Name: Monitoraggio degli anticorpi PD-1-Blocking legati a cellule T derivate da una goccia di sangue periferico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: Scopri un saggio di citometria a flusso per valutare gli anticorpi anti-PD-1 su cellule T usando una goccia di sangue periferico. Questo metodo semplice identifica i sottoinsiemi immunitari legati agli effetti antitumorali.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a S.K. dalla Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (JP17K16045) e dall'Agenzia Giapponese per la Ricerca e lo Sviluppo Medicina (JP18cm0106335 e 19cm0106310).

Il campionamento è stato eseguito durante le procedure cliniche di routine. Tutti i campioni umani sono stati ottenuti dopo il consenso informato è stato fornito dai soggetti, in conformità con la dichiarazione di Helsinki e con l'approvazione del comitato di revisione etica della Graduate School of Medicine, Università di Osaka, Giappone (15383 e 752).
1. Preparazione e colorazione del campione di sangue intero
<ol><li>Raccogliere campioni interi di sangue in tubi di raccolta del sangue contenenti etilene diamine tetra-acetico acido (EDTA). NOTA: La raccolta del sangue può essere eseguita utilizzando un ago normale o una lancetta di sangue.</li>
	<li>Trasferire 20 - L di campioni di sangue intero a 5 mL di tubi di citometria a flusso di polistirolo rotondo. NOTA: Per ridurre l'associazione non specifica delle cellule ai tubi, 1 mL di 2% siero bovino fetale (FBS) in salina tampina bufferizzata fosfato (PBS) viene aggiunto ai tubi e vortice per 10 s prima dell'applicazione ai campioni.</li>
	<li>Aggiungere in PBS 20 -L del 2% Di FBS.</li>
	<li>Aggiungete 10 l di reagente di blocco FcR specifico per l'uomo. Mescolare bene e incubare per 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 500 l di l'isola del globulo rosso. Mescolare bene e incubare per 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungete 4 mL di 2% FBS in PBS e abbassate le celle a 400 x g (1.500 giri/m) per 5 min a 4 gradi centigradi. Rimuovere supernatante per aspirazione.</li>
	<li>Ripetere il processo di lavaggio e aspirazione descritto nel passaggio 1.6.</li>
	<li>Sospendi di nuovo le cellule in 100 gradi l di 2% FBS in PBS e divise in due tubi da 50 a L ciascuno.</li>
	<li>Aggiungere anticorpi dei marcatori di superficie (Tabella 1). Mescolare bene e incubare per 20 min a temperatura ambiente al buio. NOTA: durante la profilazione dello stato immunitario delle cellule T, il numero di marcatori può essere aumentato in base alla qualità della macchina della citometria di flusso.</li>
	<li>Lavare i campioni 2x come descritto al punto 1.6.</li>
	<li>Risospendere le celle in 200 - L del 2% FBS in PBS.</li>
</ol>2. Analisi citometrica del flusso
<ol><li>Inserire tubi nel citometro di flusso e acquisire cellule, fondamentalmente seguendo il protocollo raccomandato9.</li>
	<li>Registrare 10.000 eventi come porta del linfocito (Figura 1A) ed esportare i dati di flusso come file .fcs per l'analisi.</li>
	<li>Aprire i file nel software di analisi. Visualizzare le celle in un grafico a dispersione in avanti (FSC) (A) rispetto a dispersione laterale (SSC) (A) e linfociti gate (Figura 1A).</li>
	<li>Dopo aver selezionato le celle singole utilizzando FSC (H) vs FSC (W) e SSC (H) vs SSC (W) (W)(Figura 1B) e averle visualizzate su un grafico CD3 vs CD8 o CD3 rispetto a CD4, gate le cellule T CD8 e le celle T CD4, rispettivamente (Figura 1C).</li>
	<li>Dopo aver selezionato le celle gated e averle visualizzate su un grafico PD-1 rispetto a quello umano IgG4, identificare le celle CD8 e T legate agli anticorpi PD-1 in base al controllo isotipo (Figura 1D).</li>
</ol>

