</td><td>20170-012</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger, 0,5 mL</td><td>VWR</td><td>87003-290</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger, 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Diacétate de chlorhexidine</td><td>Nolvasan</td><td>E004272</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipettes jetables</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td></td>appropriée</tr><tr><td>Barres auriculaires</td><td>KOPF Instruments</td><td>1921 ou 1922</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Kopter</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>Congélateur</td><td>VWR</td><td>VWR32086A</td><td></td></tr><tr><td>Gaze</td><td>Medline</td><td>NON25212</td><td></td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>Sunbeam</td><td></td><td>XL King Size SoftTouch, 4 réglages de chaleur avec arrêt automatique, Sarcelle, Chambre d’induction 12 pouces x 24 pouces</td></tr><tr><td></td><td>VETEQUIP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Vet Supply Inc</td><td>NDC 14043-704-06</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine (KetaVed)</td><td>Patterson Vet Supply Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagPlex Microspheres (couplée aux anticorps)</td><td>BioRad</td><td></td> Secoueur <td>de microplaques à billes magnétiques couplées</td></tr><tr><td></td><td>aux anticorps Southwest Scientific</td><td>SBT1500</td><td></td></tr><tr><td>Microretractors</td><td>Carfill Quality</td><td>ACD-010</td><td>Blunt - 1 mm</td></tr><tr><td>Microsoft Microsoft MilliPlex</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel</td><td>EMD Millipore</td><td>MGAMMAG-300K</td><td>Kit commercial pour la quantification par Luminex d’un panel d’isotypes et de sous-classes d’immunoglobulines dans les fluides de souris.</td></tr><tr><td>Kit ELISA de capture d’albumine</td><td>de souris Novus Biological</td><td>NBP2-60484</td><td>Kit commercial pour la quantification par ELISA de l’albumine dans les fluides de souris.</td></tr><tr><td>Pipette multicanaux</td><td>Eppendorf</td><td>3125000060</td><td></td></tr><tr><td>Écouvillons non stériles</td><td>MediChoice</td><td>WOD1002</td><td>Besoin d’être autoclavé pour la stérilité</td></tr><tr><td>Oxygène</td><td>AIRGAS</td><td>OX USPEA</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pippettes</td><td>Fisher</td><td>13-678-20A</td><td>Suture 5 & 3/4"</td></tr><tr><td>PDS avec aiguille jetable, 6-0 Prolen</td><td>Patterson Vet</td><td>8695G</td><td>P-3 Découpe inversée, 18"</td></tr><tr><td>PE-Streptavidin</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td></td></tr><tr><td>Pipetters</td><td>Eppendorf</td><td>Research Seriers</td><td></td></tr><tr><td>Tube en</td><td></td><td></td><td></td>polyéthylène</tr><tr><td>Centrifugeuse réfrigérée</td><td>Beckman Coulter</td><td>ALLEGRA X-12R</td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Uline</td><td>H2716</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Feather</td><td>EF7281</td><td></td></tr><tr><td>Rasoir</td><td>Appareil de Harvard</td><td>52-5204</td><td></td></tr><tr><td>Protéines étalons</td><td>Toute source</td><td></td> appropriée <td>Le meilleur choix pour un étalon de référence est une concentration purifiée et connue de la protéine d’intérêt.</td></tr><tr><td>Instrument stéréotaxique</td><td>KOPF Instruments</td><td>Modèle 900LS</td><td>Accessoires standard</td></tr><tr><td>Stérile 1 x PBS</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Saline stérile</td><td>Baxter</td><td>0338-0048-02</td><td>0,9 % chlorure de sodium Irrigation USP</td></tr><tr><td>Pince chirurgicale incurvée, 7 (2)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Ciseaux chirurgicaux</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>Vaporisateur en acier inoxydable 25x</td></tr><tr><td>+ débitmètre</td><td>Moduflex Anhestesia Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>RT-JR-20</td><td></td></tr><tr><td>Sonicateur d’eau</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-08895-01</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Patterson Vet Supply Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mesure quantitative des protéines synthétisées intrathéquement chez les souris

