Name: Induction de léryptose dans les globules rouges à laide dun ionophore de calcium (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Découvrez une méthode fiable pour induire l'éryptose dans les érythrocytes humains à l'aide d'ionomycine. Ce protocole permet d'évaluer la localisation de la phosphatidylsérine et facilite les recherches en biologie cellulaire.

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Ce travail a été soutenu par la subvention des NIH R15ES030140 et la subvention DE nSF CBET1903568. Le soutien financier du Russ College of Engineering and Technology et du Département de génie chimique et biomoléculaire de l'Université de l'Ohio est également reconnu.

Tous les échantillons de sang humain utilisés dans le protocole décrit ci-dessous ont été achetés comme échantillons dé-identifiés. Aucun sujet humain n'a été directement impliqué ou recruté pour cette étude. Les lignes directrices de la Déclaration d'Helsinki devraient être utilisées lorsque la recherche porte sur des sujets humains.
1. Isolement d'érythrocyte du sang entier
<ol><li>Ajouter 500 ll de sang entier dans du dextrose de citrate acide (ACD) (stocké à 4 oC) dans un tube de microcentrifuge. REMARQUE : Le sang entier a été acheté dans ACD. Selon la société, 1,5 mL d'ACD est ajouté à 7 ml de sang entier (8,5 mL volume total).</li>
	<li>Centrifuger le sang entier à 700 x g pendant 5 min à température ambiante (RT) et enlever le plasma clair et le mince manteau bouffi à l'aide d'une pipette pour laisser la couche d'érythrocyte rouge.</li>
	<li>Préparer 1 L de solution Ringer contenant 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 32 mM HEPES, 5 mM de glucose, et 1 mM CaCl2. Ajustez le pH à 7,4 en ajoutant 2 gouttes de L de 1,0 M NaOH. Pour préparer la solution Ringer sans glucose, suivez le même protocole, mais n'incluez pas de glucose dans la solution.</li>
	<li>Laver les érythrocytes 2x dans la solution Ringer en suspendant la pastille cellulaire dans 1,5 ml de la solution Ringer, en centrifuge à 700 x g pendant 5 min à RT, et en enlevant le supernatant.</li>
	<li>Faire un hematocrit de 0,4 % en rependant 40 l l de granule d'érythrocyte dans 9 960 l de solution Ringer sans glucose pour atteindre un volume final de 10 ml. REMARQUE: Hematocrit est un terme utilisé pour désigner la fraction de volume des érythrocytes en suspension. Un hematocrit de 0,4 % est une suspension contenant 0,4 % d'érythrocytes.</li>
	<li>Incuber la suspension de la cellule à 37 oC pendant 7 jours.</li>
</ol>2. Traitement des érythrocytes avec l'ionomycine et mesure de l'hémolyse
<ol><li>Dissoudre 1 mg de sel de calcium ionomycine dans 630 l de sulfoxide de diméthyle (DMSO) pour atteindre une concentration finale de 2 mM. Aliquot et magasin à -20 oC.</li>
	<li>Prendre 1 ml de l'hématocrit de 0,4 % à partir de l'étape 1,5 et ajouter 0,5 l d'ionomycine de 2 mm pour atteindre une concentration finale de 1 M. Incubate pendant 2 h à 37 oC.<ol>
<li>Utilisez 1 mL de l'hématocrit sans traitement à l'ionomycine comme un contrôle négatif.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifuger les hématocrits traités par l'ionomycine et non traités à 700 x g pendant 5 min à RT, et enlever leurs supernatants pour laisser les granulés de cellules au fond des tubes.</li>
	<li>Laver les cellules 3x avec la solution Ringer en suspendant les granulés de cellules dans 1,5 ml de la solution Ringer, en centrifuge antà 700 x g pendant 5 min à RT et en jetant les supernatants.</li>
	<li>Pour mesurer l'hémolyse, ajouter 1 ml de l'hématocrit non traité de 0,4 % de l'étape 1,5 à un tube de microcentrifuge et incuber pendant 2 h à 37 oC comme contrôle négatif de l'hémolyse (0 %).</li>
	<li>Ajouter 1 ml de l'hématocrit non traité de 0,4 % de l'étape 1,5 à un tube de microcentrifugeet et centrifugeuse à 700 x g pendant 5 min à RT. Retirez le supernatant et ajoutez 1 ml d'eau distillée à la granule cellulaire et incubez pendant 2 h à 37 oC comme contrôle positif de l'hémolyse (100 %).</li>
	<li>Ajouter 1 mL de l'hématocrit de 0,4 % traité à l'ionomycine à partir de l'étape 2.2 à un tube microcentrifuge.</li>
	<li>Centrifugeles les cellules non traitées, les cellules traitées, et les cellules dans l'eau distillée à 700 x g pendant 5 min à RT.</li>
	<li>Prendre 200 l l des supernatants et ajouter à une assiette de 96 puits.</li>
	<li>Mesurer l'absorption à 541 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques.</li>