<ol><li>Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+PD-1+and+PD-L1+inhibitors+as+a+form+of+cancer+immunotherapy%3A+a+comprehensive+review+of+registration+trials+and+future+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8(2018).</li>
<li>Borghaei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Nonsquamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).</li>
<li>Brahmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Squamous-Cell+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).</li>
<li>Herbst, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+versus+docetaxel+for+previously+treated%2C+PD-L1-positive%2C+advanced+non-small-cell+lung+cancer+%28KEYNOTE-010%29%3A+a+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial.</a> The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).</li>
<li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-Related+Adverse+Events+Associated+with+Immune+Checkpoint+Blockade%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li>
<li>Weber, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+Profile+of+Nivolumab+Monotherapy%3A+A+Pooled+Analysis+of+Patients+With+Advanced+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).</li>
<li>Champiat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+immune+checkpoint+blockade+dysimmune+toxicities%3A+a+collaborative+position+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper.</a> Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).</li>
<li>Brahmer, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+%28MDX-1106%29+in+refractory+solid+tumors%3A+safety%2C+clinical+activity%2C+pharmacodynamics%2C+and+immunologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).</li>
<li>Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-parametric+flow+cytometry+staining+procedure+for+analyzing+tumor-infiltrating+immune+cells+following+oncolytic+herpes+simplex+virus+immunotherapy+in+intracranial+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma.</a> Journal of Biological Methods. 6 (2), 112(2019).</li>
<li>Osa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+implications+of+monitoring+nivolumab+immunokinetics+in+non-small+cell+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients.</a> JCI Insight. 3 (19), 59125(2018).</li>
<li>Zelba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+of+T-cells+expressing+PD-1+in+patients+on+anti-PD-1+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).</li>
<li>Simoni, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bystander+CD8%28%2B%29+T+cells+are+abundant+and+phenotypically+distinct+in+human+tumour+infiltrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates.</a> Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).</li>
<li>Chiu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+general+method+for+quantifying+IgG-based+therapeutic+monoclonal+antibodies+in+human+plasma+using+protein+G+purification+coupled+with+a+two+internal+standard+calibration+strategy+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS.</a> Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo articolo, riportiamo un metodo utilizzando un citometro di flusso per rilevare PD-1-bloccando gli anticorpi legati alle cellule T derivate da una goccia di sangue periferico, che abbiamo originariamente sviluppato per il rilevamento nivolumab10. Anche se questa tecnica è molto semplice e facile da eseguire, due punti importanti devono essere annotati per ottenere risultati accurati. Uno è che per rilevare le molecole PD-1, dovrebbe essere utilizzato un anticorpo appropriato che compete c...

Gli anticorpi PD-1-bloccanti sono diventati la scelta standard per il trattamento di vari tipi di cancro, tra cui il cancro polmonare non a piccole cellule (NSCLC)1,2,3,4. Essi mostrano un notevole effetto terapeutico in un sottoinsieme di pazienti oncologici che non hanno risposto alle chemioterapie citotossiche convenzionali. Tuttavia, gli inibitori del checkpoint immunitario (ICI), che includono anticorpi che bloccano la PD-1, possono causare uno spettro unico e distinto di eventi avversi, dorati eventi avversi legati al sistema immunitario (irAE)5. Anche se gli irAE possono colpire quasi tutti i tessuti, sono più comunemente osservati nel tratto gastrointestinale, ghiandole endocrine, pelle, e fegato, e possono causare prurito, eruzione cutanea, nausea, diarrea, e disturbi della tiroide6,7. In generale, la maggior parte degli irsia appare entro 1 o 2 mesi dopo l'avvio delle ICI. Tuttavia, in alcuni casi, possono verificarsi dopo 1 anno dopo l'inizio del trattamento o anche dopo la cessazione del trattamento6,7. Essi causano anche vari sintomi che possono essere difficili da discriminare da altre patologie. Pertanto, può essere difficile diagnosticare tempestivamente gli iraE e trattarli in modo appropriato. Gli irAE possono colpire tutti i tessuti e la loro insorgenza è fortemente influenzata dalle cellule immunitarie circolanti, in particolare le cellule T legate agli anticorpi che bloccano la PD-1. Pertanto, un metodo semplice e minimamente invasivo per monitorare le cellule T mirate agli anticorpi è importante negli ambienti clinici.
Qui, abbiamo sviluppato un semplice metodo per valutare il legame di anticorpi che bloccano PD-1 alle cellule T utilizzando una goccia di sangue intero periferico da pazienti oncologici che hanno ricevuto nivolumab o pembrolizumab. Utilizzando questo approccio, siamo stati in grado di monitorare ciascuno dei seguenti elementi: 1) la durata del legame degli anticorpi alle cellule T, 2) l'occupazione delle molecole di PD-1 delle cellule T da parte di anticorpi terapeutici e 3) lo stato di attivazione e le caratteristiche immunologiche delle cellule T. Questo metodo è una modifica di una tecnica precedentementesegnalata 8. La quantità di sangue necessaria è quasi la stessa di quella necessaria per un test del glucosio, e l'approccio non richiede l'arricchimento delle cellule mononucleari o la co-cultura con anticorpi che bloccano la PD-1. Abbiamo confermato che questo metodo può essere eseguito anche utilizzando campioni congelati, tra cui cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) e cellule da effusione plerica, effusione pericardiale, liquido di lavanda bronchoalveolar e liquido cerebrospinale, suggerendo che questa strategia può essere utile nel contesto di uno studio multicentrico. Questo metodo può facilitare la diagnosi precoce degli iraE e anche aiutare a determinare i trattamenti immunosoppressivi appropriati per controllare i loro sintomi e per identificare i tempi ottimali per avviare terapie successive dopo inibitori PD-1.