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

Le liquide céphalo-rachidien (CSF), un fluide trouvé dans le cerveau et la moelle épinière, est d'une grande importance pour la science fondamentale et clinique. L'analyse de la composition des protéines du FSC fournit des informations cruciales dans la recherche fondamentale en neurosciences ainsi que dans les maladies neurologiques. Une mise en garde est que les protéines mesurées dans CSF peuvent dériver de la synthèse intrathécale et la transudation du sérum, et l'analyse des protéines de CSF ne peut déterminer la somme de ces deux composants. Pour faire la distinction entre la transudation des protéines dans le sang et les protéines produites par voie intrathéque dans les modèles animaux ainsi que chez les humains, les mesures de profilage des protéines CSF à l'aide d'outils conventionnels d'analyse des protéines doivent inclure le calcul du quotient d'albumine CSF/sérum (Qalbumin), un marqueur de l'intégrité de l'interface sang-cerveau (BBI), et l'indice protéique (Qprotein/Qalbumin), une estimation de la synthèse intrathécale. Ce protocole illustre l'ensemble de la procédure, du CSF et de la collecte de sang aux quotients et aux calculs d'indices, pour la mesure quantitative de la synthèse intrathécale de protéine et de l'affaiblissement de BBI dans des modèles de souris des désordres neurologiques.

Cette expérience représentative visait à comparer la synthèse intrathécale d'IgG dans deux modèles de rongeurs cliniquement pertinents de la sclérose en plaques (MS) : l'encéphalomyélite expérimentale expérimentale induite par le PLP 139-151 (R-EAE) et la maladie demyélinisation induite par le virus de la maladie d'Inthesélinisation induite par le virus PLP139-151(TMEV-IDD). R-EAE est un modèle utile pour comprendre la SP cyclique, tandis que le modèle TMEV-IDD présente une SP progressive chronique<sup class="...

Les niveaux élevés de protéine de fluide spinal peuvent être le résultat de la diffusion de la protéine de plasma à travers une barrière hémato-encéphalique altérée ou la synthèse intrathécale. Un protocole d'essai optimisé est présenté dans cet article qui aide à discriminer les deux cas et fournit des mesures quantitatives des protéines synthétisées intrathécally.

Mesure quantitative des protéines synthétisées intrathéquement chez les souris

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...

