Name: Induzione delleriptosi nei globuli rossi utilizzando un ionoforo di calcio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Scopri come indurre l'eriptosi nei globuli rossi umani utilizzando l'ionomicina come ionoforo di calcio. Questo metodo affidabile e riproducibile consente di valutare la localizzazione della fosfatidilserina nella membrana cellulare.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH R15ES030140 e dalla concessione NSF CBET1903568. È stato riconosciuto anche il sostegno finanziario del Russ College of Engineering and Technology e del Department of Chemical and Biomolecular Engineering dell'Università dell'Ohio.

Tutti i campioni di sangue umano utilizzati nel protocollo descritto di seguito sono stati acquistati come campioni de-identificati. Nessun soggetto umano è stato direttamente coinvolto o reclutato per questo studio. Le linee guida della Dichiarazione di Helsinki dovrebbero essere utilizzate quando la ricerca coinvolge soggetti umani.
1. Isolamento degli eritrociti dal sangue intero
<ol><li>Aggiungere 500 l di sangue intero nel citrato acido dextrose (ACD) (conservato a 4 gradi centigradi) in un tubo di microcentrifuga. NOTA: Il sangue intero è stato acquistato in ACD. Secondo la società, 1,5 mL di ACD viene aggiunto a 7 mL di sangue intero (8,5 mL di volume totale).</li>
	<li>Centrifugare l'intero sangue a 700 x g per 5 min a temperatura ambiente (RT) e rimuovere il plasma chiaro e il sottile cappotto di buffy utilizzando una pipetta per lasciare lo strato di eritrociti rosso.</li>
	<li>Preparare 1 L di Ringer soluzione contenente 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 32 mM HEPES, 5 mM di glucosio, e 1 mM CaCl2. Regolare il pH a 7,4 aggiungendo 2 gocce di 1,0 M NaOH. Per preparare la soluzione Ringer senza glucosio, seguire lo stesso protocollo, ma non includere il glucosio nella soluzione.</li>
	<li>Lavare gli eritrociti 2x nella soluzione Ringer sospendendo il pellet cellulare in 1,5 mL di soluzione Ringer, centrifugeno a 700 x g per 5 min a RT e rimuovendo il supernatante.</li>
	<li>Fare un ematocrito dello 0,4% risuspendendo 40 ll l del pellet eritrocito in 9.960 l di soluzione Ringer senza glucosio per raggiungere un volume finale di 10 mL. NOTA: L'ematocrite è un termine usato per riferirsi alla frazione di volume degli eritrociti in sospensione. Un ematocrite dello 0,4% è una sospensione contenente lo 0,4% di eritrociti.</li>
	<li>Incubare la sospensione cellulare a 37 gradi centigradi per 7 giorni.</li>
</ol>2. Trattamento degli eritrociti con ionomycina e misurazione dell'emolisi
<ol><li>Sciogliere 1 mg di sale di calcio ionomycina in 630 l di zolfo dimetilo (DMSO) per raggiungere una concentrazione finale di 2 mM. Aliquota e conservare a -20 gradi centigradi.</li>
	<li>Prendere 1 mL dell'ematoctolo dello 0,4% dal punto 1,5 e aggiungere 0,5 luna di 2 mM ionomycin per raggiungere una concentrazione finale di 1 M. Incubazione per 2 h a 37 .<ol>
<li>Utilizzare 1 mL dell'ematocrito senza trattamento con ionomycina come controllo negativo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugare gli ematocriti trattati con ionomycina e non trattati a 700 x g per 5 min a RT, e rimuovere i loro supernatanti per lasciare i pellet cellulari nella parte inferiore dei tubi.</li>
	<li>Lavare le cellule 3x con la soluzione Ringer sospendendo i pellet cellulari in 1,5 mL di soluzione Ringer, centrifugeno a 700 x g per 5 min a RT e scartando i supernatanti.</li>
	<li>Per misurare l'emolisi, aggiungere 1 mL dell'ematocrito dello 0,4% non trattato dal punto 1,5 a un tubo di microcentrifuga e incubare per 2 h a 37 gradi centigradi come controllo negativo per l'emolisi (0%).</li>
	<li>Aggiungere 1 mL dell'ematocrito dello 0,4% non trattato dal punto 1,5 a un tubo di microcentrifuga e centrifugare a 700 x g per 5 min a RT. Rimuovere il supernatante e aggiungere 1 mL di acqua distillata al pellet cellulare e incubare per 2 h a 37 gradi centigradi come controllo positivo per l'emolisi (100%).</li>
	<li>Aggiungere 1 mL dell'ematocra trattato con ionomicina 0,4% dal punto 2.2 a un tubo di microcentrifuga.</li>
	<li>Centrifugare le cellule non trattate, le cellule trattate e le cellule in acqua distillata a 700 x g per 5 min a RT.</li>
	<li>Prendere 200 l dei supernatanti e aggiungere a una piastra di 96 pozze.</li>
	<li>Misurare l'assorbimento a 541 nm utilizzando un lettore di microplacche.</li>