<table><tbody><tr><td>10X tampone di lisi dei globuli rossi (multispecie)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4300-54</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>APC/Cyanine7 anticorpo CD4 umano</td><td>BioLegend</td><td>300518</td><td>Clone RPA-T4</td></tr><tr><td>BD FACS Canto II Citometro</td><td>a flusso BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 anti-umano CD8a</td><td>BioLegend</td><td>301048</td><td>Clone RPA-T8</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Soluzione salina tamponata</td><td>tesque</td><td>14249-95</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Falcon Provette in polistirene a fondo tondo</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>352058</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Reagente bloccante FcR, umano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>FLOWJO</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco Siero fetale bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12676029</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 monoclonale - Controllo isotipo</td><td>abcam</td><td>ab81200</td><td></td></tr><tr><td>Mouse monoclonale Anti-Human IgG4 Fc</td><td>abcam</td><td>ab99825</td><td>Clone HP6025</td></tr><tr><td>Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3</td><td>BD</td><td>558117</td><td>Clone UCHT1</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Topo anti-Human CD279 (PD-1)</td><td>BD</td><td>561272</td><td>Clone EH12.1</td></tr><tr><td>PE-Cy7 Mouse IgG1 &kappa; Controllo isotipo</td><td>BD</td><td>557646</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoraggio degli anticorpi pd-1-blocking legati a cellule t derivate da una goccia di sangue periferico

Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood

Gli inibitori dei checkpoint immunitari, tra cui gli anticorpi che bloccano la PD-1, hanno migliorato significativamente gli esiti del trattamento in vari tipi di cancro. L'efficacia farmacologica di queste immunoterapie è di lunga durata, estendendosi anche oltre l'interruzione delle loro iniezioni, a causa di persistenti concentrazioni ematiche. Qui abbiamo sviluppato un semplice saggio di citometria di flusso per valutare lo stato di legame delle cellule T degli anticorpi che bloccano il PD-1 nivolumab e pembrolizumab. Come un test del glucosio, questo saggio richiede solo una singola goccia di sangue periferico. La visualizzazione del legame degli anticorpi sulle cellule T è più affidabile della misurazione delle concentrazioni ematiche degli anticorpi. Inoltre, se necessario, possiamo potenzialmente analizzare molti marcatori immunitari distintivi correlati alle cellule T legati agli anticorpi che bloccano la PD-1. Quindi, questa è una strategia semplice e minimamente invasiva per analizzare l'effetto farmacologico degli anticorpi che bloccano la PD-1 nei pazienti oncologici.

La strategia di gating e l'analisi della citometria di flusso (Figura 1) sono in grado di rilevare il legame degli anticorpi PD-1-bloccante alle cellule T ottenute da una goccia di sangue periferico del paziente NSCLC. Prima che l'anticorpo pd-1-blocco venga somministrato, non sono presenti cellule T CD8 o CD4 umane- positive e l'espressione PD-1 può essere confermata da un anticorpo di rilevamento PD-1 (EH12.1)(Figura 2A). Dopo la somministrazi...

Abbiamo sviluppato un semplice saggio di citometria di flusso per valutare il legame degli anticorpi di blocco PD-1 alle cellule T, richiedendo solo una goccia di sangue periferico da pazienti oncologici.

Monitoraggio degli anticorpi PD-1-Blocking legati a cellule T derivate da una goccia di sangue periferico

Immune checkpoint inhibitors, including PD-1&#8211;blocking antibodies, have significantly improved treatment outcomes in various types of cancer. The ...