	<li>Calculez l'hémolyse à l'aide de l'équation 132: %Hémolyse (AT - A0)/(A100 - A0) 100 où A0 est l'absorption des érythrocytes dans la solution Ringer, A100 est l'absorption des érythrocytes dans l'eau, et AT est l'absorption des érythrocytes traités par l'ionomycine.</li>
</ol>3. L'anxination de liaison Annexe-V
<ol><li>Diluer 2 ml du tampon de liaison 5x annexe V dans 8 ml de saline tampontampon tamponde de phosphate (PBS) pour obtenir un tampon de liaison 1x.</li>
	<li>Resuspendre les granulés cellulaires traités et non traités à l'ionomycine à partir de l'étape 2,4 dans 1 ml de tampon de liaison 1x.</li>
	<li>Prenez 235 l de suspensions cellulaires dans le tampon de liaison et ajoutez 15 l de la farine 488 d'Annexin V-Alexa.</li>
	<li>Incuber les cellules à RT pendant 20 min dans un endroit sombre. Centrifugeuse à 700 x g pendant 5 min à RT et retirez le supernatant.</li>
	<li>Laver les cellules 2x avec un tampon de liaison 1x, en suspendant la pastille cellulaire dans 1,5 ml du tampon de liaison, en centrifuge à 700 x g pendant 5 min à RT et en enlevant le supernatant.</li>
	<li>Resuspendre les granulés cellulaires dans 250 l de tampon de liaison 1x pour les mesures de cytométrie du débit.</li>
</ol>4. Cytométrie de flux
<ol><li>Transférer 200 l des érythrocytes tachés d'annexine-V dans des tubes de polystyrène ronds de 1 ml compatibles avec la cytométrie du débit.</li>
	<li>Connectez-vous au logiciel de cytométrie de flux et cliquez sur le nouveau bouton d'expérience. Cliquez sur le nouveau bouton tube. Sélectionnez la feuille globale et choisissez l'analyse d'application pour mesurer l'intensité de fluorescence avec une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et une longueur d'onde d'émission de 530 nm.</li>
	<li>Définir le nombre de cellules à 20 000 à recueillir pour l'analyse du tri cellulaire activé par la fluorescence (FACS).</li>
	<li>Sélectionnez le tube désiré et cliquez sur le bouton de chargement. Cliquez sur le bouton d'enregistrement pour les mesures de diffusion vers l'avant et de dispersion latérale. Répéter l'opération pour tous les échantillons.</li>
	<li>Cliquez à droite sur le bouton spécimen et cliquez sur appliquer l'analyse par lots pour générer le fichier de résultat.</li>
	<li>Cliquez à droite sur le bouton spécimen et cliquez sur générer des fichiers FSC.</li>
	<li>Ajoutez les données de cytométrie de flux (fichiers FSC) dans le lieu de travail du logiciel de cytométrie de flux.</li>
	<li>Analyser les données de contrôle en sélectionnant la population cellulaire d'intérêt et en ajoutant des statistiques pour la valeur de l'éryptose.<ol>
<li>Double clic sur le contrôle et sélectionnez l'histogramme par rapport à l'intensité de fluorescence.</li>
		<li>Cliquez sur le bouton de la porte pour dessiner une porte sur l'histogramme qui indique le pourcentage d'éryptose.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Appliquer les mêmes statistiques pour tous les autres tubes expérimentaux pour obtenir les valeurs de l'éryptose. Cliquez à droite sur le contrôle et sélectionnez l'analyse de copie pour le groupe.</li>
	<li>Après avoir correctement gating tous les échantillons, transférer les données analysées en les faisant glisser et en les laissant tomber dans l'éditeur de mise en page.<ol>
<li>Regroupez les données analysées avec le contrôle de l'éditeur de mise en page.</li>
		<li>Définiz les histogrammes et les intensités souhaités en changeant l'axe x et y des graphiques superposés.</li>
		<li>Exportez des fichiers d'images en cliquant sur le bouton d'exportation et enregistrez les graphiques à l'emplacement souhaité.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Microscopie confocale
<ol><li>Transférer 5 ll de cellules tachées d'annexine-V sur une lame de microscope et la recouvrir d'une feuille de couverture. Garder dans un endroit sombre pour éviter le photoblanchiment.</li>
	<li>Utilisez le laser Argon du microscope à fluorescence confocale pour observer les cellules excitées à 488 nm avec les grossissements désirés. REMARQUE : Un microscope confocal n'est pas nécessairement nécessaire et n'importe quel microscope avec des capacités de fluorescence peut être employé pour obtenir des images de fluorescence qui démontrent la liaison d'annexin-V.</li>
	<li>Obtenir des images de fluorescence du contrôle (cellules non traitées) et des cellules traitées. REMARQUE : On s'attend à ce que les cellules non traitées montrent des signaux de fluorescence très faibles, tandis que les cellules traitées devraient montrer la fluorescence vert vif sur leurs membranes.</li>
</ol>