	<li>Calcolare l'emolisi utilizzando l'equazione 132: %Emolisi (AT - A0)/(A100 - A0) dove A0 è l'assorbimento degli eritrociti nella soluzione Ringer, A100 è l'assorbimento degli eritrociti nell'acqua, e AT è l'assorbimento degli eritrociti trattati dalla ionomicina.</li>
</ol>3. Saggio vincolante allegato-V
<ol><li>Diluire 2 mL del buffer di associazione V allegato 5x in 8 mL di salina con buffer fosfato (PBS) per ottenere un buffer di rilegatura 1x.</li>
	<li>Risospendere i pellet cellulari trattati con ionomycina e non trattati dal passaggio 2.4 in 1 mL del buffer di rilegatura 1x.</li>
	<li>Prendere 235 l delle sospensioni cellulari nel cuscinetto di rilegatura e aggiungere 15 L di annessina V-Alexa Flour 488 coniugato.</li>
	<li>Incubare le cellule a RT per 20 min in un luogo buio. Centrifuga a 700 x g per 5 min a RT e rimuovere il supernatante.</li>
	<li>Lavare le celle 2x con buffer di rilegatura 1x, sospendendo il pellet cellulare in 1,5 mL del buffer di legame, centrifugeno a 700 x g per 5 min a RT e rimuovendo il supernatante.</li>
	<li>Risospendere i pellet cellulari in un buffer di rilegatura di 1x pari a 250 gradi per le misurazioni della citometria di flusso.</li>
</ol>4. Citometria di flusso
<ol><li>Trasferire 200 l degli eritrociti macchiati di annessa-V a 1 mL di tubi in polistirolo inferiore rotondi compatibili con la citometria di flusso.</li>
	<li>Accedi al software di citometria del flusso e fai clic sul pulsante del nuovo esperimento. Fare clic sul nuovo pulsante del tubo. Selezionare il foglio globale e scegliere l'analisi di applicazione per misurare l'intensità di fluorescenza con una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nm.</li>
	<li>Impostare il numero di celle su 20.000 da raccogliere per l'analisi FACS (Fluorescenza-attivata dall'ordinamento delle cellule).</li>
	<li>Selezionare il tubo desiderato e fare clic sul pulsante di carico. Fare clic sul pulsante registra per le misurazioni a dispersione in avanti e laterale. Ripetere l'operazione per tutti i campioni.</li>
	<li>Fare clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante del campione e fare clic su Applica analisi batch per generare il file dei risultati.</li>
	<li>Fare clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante campione e fare clic su Genera file FSC.</li>
	<li>Aggiungere i dati di citometria di flusso (file FSC) nell'area di lavoro del software di citometria di flusso.</li>
	<li>Analizzare i dati di controllo selezionando la popolazione cellulare di interesse e aggiungendo statistiche per il valore dell'eryptosis.<ol>
<li>Fare doppio clic sul controllo e selezionare l'istogramma rispetto all'intensità della fluorescenza.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante del cancello per disegnare un cancello sull'istogramma che indica la percentuale di eryptosi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Applicare le stesse statistiche per tutti gli altri tubi sperimentali per ottenere i valori di eryptosis. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul controllo e selezionare Copia analisi in gruppo.</li>
	<li>Dopo aver inserito correttamente tutti i campioni, trasferire i dati analizzati trascinandoli e rilasciandoli nell'editor di layout.<ol>
<li>Sovrapporre i dati analizzati con il controllo nell'editor di layout.</li>
		<li>Impostare gli istogrammi e le intensità desiderati modificando l'asse x e y dei grafici sovrapposti.</li>
		<li>Esportare i file di immagine facendo clic sul pulsante Esporta e salvare i grafici nella posizione desiderata.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Microscopia confocale
<ol><li>Trasferire 5 - L di cellule macchiate di annessione-V su un vetrino al microscopio e coprirlo con uno slittamento di copertura. Conservare in un luogo buio per evitare il fotosbiancamento.</li>
	<li>Utilizzare il laser Argon del microscopio a fluorescenza confocale per osservare le cellule eccitate a 488 nm con gli ingrandimenti desiderati. NOTA: Un microscopio confocale non è necessariamente necessario e qualsiasi microscopio con capacità di fluorescenza può essere utilizzato per ottenere immagini a fluorescenza che dimostrino un legame annesso-V.</li>
	<li>Ottenere immagini a fluorescenza del controllo (cellule non trattate) e cellule trattate. NOTA: Si prevede che le cellule non trattate mostrino segnali di fluorescenza molto deboli, mentre si prevede che le cellule trattate mostrino fluorescenza verde brillante sulle loro membrane.</li>
</ol>