Poiché questo metodo determina le cellule legate agli anticorpi che bloccano il PD-1 utilizzando sangue periferico dei pazienti, è possibile identificare il sottoinsieme specifico responsabile degli effetti antitumorali e degli eventi avversi immunitari. Questo metodo ha bisogno solo di una piccola quantità di campione di sangue e il processo di analisi è abbastanza semplice e veloce. Ha solo bisogno di una macchina citometrica a flusso.Per iniziare, raccogliere campioni di sangue intero in tubi di raccolta del sangue contenenti EDTA. Trattare ogni cinque millilitri tubo citometrico a flusso di polistirene inferiore rotondo con un millilitro di siero bovino fetale al 2% in PBS. Vortice per 10 secondi.Quindi trasferire 20 microlitri di campioni di sangue intero ai tubi inferiori rotondi da cinque millilitri trattati. Aggiungere 20 microlitri di 2%FBS in PBS e 10 microlitri di reagente bloccante del recettore FC specifico per l'uomo. Mescolare bene e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.Quindi, aggiungere 500 microlitri di tampone dilisi dei globuli rossi. Mescolare bene e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere quattro millilitri del 2%FBS in PBS e far girare le celle a 400 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Rimuovere il supernatante per aspirazione. Ripetere il processo di lavaggio e aspirazione. Rimospendare le celle in 100 microlitri del 2%FBS in PBS e dividersi in due tubi da 50 microlitri ciascuno.Aggiungere anticorpi marcatori di superficie. Mescolare bene e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente al buio. Lavare i campioni due volte nel 2%FBS in PBS come in precedenza.Rimosi le celle in 200 microlitri del 2%FBS in PBS. Inserire i tubi nel citometro di flusso e acquisire celle seguendo il protocollo consigliato. Registra 10.000 eventi come gate dei linfociti ed esporta i dati di flusso come file FCS per l'analisi.Aprire i file nel software di analisi e fare clic sul file di controllo dell'isotipo per visualizzare le cellule su un grafico a dispersione in avanti rispetto alla dispersione laterale e ai linfociti di gate. Selezionare singole celle utilizzando FSCH rispetto a FSCW e SSCH rispetto a SSCW e visualizzarle su un grafico CD3 rispetto a CD8 o CD3 rispetto a CD4. Gate rispettivamente le celle T CD8 e CD4.Selezionare le celle recingate e visualizzarle su un grafico IgG4 PD-1 rispetto a quello umano. Quindi, in base al controllo dell'isotipo, selezionate Q3 per identificare le cellule T CD8 e CD4 con blocco anticorpale PD-1. In questo studio, la strategia di gating e l'analisi della citometria del flusso hanno rilevato il legame anticorpo che blocca il PD-1 alle cellule T ottenuto da una goccia di sangue periferico del paziente.Il grafico PD-1 contro IgG4 umano mostra lo stato di legame degli anticorpi che bloccano il PD-1 sulle cellule T. Punti arancioni e punti neri indicano rispettivamente la colorazione anticorpale anti-IgG4 e controllo dell'isotipo. Prima della somministrazione di anticorpi di blocco PD-1, non erano presenti cellule T positive IgG4 umane CD8 o CD4 e l'espressione PD-1 è stata confermata da un anticorpo di rilevamento PD-1.Dopo la somministrazione di nivolumab o pembrolizumab, IgG4 può essere rilevato sulle cellule T da anticorpi anti-IgG4 mentre l'anticorpo di rilevamento PD-1 EH12.1 non riconosce alcun PD-1 sulle cellule T. I cancelli rosso, blu e verde indicano rispettivamente l'associazione completa, l'associazione parziale e la perdita dell'associazione. Dopo che i pazienti hanno interrotto nivolumab e pembrolizumab, lo stato dell'anticorpo che blocca il PD-1 si lega alle cellule T CD8 è diminuito.C'è stata una parziale legatura e infine una completa perdita di binding. Assicurati di mescolare il campione di sangue anche con la llisi RBC. Inoltre, la miscelazione della lisi RBC prima della colorazione del marcatore di superficie è il passaggio chiave di questo metodo.Se il ricercatore ha accesso a una macchina citometrica a flusso avanzato, le cellule T legate agli anticorpi PD-1 possono essere valutate con sempre più marcatori correlati a Questa strategia può essere applicata per profilare fenotipi di cellule T responsabili di eventi avversi causati da anticorpi di blocco PD-1. Il campionamento da pazienti con eventi avversi sviluppati è importante per valutare l'utilità di questa strategia.

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L&#39;induzione di anergia Alloantigen specifici nelle cellule mononucleari del sangue periferico di stimolazione Alloantigen con co-stimolatorie blocco del segnale

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