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<li>Barber, L. A., Palascak, M. B., Joiner, C. H., Franco, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminophospholipid+Translocase+and+Phospholipid+Scramblase+Activities+in+Sickle+Erythrocyte+Subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Aminophospholipid Translocase and Phospholipid Scramblase Activities in Sickle Erythrocyte Subpopulations.</a> British Journal of Haematology. 146 (4), 447-455 (2009).</li>
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<li>Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-Dependent+Phospholipid+Scrambling+by+TMEM16F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F.</a> Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).</li>
<li>Bhuyan, A. A. M., Haque, A. A., Sahu, I., Coa, H., Kormann, M. S. D., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Suicidal+Erythrocyte+Death+by+Volasertib%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Suicidal Erythrocyte Death by Volasertib.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (4), 1472-1486 (2017).</li>
<li>Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Phospholipid+Organization+in+Calcium-Loaded+Human+Erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 902 (2), 253-262 (1987).</li>
<li>Alzoubi, K., Calabrò, S., Egler, J., Faggio, C., Lang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+of+Programmed+Erythrocyte+Death+by+Alantolactone%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Triggering of Programmed Erythrocyte Death by Alantolactone.</a> Toxins (Basel). 6 (12), 3596-3612 (2014).</li>
<li>Jacobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+Erythrocyte+Cell+Membrane+Scrambling+by+Mitotane%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 4 (33), 1516-1526 (2014).</li>
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<li>Repsold, L., Joubert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eryptosis%3A+An+Erythrocyte%27s+Suicidal+Type+of+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Eryptosis: An Erythrocyte's Suicidal Type of Cell Death.</a> Biomed Research International. 2018 (5), 9405617(2018).</li>
<li>Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+Binding+Properties+of+Human+Placental+Anticoagulant+Protein-I%2C+a+Member+of+the+Lipocortin+Family%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 7944-7949 (1989).</li>
<li>Andree, H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Vascular+Anticoagulant+%CE%B1+%28VAC%CE%B1%29+to+Planar+Phospholipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Binding of Vascular Anticoagulant α (VACα) to Planar Phospholipid Bilayers.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (9), 4923-4928 (1990).</li>
<li>Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+Affinity+and+Cooperativity+of+Annexin+V-Membrane+Binding+under+Conditions+of+Low+Membrane+Occupancy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy.</a> Analytical Biochemistry. 329 (1), 112-119 (2004).</li>
<li>Jiang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eryptosis+as+an+Underlying+Mechanism+in+Systemic+Lupus+Erythematosus-Related+Anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 40 (6), 1391-1400 (2016).</li>
<li>Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+and+Platelet+Proteomics+in+Hematological+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+-+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (4), 403-414 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Le but de cette procédure est de fournir des valeurs optimales pour la concentration d'ionophore, le temps de traitement, et la concentration extracellulaire de glucose, qui sont des facteurs importants en assurant l'induction réussie de l'éryptosis. Une étape critique dans le protocole est l'épuisement du glucose extracellulaire, qui, en dépit de son importance, n'a pas été suffisamment souligné dans la littérature. La teneur en sucre dans la solution Ringer normale (5 mM) a un effet inhibiteur sur l'éryptose. L'épuisem...