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<li>Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-Dependent+Phospholipid+Scrambling+by+TMEM16F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium-Dependent Phospholipid Scrambling by TMEM16F.</a> Nature. 468 (7325), 834-838 (2010).</li>
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<li>Chandra, R., Joshi, P. C., Bajpai, V. K., Gupta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Phospholipid+Organization+in+Calcium-Loaded+Human+Erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane Phospholipid Organization in Calcium-Loaded Human Erythrocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 902 (2), 253-262 (1987).</li>
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<li>Jacobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+Erythrocyte+Cell+Membrane+Scrambling+by+Mitotane%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stimulation of Erythrocyte Cell Membrane Scrambling by Mitotane.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 4 (33), 1516-1526 (2014).</li>
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<li>Ghashghaeinia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Erythrocyte+Age+on+Eryptosis%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">The Impact of Erythrocyte Age on Eryptosis.</a> British Journal of Haematology. 157 (5), 1365(2012).</li>
<li>Repsold, L., Joubert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eryptosis%3A+An+Erythrocyte%27s+Suicidal+Type+of+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Eryptosis: An Erythrocyte's Suicidal Type of Cell Death.</a> Biomed Research International. 2018 (5), 9405617(2018).</li>
<li>Tait, J. F., Gibson, D., Fujikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+Binding+Properties+of+Human+Placental+Anticoagulant+Protein-I%2C+a+Member+of+the+Lipocortin+Family%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid Binding Properties of Human Placental Anticoagulant Protein-I, a Member of the Lipocortin Family.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 7944-7949 (1989).</li>
<li>Andree, H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Vascular+Anticoagulant+%CE%B1+%28VAC%CE%B1%29+to+Planar+Phospholipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Binding of Vascular Anticoagulant α (VACα) to Planar Phospholipid Bilayers.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (9), 4923-4928 (1990).</li>
<li>Tait, J. F., Gibson, D. F., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+Affinity+and+Cooperativity+of+Annexin+V-Membrane+Binding+under+Conditions+of+Low+Membrane+Occupancy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of the Affinity and Cooperativity of Annexin V-Membrane Binding under Conditions of Low Membrane Occupancy.</a> Analytical Biochemistry. 329 (1), 112-119 (2004).</li>
<li>Jiang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eryptosis+as+an+Underlying+Mechanism+in+Systemic+Lupus+Erythematosus-Related+Anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Eryptosis as an Underlying Mechanism in Systemic Lupus Erythematosus-Related Anemia.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 40 (6), 1391-1400 (2016).</li>
<li>Chakrabarti, A., Halder, S., Karmakar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+and+Platelet+Proteomics+in+Hematological+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+-+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte and Platelet Proteomics in Hematological Disorders.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (4), 403-414 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'obiettivo di questa procedura è quello di fornire valori ottimali per la concentrazione di ionoforo, il tempo di trattamento e la concentrazione di glucosio extracellulare, che sono fattori importanti per garantire una corretta induzione di eriptosi. Un passo critico nel protocollo è l'esaurimento del glucosio extracellulare, che, nonostante la sua importanza, non è stato sufficientemente sottolineato nella letteratura. Il contenuto di zucchero nella normale soluzione Ringer (5 mM) ha un effetto inibitorio sull'eryptos...