Ce protocole permet à la CSF et à la collecte de sang dans la correction quantitative des niveaux de protéine de CSF de mesurer dans une synthèse de protéine thecal dans les modèles de souris des désordres neurologiques. Cette procédure fournit une ligne de base, contre laquelle l’origine pathophysiologique des protéines CSF d’intérêt, et la stabilité et la signification fonctionnelle de l’intégrité de faveur de CSF de sang peuvent être évaluées. L’analyse de la synthèse des protéines interthéales et de l’intégrité des barrières peut être appliquée à d’autres modèles animaux et à des études humaines.Par exemple, pour vérifier les maladies du système nerveux central. La collecte de volumes importants de CSF propre peut être techniquement difficile chez la souris, de sorte que la pratique de la technique jusqu’à ce que de grands volumes d’échantillon non contaminé peut être obtenu est conseillé. Micheal Linzey, un étudiant diplômé du programme de médecine expérimentale et moléculaire de Dartmouth, fera partie de notre nouveau groupe de recherche en immunologie.Pour la collecte de sérum par l’intermédiaire du saignement orbital rétro. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale dans une souris anesthésiée de plus de 15 grammes, saisissez la peau lâche derrière les oreilles avec le pouce et l’index de la main non dominante, et utilisez l’index pour tirer la peau au-dessus des yeux. À l’aide du pouce pour ramener la peau sous les yeux, placez la pointe d’une pipette Pasteur, maintenue à un angle d’environ 45 degrés, dans la douille des yeux sous le globe oculaire, dirigée vers le milieu de la prise des yeux, tout en tournant la pipette entre les doigts.Appliquez ensuite une pression brève et douce et relâchez pour permettre au sang d’entrer dans la pipette. Lorsque l’échantillon de sang a été prélevé, retirez doucement le capillaire sans blesser l’œil et transférez le sang dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre. Après avoir fermé la paupière, appliquer une légère pression avec de la gaze pour éviter d’autres saignements.Laisser le sang coaguler de 30 à 60 minutes à température ambiante avant de faire tourner l’échantillon par centrifugation. À l’aide d’une technique de pipette propre, recueillir le sérum séparé en un nouveau flacon de 500 microlitres étiqueté, et congeler immédiatement le sérum à 80 degrés Celsius. Après avoir confirmé l’absence de réponse au réflexe de pédale, enlever une zone assez grande de cheveux pour permettre la collecte du liquide céphalo-rachidien immédiatement à l’extrémité caudale du crâne de la souris anesthésiée.Placez la souris en position couchée sur un appareil stéréotaxique dans des conditions stériles, et stabilisez la tête avec des barres d’oreille. Écouvillonner le site chirurgical avec 30% de chlorhexidine diacétate, et faire une incision sagittale de la peau inférieure à l’occiput pour exposer les muscles qui survolent la magna cisterna. À l’aide de forceps, émoussé disséquer le tissu sous-cutané et les muscles, et utiliser des micro rétractateurs pour tenir les muscles à part pour exposer la couche méningée dura mater sur la magna cisterna.Lavez doucement les tissus avec du PBS stérile pour éliminer toute contamination possible du sang, et utilisez un coton-tige stérile pour éponger le dura mater sec. Le positionnement de la ponction initiale à la magna cisterna est essentiel pour obtenir abondante, non contaminé CSF. À l’aide d’une aiguille de calibre 30, perforez doucement la membrane qui recouvre la cisterna magna et insérez rapidement et doucement un petit tube capillaire en verre dans la perforation.Lorsque cinq à 12 microlitres de CSF ont été collectés, retirez soigneusement le tube de la membrane et utilisez un morceau de tube de polyéthylène pour connecter le tube à une seringue de trois millilitres. Injectez le CSF recueilli dans un tube de 500 microlitres étiqueté sur la glace, et utilisez une aiguille jetable et des sutures variées de polydioxanone pour fermer l’incision. Nettoyez la zone de tout sang ou tissu séché, et placez la souris dans une cage propre et chaude avec surveillance jusqu’à ce que la charge complète.Recueillir le CSF par centrifugation, et inspecter visuellement la pastille et la supernate pour tout signe de contamination du sang. Ensuite, à l’aide d’une technique de pipette propre, transférez le supernate contenant du CSF dans un nouveau tube de 200 microlitres et diluez le CSF à un rapport d’un à trois avec PBS pour un stockage immédiat à 80 degrés Celsius. Pour la collecte du sérum par perforation cardiaque, immédiatement après la collecte CSF, comme nous venons de le démontrer, placez la souris dans la position de supination.Écouvillonner la peau abdominale avec 70% d’alcool. Utilisez des ciseaux pour ouvrir la cavité thoracique, exposant le cœur, et insérez une aiguille de calibre 25 attachée à une seringue de 3 millilitres dans le ventricule gauche. Ensuite, appliquez doucement une pression négative sur le piston de seringue, en retirant l’aiguille après que le sang a été recueilli.Déprimez le piston pour éjecter le sang recueilli dans un flacon de 1,5 millilitre. Maintenant, laissez le sang coaguler pendant 30 à 60 minutes à température ambiante avant de séparer le sérum par centrifugation. Ensuite, à l’aide d’une technique de pipette propre, transférer le sérum dans un nouveau flacon de 500 microlitres étiqueté pour un stockage immédiat à 80 degrés Celsius.Pour quantifier les protéines cibles et l’albumen dans des échantillons de sérum et de CSF appariés, utilisez un test standard de quantification des protéines, en utilisant des protéines standard référencées pour préparer une courbe standard pour chaque protéine d’intérêt. Après l’analyse, exportez les données brutes vers un programme de graphique logiciel approprié, et graphiquez l’intensité de fluorescence du signal de détection par rapport aux concentrations standard de protéines pour créer une courbe standard pour chaque protéine d’intérêt. Ensuite, utilisez les courbes standard pour calculer les concentrations de chaque analyte d’intérêt dans les échantillons.Enfin, utilisez l’albumen et ciblez les concentrations d’analyte pour calculer les valeurs Q et l’indice intrathécal. Les niveaux réels de l’IgG total sont sensiblement augmentés dans le CSF de deux modèles éprouvés de rongeur de sclérose en plaques, comparés aux contrôles simulés assortis d’âge correspondant. Les souris de R-EAE montrent des valeurs significativement améliorées de quotient d’albumen, indiquant une perméabilité accrue de la barrière de cerveau de sang dans ces souris.Nonversely, aucune différence dans le quotient d’albumen n’existe entre TMEV-IDD et souris factices, corroborant des résultats précédents d’une barrière intacte chez les souris TMEV-IDD. En outre, chez les animaux TMEV-IDD, des valeurs significativement plus élevées de l’indice IgG et, par conséquent, la production intrathécale d’IgG sont observées. Le calcul d’un indice protéique facilite l’identification de nouveaux biomarqueurs protéiques utiles pour le diagnostic précoce, la prévision des résultats et la surveillance des cours sur les maladies pour les maladies neuro-inflammatoires et neurodégénératives.

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Neurosciences

Modèles de souris transgéniques (Tg) de AD offrent une excellente occasion d'examiner comment et pourquoi les niveaux de Aß ou de tau dans le LCR changements que la maladie progresse chez les patients humains. Ici, nous démontrons une technique raffinée cisterna magna perforation pour l'échantillonnage CSF de série de la souris.