La mort cellulaire programmée dans les érythrocytes, également connu sous le nom d'éryptosis, est commune dans beaucoup d'conditions cliniques et de désordres hématologiques. L'éryptose est associée au rétrécissement cellulaire et à la perte d'asymétrie phospholipide dans la membrane plasmatique cellulaire1,2. La perte d'asymétrie entraîne la translocation de la phosphatidylserine (PS), un lipide normalement localisé dans le dépliant intérieur3,4, à la foliole externe de la cellule, qui signale aux macrophages de phagocytose et d'enlever les érythrocytes défectueux5,6,7,8. À la fin de la durée de vie normale des érythrocytes, l'ablation des cellules éryptotiques par macrophages assure l'équilibre des érythrocytes en circulation. Cependant, dans les conditions malades, telles que la drépanocytose et la thalassémie9,10,11, éryptose améliorée peut entraîner une anémie sévère2. En raison de son importance dans les maladies hématologiques, il y a un intérêt significatif dans l'examen des facteurs induisant ou inhibant l'éryptosis et les mécanismes moléculaires sous-jacents à ce processus.
La membrane plasmatique des érythrocytes sains est asymétrique, avec différents phospholipides localisés aux folioles extérieures et intérieures. L'asymétrie membranaire est principalement régulée par l'action des enzymes membranaires. La translocase aminophospholipide facilite le transport des aminophospholipides, ps et phosphatidylethanolamine (PE), en dirigeant ces lipides vers le foliole interne de la cellule. D'autre part, le floppase transporte la choline contenant des phospholipides, de la phosphatidylcholine (PC) et de la sphingomyéline (SM), de l'intérieur à la foliole externe de la membrane cellulaire12. Cependant, contrairement aux cellules saines, la membrane des érythrocytes éryptotiques est brouillée. Cela est dû à l'action d'une troisième enzyme, scramblase, qui perturbe l'asymétrie phospholipide en facilitant le transport bidirectionnel des aminophospholipides13,14,15,16. Scramblase est activé par des niveaux intracellulaires élevés de Ca2. Par conséquent, les ionophores de calcium, qui facilitent le transport de Ca2 à travers la membrane cellulaire12,sont des inducteurs efficaces de l'éryptose.
Ionomycin, un ionophore de calcium, a été largement utilisé pour induire l'éryptose dans les érythrocytes12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Ionomycin a à la fois des groupes hydrophiles et hydrophobes, qui sont nécessaires pour lier et capturer Ca2 ion, et le transporter à l'espace cytosolique27,28,29. Cela conduit à l'activation de la broussase et la translocation de PS à la foliole externe, qui peut être facilement détectée à l'aide de l'annexine-V, une protéine cellulaire avec une forte affinité à PS12. Bien que l'éryptose de déclenchement par ionomycine soit généralement rapportée, il y a l'écart considérable de méthode dans la littérature (tableau 1). La population d'érythrocytes subissant l'éryptosis dépend de différents facteurs tels que la concentration d'ionophore, le temps de traitement avec l'ionophore, et la teneur en sucre de l'environnement extracellulaire (l'épuisement de glucose active des canaux de cation et facilite l'entrée de Ca2 dans l'espace cytosolique)30,31. Cependant, il y a peu de cohérence dans ces facteurs dans la littérature, ce qui rend difficile d'effectuer l'éryptose reproductiblement in vitro.
Dans ce protocole, nous présentons une procédure étape par étape pour induire l'éryptosis dans les érythrocytes humains. Les facteurs affectant l'éryptose réussie, y compris la concentration de Ca2, la concentration d'ionophore, le temps de traitement, et la pré-incubation dans le tampon glucose-appauvri sont examinés et des valeurs optimales sont rapportées. Cette procédure démontre que la pré-incubation des érythrocytes dans un tampon sans glucose augmente considérablement le pourcentage d'éryptosis par rapport au tampon contenant du glucose. Ce protocole peut être utilisé en laboratoire pour produire des érythrocytes éryptotiques pour diverses applications.