La morte cellulare programmata negli eritrociti, nota anche come eriptosi, è comune in molte condizioni cliniche e disturbi ematologici. L'eryptosi è associata al restringimento cellulare e alla perdita di asimmetria fosfolipidide nella membrana plasmatica cellulare1,2. La perdita di asimmetria provoca la traslocazione della fosfatidiladila (PS), un lipido normalmente localizzato nell'opuscolo interno3,4, nel volantino esterno della cellula, che segnala ai macrofagi di fagocitosi e rimuove gli eritrociti difettosi5,6,7,8. Alla fine della normale durata della vita degli eritrociti, la rimozione delle cellule eriftotiche dai macrofagi garantisce l'equilibrio degli eritrociti in circolazione. Tuttavia, in condizioni di malattia, come la malattia delle cellule falciformi e talassemia9,10,11, una maggiore eryptosi può provocare anemia grave2. A causa della sua importanza nelle malattie ematologiche, c'è un interesse significativo nell'esaminare i fattori che inducono o inibiscono l'eryptosi e i meccanismi molecolari alla base di questo processo.
La membrana plasmatica di eritrociti sani è asimmetrica, con diversi fosfolipidi che si localizzano nei volantini esterni e interni. L'asimmetria della membrana è regolata principalmente dall'azione degli enzimi della membrana. La translocasi aminofosofilidi consente il trasporto di aminoofosbantidi, PS e fosfatidylethanolamina (PE), indirizzando questi lipidi al foglietto interno della cellula. D'altra parte, il floppase trasporta la colina contenente fosfolipidi, fosfatidilcolina (PC) e sphingomyelin (SM), dal volantino interno a quello esterno della membrana cellulare12. Tuttavia, a differenza delle cellule sane, la membrana degli eritrociti erittoticiti è strapazzata. Ciò è dovuto all'azione di un terzo enzima, la scramblase, che interrompe l'asimmetria fosfolipidi facilitando il trasporto bidirezionale degli aminoofolipidi13,14,15,16. La Scramblase viene attivata da livelli intracellulari elevati di Ca2. Pertanto, gli ionofori di calcio, che facilitano il trasporto di Ca2 o attraverso la membrana cellulare12, sono efficienti induttori di eriptosi.
Ionomycin, un ionoforo di calcio, è stato ampiamente utilizzato per indurre eryptosi in eritrocites12,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. L'ionomicina ha sia gruppi idrofili che idrofobici, che sono necessari per legare e catturare gli ioni Ca2 e trasportarlo nello spazio citosolico27,28,29. Questo porta all'attivazione della scramblase e alla traslocazione di PS al volantino esterno, che può essere facilmente rilevato utilizzando l'allegato-V, una proteina cellulare ad alta affinità con PS12. Sebbene sia comunemente riportata l'eriptosi mediante ionomycina, vi è una notevole discrepanza di metodi nella letteratura (Tabella 1). La popolazione di eritrociti sottoposti a eriptosi dipende da diversi fattori come la concentrazione di ionoforo, il tempo di trattamento con l'ionoforo e il contenuto di zucchero dell'ambiente extracellulare (l'esaurimento del glucosio attiva i canali di cation e facilita l'ingresso di Ca2, nello spazio citoco)30,31. Tuttavia, c'è poca coerenza in questi fattori nella letteratura, rendendo difficile eseguire l'eryptosi riproducibilmente in vitro.
In questo protocollo, presentiamo una procedura passo-passo per indurre l'eriptosi negli eritrociti umani. Vengono esaminati i fattori che influiscono sul successo dell'eryptosi, tra cui la concentrazione di Ca2o, la concentrazione di ionoforo, il tempo di trattamento e la pre-incubazione nel buffer impoverito di glucosio e vengono riportati valori ottimali. Questa procedura dimostra che la pre-incubazione degli eritrociti in un buffer privo di glucosio aumenta significativamente la percentuale di eryptosi rispetto al buffer contenente glucosio. Questo protocollo può essere utilizzato in laboratorio per produrre eritrociti eritotici per varie applicazioni.