Une technique de recueil de série du liquide céphalorachidien de la grande citerne de souris

Ce protocole de détails comment quantifier le numéro de synapses neuronales dans la culture à la fois dissociées et dans les sections du cerveau en utilisant l'immunocytochimie. En utilisant des anticorps spécifiques du compartiment, nous appelons les terminaux présynaptiques ainsi que des sites de spécialisation post-synaptiques. Nous définissons les synapses comme des points de colocalisation entre les signaux générés par ces marqueurs.

Synapses Quantifier: un dosage à base d&#39;immunocytochimie Quantifier Nombre Synapse

Cette vidéo démontre la coloration par immunofluorescence d’une tranche de cerveau de souris pour quantifier la distribution d’une protéine présynaptique spécifique. Le processus implique le blocage de sites non spécifiques, l’application d’anticorps primaires pour la protéine cible et d’un marqueur de référence, suivie d’un marquage secondaire des anticorps et d’une contre-coloration nucléaire. Le marqueur de référence assure une quantification précise en fournissant une base de référence...

Quantification de la distribution d’une protéine présynaptique dans le cerveau de la souris à l’aide de l’immunofluorescence

L’identification des molécules et des voies contrôlant la plasticité synaptique et la mémoire reste un défi majeur en neurosciences. Ici, un flux de travail est décrit abordant la quantification relative des protéines synaptiques supposées impliquées dans la réorganisation moléculaire des synapses pendant l’apprentissage et la consolidation de la mémoire dans un paradigme d’apprentissage auditif.

Résolution quantitative Haute Synaptic Proteome Profiling des souris régions cérébrales Après Auditory Discrimination apprentissage

Nous avons généré avec succès deux essais de substrat spécifique γ-sécrétase. Les deux analyses cellulaires présentés ici visent à quantifier les activités enzymatiques de la γ-secretase via la sortie de reporters luciférase firefly.

Mesure quantitative de la protéine précurseur de l’amyloïde véhiculée par γ-sécrétase et Notch clivage dans Cell-based Luciferase Reporter Assay plates-formes

In vivo la microdialyse a permis la collecte des molécules présentes dans le liquide interstitiel de cerveau (ISF) des animaux éveillés, agir librement. Afin d’analyser les molécules relativement importantes dans l’ISF, l’article actuel se concentre spécifiquement sur le protocole de la microdialyse utilisant des sondes à haut poids moléculaire, couper des membranes.

In Vivo Sondes de la microdialyse méthode pour recueillir les grosses protéines extracellulaires de cerveau liquide interstitiel avec seuil de poids moléculaire élevé

La synthèse des protéines est un processus biologique essentiel pour les cellules. Dans le cerveau, il est nécessaire pour les changements adaptatifs. La mesure des taux de synthèse des protéines dans le cerveau intact nécessite des considérations méthodologiques soignelées. Ici nous présentons la méthode autoradiographique quantitative de L-[1-14C]-leucine pour déterminer des taux régionaux de synthèse cérébrale de protéine in vivo.

Méthode autoradiographique quantitative pour la détermination des taux régionaux de synthèse des protéines cérébrales In Vivo

Nous décrivons ici une approche quantitative pour déterminer la répartition d’une protéine synaptique par rapport à une protéine de marqueur à l’aide d’immunofluorescence souillant, microscopie confocale et analyse assistée par ordinateur.

Quantifier la répartition hétérogène d’une protéine synaptique dans le cerveau de souris à l’aide d’Immunofluorescence

Ce protocole est conçu pour quantifier efficacement l'activité du système ubiquitine-protéasome (UPS) dans différents compartiments cellulaires du cerveau des rongeurs. Les utilisateurs sont en mesure d'examiner le fonctionnement de l'UPS en fractions nucléaires, cytoplasmiques et synaptiques chez le même animal, ce qui réduit le temps et le nombre d'animaux nécessaires pour effectuer ces analyses complexes.

Quantification de l'activité subcellulaire ubiquitine-protéasome dans le cerveau des rongeurs

Ce travail décrit un protocole pour la quantification des modifications globales des histones par cytométrie en flux intranucléaire dans des microglies cérébrales isolées. L’ouvrage contient également le protocole d’isolement de la microglie qui a été utilisé pour la collecte de données.

Quantification des modifications post-traductionnelles des histones globales à l’aide de la cytométrie en flux intranucléaire dans la microglie cérébrale isolée de souris

Découvrez une méthode optimisée pour collecter le liquide céphalo-rachidien et le sang chez la souris, permettant de quantifier la synthèse intrathécale des protéines et d'évaluer l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique.

Mesure quantitative des protéines synthétisées intrathéquement chez les souris

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