<table><tbody><tr><td>Plaque 96 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-331</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V Alexa Fluor 488 - kit d’apoptose</td><td>Fisher Scientific</td><td>A10788</td><td>Stocker à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>BD FACSAria II Cytomètre en flux</td><td>BD Biosciences</td><td>643177</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Millipore Sigma</td><td>M7157</td><td>Modèle Eppendorf 5415C</td></tr><tr><td>Microscopie confocale à fluorescence</td><td>Zeiss, LSM Tek Thornwood</td><td></td><td>Modèle LSM 510, Laser Argon excité à 488 nm pour la prise d’images</td></tr><tr><td>Couverture lunettes cercles</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-100</td><td></td></tr><tr><td>Tube de cytométrie à flux rond jetable</td><td>VWR</td><td>VWRU47729-566</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>VWR Life Science</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Glucose monohydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0001745</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer (1 M)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-751-7290</td><td>Magasin au 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Ionomycine sel de calcium</td><td>EMD Milipore Corp.</td><td>407952-1MG</td><td>Dissoudre dans le DMSO pour atteindre 2 mM. Conserver à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P330-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-5</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope en verre</td><td>ordinaire Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>Synergy Lecteur de microplaques HFM</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sang total dans ACD</td><td>Zen-Bio</td><td></td><td>Store à 4 &deg ; C et chaud à 37 &deg ; C avant l’utilisation</td></tr></tbody></table>

induction de l'éryptose dans les globules rouges à l'aide d'un ionophore de calcium

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

L'éryptose, érythrocyte programmé la mort cellulaire, se produit dans un certain nombre de maladies hématologiques et pendant les dommages aux érythrocytes. Une caractéristique des cellules éryptotiques est la perte de l'asymétrie compositionnelle de la membrane cellulaire, conduisant à la translocation de la phosphatidylserine à la foliole externe de membrane. Ce processus est déclenché par une concentration intracellulaire accrue de Ca2,qui active la scramblase, une enzyme qui facilite le mouvement bidirectionnel des phospholipides entre les folioles membranaires. Compte tenu de l'importance de l'éryptose dans diverses conditions malades, il ya eu des efforts pour induire l'éryptose in vitro. Ces efforts ont généralement compté sur l'ionophore de calcium, l'ionomycine, pour augmenter la concentration intracellulaire de Ca2 et induire l'éryptosis. Cependant, beaucoup d'écarts ont été rapportés dans la littérature concernant la procédure pour induire l'éryptosis utilisant l'ionomycine. Ici, nous rapportons un protocole étape par étape pour l'éryptosis induit par l'ionomycine dans les érythrocytes humains. Nous nous concentrons sur les étapes importantes dans la procédure, y compris la concentration d'ionophore, le temps d'incubation, et l'épuisement de glucose, et fournissons le résultat représentatif. Ce protocole peut être utilisé pour induire une éryptose reproductible en laboratoire.