<table><tbody><tr><td>piastra a 96 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-331</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V Alexa Fluor 488 - kit per apoptosi</td><td>Fisher Scientific</td><td>A10788</td><td>Conservare a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>BD FACSAria II citometro a flusso</td><td>BD Biosciences</td><td>643177</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Millipore Sigma</td><td>M7157</td><td>Modello Eppendorf 5415C</td></tr><tr><td>Microscopia a fluorescenza confocale</td><td>Zeiss, LSM Tek Thornwood</td><td></td><td>Modello LSM 510, Laser ad argon eccitato a 488 nm per scattare immagini</td></tr><tr><td>Copertina Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-545-100</td><td></td></tr><tr><td>Provetta monouso per citometria a fondo tondo</td><td>VWR</td><td>VWRU47729-566</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>VWR Life Science</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio monoidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0001745</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer (1 M)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-751-7290</td><td>Negozio a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Ionomicina sale di calcio</td><td>EMD Milipore Corp.</td><td>407952-1MG</td><td>Sciogliere in DMSO per raggiungere 2 mM. Conservare a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P330-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-5</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio in vetro semplice</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>Synergy Lettore di micropiastre HFM</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sangue intero in ACD</td><td>Zen-Bio</td><td></td><td>Store a 4 gradi C e caldo a 37 gradi C prima dell'uso</td></tr></tbody></table>

induzione dell'eriptosi nei globuli rossi utilizzando un ionoforo di calcio

Induction of Eryptosis in Red Blood Cells Using a Calcium Ionophore

L'eriptosi, l'eritrocito morto cellulare programmato, si verifica in una serie di malattie ematologiche e durante la lesione agli eritrociti. Un segno distintivo delle cellule eriptotiche è la perdita di asimmetria compositiva della membrana cellulare, che porta alla traslocazione della fosfatidilanella nel volantino esterno della membrana. Questo processo è innescato da una maggiore concentrazione intracellulare di Ca2 ,che attiva la scramblase, un enzima che facilita il movimento bidirezionale dei fosfolipidi tra volantini a membrana. Data l'importanza dell'eriptosi in varie condizioni malate, ci sono stati sforzi per indurre l'eriptosi in vitro. Tali sforzi si sono generalmente affidati all'ionoforo di calcio, la ionomycina, per migliorare la concentrazione intracellulare di Ca2 e indurre l'eriptosi. Tuttavia, molte discrepanze sono state segnalate nella letteratura per quanto riguarda la procedura per indurre l'eryptosi utilizzando ionomycina. Qui, riportiamo un protocollo passo-passo per l'eriptosi indotta da ionomicina negli eritrociti umani. Ci concentriamo su importanti passi nella procedura, tra cui la concentrazione di ionoforo, il tempo di incubazione e l'esaurimento del glucosio e forniamo risultati rappresentativi. Questo protocollo può essere utilizzato per indurre riproducibilmente l'eryptosi in laboratorio.

Ottimizzazione della concentrazione di ionomycina
Mentre l'iononomicina è necessaria per indurre l'eriptosi, l'aumento delle concentrazioni di ionomycina può portare all'emolisi (cioè la lisi degli eritrociti e il rilascio di emoglobina), che deve essere evitata. Il trattamento degli erittrociti con 1 .M ionomycin soluzione per 2 h è sufficiente per indurre l'eryptosi, come dimostra l'etichettatura di successo c...

Viene fornito un protocollo per l'induzione dell'eriptosi, la morte cellulare programmata negli eritrociti, utilizzando l'ionoforo di calcio, la ionomycina. L'eryptosi di successo viene valutata monitorando la fosfatidilaserina di localizzazione nel foglietto illustrativo esterno della membrana. Sono stati esaminati i fattori che influiscono sul successo del protocollo e sono state fornite condizioni ottimali.

Induzione dell'eriptosi nei globuli rossi utilizzando un ionoforo di calcio

Eryptosis, erythrocyte programmed cell death, occurs in a number of hematological diseases and during injury to erythrocytes. A hallmark of eryptotic ...

Ci sono stati molti sforzi per indurre l'erioptosi usando la ionomicina. Tuttavia, la procedura esatta per questo processo non è chiaramente delineata nella letteratura. Forniamo una procedura passo-passo per indurre l'erioptosi usando l'ionomicina.Il principale vantaggio di questa procedura è quello di indurre l'erioptosi negli eriociti umani in modo affidabile e riproducibile. Per iniziare, aggiungere 500 microlitri di sangue intero freddo in destrosio citrato acido a un tubo di microcentrifugo. Centrifugare il sangue intero a 700 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente e rimuovere il plasma chiaro e il sottile mantello di buffy usando una pipetta per lasciare lo strato di eriocite rosso.Preparare un litro di soluzione ringer contenente 125 cloruro di sodio millimolare, cinque cloruri millimolare di potassio, un solfato di magnesio millimolare, 32 HEPES millimolare, cinque millimolare di glucosio e un cloruro di calcio millimolare. Regolare il pH a 7,4 aggiungendo due gocce di microlitero di un idrossido di sodio molare. Per preparare la soluzione Ringer senza glucosio, seguire lo stesso protocollo ma non includere il glucosio nella soluzione.Lavare gli erytrociti due vo

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Il reticolo endoplasmatico svolge un ruolo chiave nella biogenesi di proteine ​​e di omeostasi del calcio. Abbiamo stabilito un sistema sperimentale che ci permette di affrontare il ruolo di canali Ca2 + perdite e caratterizzare i meccanismi putativi regolamentazione. Questo sistema comporta silenziamento genico mediato siRNA e cellule vive Ca2 + imaging.

Vivere Imaging calcio cella Combinato con il silenziamento del gene mediata siRNA Identifica Ca 2 + Canali di perdite nella membrana ER e nei relativi meccanismi regolatori

Questo video descrive un test in vitro per determinare l'emolisi indotta da calcio-ionoforo o la lisi dei globuli rossi in un campione umano. Il test misura la percentuale di emolisi quantificando l'emoglobina rilasciata dagli eritrociti rotti.

Saggio di emolisi: un metodo in vitro per misurare la lisi indotta da ionoforo di calcio negli eritrociti umani

In questo video, dimostriamo il test di legame dell'annessina V per misurare il grado di eriptosi, la morte cellulare programmata degli eritrociti, utilizzando la colorazione fluorescente con annessina V. Gli eritrociti apoptotici dimostrano la traslocazione della fosfatidilserina dal lembo interno a quello esterno della membrana cellulare, facendo sì che l'annessina V marcata con fluoroforo si leghi alla fosfatidilserina traslocata, emettendo così un segnale fluorescente.

Saggio di legame dell'annessina V: una tecnica basata sulla fluorescenza per identificare gli eritrociti apoptotici tramite marcatura della fosfatidilserina

Questo video descrive un test basato sull'imaging al microscopio confocale per misurare l'assorbimento di calcio mitocondriale nelle cellule in coltura. Il test utilizza il colorante fluorescente sensibile al calcio Rhod-2/AM per misurare il calcio mitocondriale in cellule coltivate permeabilizzate.