Optimisation de la concentration d'ionomycine
Tandis que l'ionomycine est exigée pour induire l'éryptosis, les concentrations accrues d'ionomycine peuvent mener à l'hémolyse (c.-à-d. lysis des érythrocytes et à la libération de l'hémoglobine), qui doit être évitée. Le traitement des érythrocytes avec 1 ionomycine m dans la solution Ringer pendant 2 h suffit à induire l'éryptose, comme en témoigne l'étiquetage ré...

Un protocole pour l'induction de l'éryptose, la mort cellulaire programmée dans les érythrocytes, utilisant l'ionophore de calcium, l'ionomycine, est fourni. L'éryptose réussie est évaluée en surveillant la phosphatidylserine de localisation dans le foliole externe de membrane. Les facteurs qui influent sur le succès du protocole ont été examinés et des conditions optimales ont été fournies.

Induction de l'éryptose dans les globules rouges à l'aide d'un ionophore de calcium

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...

Il y a eu beaucoup d’efforts pour induire l’éryptose utilisant l’ionomycine. Toutefois, la procédure exacte de ce processus n’est pas clairement décrite dans la littérature. Nous fournissons une procédure étape par étape pour induire l’éryptose utilisant l’ionomycine.Le principal avantage de cette procédure est d’induire l’éryptose chez les érythrocytes humains d’une manière fiable et reproductible. Pour commencer, ajouter 500 microlitres de sang entier froid dans le dextrose de citrate acide à un tube de microcentrifugeuse. Centrifuger le sang entier à 700 fois g pendant cinq minutes à température ambiante et enlever le plasma clair et la fine couche buffy à l’aide d’une pipette pour laisser la couche d’érythrocyte rouge.Préparez un litre de solution Ringer contenant du chlorure de sodium de 125 millimlaires, du chlorure de potassium millimolaire, un sulfate de magnésium millimolaire, 32 millimolaires hepes, cinq millimolaires de glucose et un chlorure de calcium millimolaire. Réglez le pH à 7,4 en ajoutant deux gouttes de microlitre d’un hydroxyde de sodium molaire. Pour préparer la solution Ringer sans glucose, suivez le même protocole mais n’incluez pas le glucose dans la solut

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Cette vidéo décrit un test in vitro visant à déterminer l’hémolyse induite par l’ionophore de calcium ou la lyse des globules rouges dans un échantillon humain. Le dosage mesure le pourcentage d’hémolyse en quantifiant l’hémoglobine libérée par les érythrocytes rompus.

Test d’hémolyse : une méthode in vitro pour mesurer la lyse induite par l’ionophore de calcium dans les érythrocytes humains

Dans cette vidéo, nous faisons la démonstration du test de liaison à l’Annexine V pour mesurer le degré d’éryptose, la mort cellulaire programmée par l’érythrocyte, à l’aide de la coloration fluorescente à l’Annexine V. Les érythrocytes apoptotiques présentent une translocation de la phosphatidylsérine de la feuille interne à la foliole externe de la membrane cellulaire, provoquant la liaison de l’annexine V marquée au fluorophore à la phosphatidylsérine transloquée, émettant ainsi un signal...

Dosage de la liaison à l’annexine V : une technique basée sur la fluorescence pour identifier les érythrocytes apoptotiques via le marquage à la phosphatidylsérine

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Dosage de l’influx de calcium pour mesurer l’absorption de calcium mitochondrial dans les cellules cultivées

Cette vidéo présente une technique de détection de la réponse locale et globale des ions calcium lors de l’infection à Shigella des cellules épithéliales humaines. Shigella envahit les cellules hôtes et libère des effecteurs d’invasion, ce qui a un impact sur les niveaux de calcium intracellulaire. L’amplitude et la fréquence du calcium cytosolique local et global sont étudiées à l’aide d’un indicateur fluorescent.