Saggio dell'afflusso di calcio per misurare l'assorbimento mitocondriale di calcio nelle cellule in coltura

Questo video dimostra una tecnica per rilevare la risposta locale e globale degli ioni calcio all'infezione da Shigella di cellule epiteliali umane. La shigella invade le cellule ospiti e rilascia effettori di invasione, influenzando i livelli di calcio intracellulare. L'ampiezza e la frequenza del calcio citosolico locale e globale sono studiate utilizzando un indicatore fluorescente.

Una tecnica di imaging per studiare la risposta al calcio nelle cellule infettate da batteri

Questo video analizza l'afflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T nelle cellule T. Gli anticorpi anti-CD3 attivano le vie di segnalazione delle cellule T, portando ad un aumento degli ioni calcio intracellulari che si legano con il colorante Indo-1. Nella citometria a flusso, uno spostamento dello spettro dallo stato privo di calcio allo stato legato al calcio è correlato all'afflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T.

Valutazione dell'afflusso di calcio indotto dal recettore delle cellule T utilizzando un colorante indicatore di calcio

Mirata-esterasi indotta colorante di caricamento (TED) supporta l'analisi delle dinamiche di calcio intracellulare negozio di imaging di fluorescenza. Il metodo basa sul targeting di un carbossilesterasi ricombinante al reticolo endoplasmatico (ER), dove migliora la smascheramento locale di sintetico a bassa affinità...

Imaging diretta di calcio ER con Targeted-esterasi Induced Loading Dye (TED)

Attualmente, la maggior parte degli indicatori di calcio disponibili vengono utilizzati per quantificare i transitori citoplasmatici del calcio come misure indirette del calcio rilasciato dal reticolo sarcoplasmatico in cellule muscolari lisce in coltura. Questo protocollo descrive l'uso di uno specifico indicatore basato su FRET che consente la misurazione diretta dei segnali di calcio all'interno del lume del reticolo sarcoplasmatico.

Misura di fluttuazioni calcio all&#39;interno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale

Qui vengono descritti i metodi utilizzati per studiare l'effetto funzionale delle mutazioni RYR1 endogenamente espresse nel virus di Epstein Barr immortalato nei linfociti B umani e nelle cellule satelliti derivate dalla biopsia muscolare differenziate in miotubi.

Caratterizzazione funzionale di varianti RYR1 umane espresse endogenamente

Il presente protocollo descrive il controllo completamente ottico e l'osservazione dell'attività cellulare innescata nei cardiomiociti derivati da iPSC (iPSC-CM) per lo screening dei farmaci ad alto rendimento e i test di tossicità. Viene mostrata la quantificazione multiparametrica dei modelli fenotipici nel tempo e nello spazio. Vengono dimostrati gli effetti a lungo termine dei farmaci nell'arco delle ore o delle misurazioni sequenziali nei giorni.

Controllo ottico ad alta produttività e registrazione del segnale di calcio nei cardiomiociti derivati da iPSC per test di tossicità e screening fenotipico dei farmaci

Questo articolo presenta un metodo per il monitoraggio quantitativo in tempo reale delle concentrazioni di ioni calcio (Ca2+) nelle cellule utilizzando l'imaging Ca2+ a singola cellula con il colorante Fura-2/AM. Questa tecnica consente un caricamento efficiente del colorante e un calcolo accurato dei livelli di Ca2+ attraverso i rapporti di intensità della fluorescenza, rendendola un approccio semplice e rapido per le applicazioni di ricerca.

Imaging del calcio a singola cellula per lo studio dell'attivazione dei canali ionici del calcio

Scopri come indurre l'eriptosi nei globuli rossi umani utilizzando l'ionomicina come ionoforo di calcio. Questo metodo affidabile e riproducibile consente di valutare la localizzazione della fosfatidilserina nella membrana cellulare.

Induzione dell'eriptosi nei globuli rossi utilizzando un ionoforo di calcio

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