Une technique d’imagerie pour étudier la réponse calcique dans les cellules infectées par des bactéries

Cette vidéo analyse l’afflux de calcium induit par les récepteurs des lymphocytes T dans les lymphocytes T. Les anticorps anti-CD3 activent les voies de signalisation des lymphocytes T, entraînant une augmentation des ions calcium intracellulaires qui se lient au colorant Indo-1. En cytométrie en flux, un changement de spectre de l’état sans calcium à l’état lié au calcium est corrélé à l’afflux de calcium induit par les récepteurs des lymphocytes T.

Évaluation de l’afflux de calcium induit par les récepteurs des lymphocytes T à l’aide d’un colorant indicateur de calcium

Targeted-estérase induite colorant chargement (TED) appuie l'analyse de la dynamique intracellulaire des magasins de calcium par imagerie de fluorescence. La méthode se fonde sur le ciblage d'une carboxylestérase recombinant pour le réticulum endoplasmique (RE), où il améliore le démasquage locale de synthétique de faible affinité...

Imagerie directe du calcium ER avec Targeted-estérase colorant induit Chargement (TED)

Le calcium est impliqué dans de nombreuses voies de signalisation physiologiques et physiopathologiques. Imagerie des cellules vivantes nécessite un équipement spécialisé et peut prendre du temps. Une méthode simple et rapide à l'aide d'un cytomètre de flux pour déterminer les changements relatifs au calcium cytosolique dans les cellules épithéliales adhérentes mises en suspension a été optimisée.

Mesures de calcium cytosolique dans les cellules épithéliales rénales par cytométrie en flux

Actuellement, la plupart des indicateurs calciques disponibles sont utilisés pour quantifier les transitoires calciques cytoplasmiques en tant que mesures indirectes du calcium libéré par le réticulum sarcoplasmique dans les cellules musculaires lisses en culture. Ce protocole décrit l’utilisation d’un indicateur spécifique basé sur le FRET qui permet de mesurer directement les signaux calciques dans la lumière du réticulum sarcoplasmique.

Imagerie confocale à base de FRET mesure des fluctuations de calcium à l&#39;intérieur du réticulum sarcoplasmique de Cultured cellules musculaires lisses Utilisation

Ici, les méthodes utilisées pour étudier l’effet fonctionnel des mutations RYR1 exprimées de manière endogène dans les lymphocytes B humains immortalisés par le virus d’Epstein Barr et les cellules satellites dérivées de la biopsie musculaire différenciées en myotubes sont décrites.

Caractérisation fonctionnelle des variantes de RYR1 humaines exprimées de manière endogène

Le présent protocole décrit le contrôle et l’observation entièrement optiques de l’activité cellulaire déclenchée dans les cardiomyocytes dérivés des CSPi (CM-iPSC) pour le dépistage de médicaments à haut débit et les tests de toxicité. La quantification multi-paramétrique des modèles phénotypiques dans le temps et l’espace est montrée. Les effets à long terme des médicaments sur plusieurs heures, ou des mesures séquentielles sur plusieurs jours, sont démontrés.

Contrôle optique à haut débit et enregistrement du signal calcique dans les cardiomyocytes dérivés de l’iPSC pour les tests de toxicité et le criblage de médicaments phénotypiques

Cet article présente une méthode de surveillance quantitative en temps réel des concentrations d’ions calcium (Ca2+) dans les cellules à l’aide de l’imagerie unicellulaire Ca2+ avec le colorant Fura-2/AM. Cette technique permet un chargement efficace du colorant et un calcul précis des niveaux de Ca2+ grâce aux rapports d’intensité de fluorescence, ce qui en fait une approche simple et rapide pour les applications de recherche.

Imagerie calcique unicellulaire pour l’étude de l’activation des canaux ioniques calciques

Découvrez une méthode fiable pour induire l'éryptose dans les érythrocytes humains à l'aide d'ionomycine. Ce protocole permet d'évaluer la localisation de la phosphatidylsérine et facilite les recherches en biologie cellulaire.

Induction de l'éryptose dans les globules rouges à l'aide d'un ionophore de calcium

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