This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
PeptiQuick, een in één stap incorporatie van membraan eiwitten in Biotinylated Peptidiscs voor gestroomlijnde eiwit binding assays
Chapters
Summary November 2nd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
We presenteren een methode die membraan eiwit zuivering en reconstitutie in peptidiscs combineert in een enkele chromatografische stap. Biotinyated steigers worden gebruikt voor directe oppervlakte bevestiging en meting van eiwit-ligand interacties via biolayer interferometrie.
Transcript
De klassieke methode waarbij membraaneiwitten voor hun studie worden geëxtraheerd is door eenvoudige oplosmiddel in wasmiddel. Hoewel dit een eenvoudige en universele methode biedt, is aangetoond dat detergentia de oorspronkelijke structuur, functie en activiteit van deze gevoelige eiwitten veranderen. Hier presenteren we de Peptidisc als een oplossing voor het stabiliseren van membraaneiwitten in wasmiddelvrije oplossing.
Het Peptidisc-systeem past zich spontaan aan de grootte, vorm en typologie van talloze membraaneiwitten aan. Dit staat in tegenstelling tot andere membraan mimetics die vaak vervelende optimalisatie vereisen. FhuA, een E.coli buitenste membraan eiwit, zal worden gebruikt als een model doel eiwit te worden gereconstrueerd in dit protocol.
Buitenste membraansikels zullen worden geïsoleerd, gevolgd door de toevoeging van wasmiddel om de membraaneiwitten op te vangen. De Peptidisc peptide wordt toegevoegd aan de oplosmiddel en wasmiddel wordt verdund, spontaan vormen Peptidisc deeltjes. Deze gestabiliseerde oplosbare deeltjes zijn nu vatbaar voor tal van downstream toepassingen.
Dit protocol zal bio-laag interferometrie onderzoeken als een toepassing van de Peptidisc-technologie. Dit protocol zal zich richten op de PeptiQuick reconstitutie methode, een nuttige techniek die de gelijktijdige zuivering en reconstructie van membraaneiwitten vergemakkelijkt. De PeptiQuick methode van on-beads reconstitutie wordt uitgevoerd in een standaard Nickel-NTA IMAC zwaartekracht kolom vooraf geëquilibreerd in wasmiddel.
Het oplosbaar membraan wordt op de hars geladen en niet-doeleiwitten worden weggespoeld. Hierna wordt dit peptide aan de kolom toegevoegd en wordt het wasmiddel snel verdund. De hydrofobe kant van de Peptide Peptide associeert met de blootgestelde hydrofobe gebieden.
De hydrofiele kant van het peptide houdt het eiwit oplosbaar in oplossing. Overtollig peptide wordt weggespoeld. Imidazole wordt toegevoegd aan de gereconstrueerde woede te ontwijken.
De Peptidisc steiger kan worden gefunctionaliseerd om indirect label geheugen eiwitten en dus de deur openen naar een bredere set van downstream-analyses. Hier exploiteren we het biotinylated peptide voor gehechtheid aan streptavidin gecoate sensoren voor BLI-analyse. Bio-layer interferometrie is een krachtige labelvrije techniek voor het onderzoeken van biomoleculaire interacties in oplossingen.
Naast het simpelweg aantonen van interacties, geeft deze techniek een real-time kinetische uitlezing en maakt het de berekening van een bindende dissociatieconstante mogelijk. Door middel van dit protocol elimineren we de noodzaak van wasmiddel tijdens de BLI-analyse, omdat dit de activiteit kan veranderen. Biolayer interferometrie analyseert de interferentie passeren van wit licht gereflecteerd van de sensor, of tip, en gebonden macromoleculen tijdens een interactie.
Om de interacties te meten, wordt de zinstip doorgegeven tussen oplossingen en het signaal dat bij elke stap wordt geregistreerd. Elke tip geeft dan zijn eigen sporen op een sensogram. Ten eerste wordt alleen een basislijn van buffer vastgesteld.
Ten tweede is de ligand gebonden. In dit geval binden FhuA en biotinylated Peptidiscs een gestrooide tip. Vervolgens wordt de tip gewassen in buffer om een niet-gebonden FhuA te verwijderen.
Nu is de tip verplaatst naar een oplossing met een bekende concentratie van analyt, hier ColM. Als er een interactie optreedt, geeft dit een bindende curve. Ten slotte wordt de tip verplaatst naar buffer en de dissociatie gemeten.
De waargenomen percentages voor associatie en dissociatie bij elke kolomconcentratie kunnen worden gebruikt om de dissociatieconstante te berekenen. Hexahistidine gelabeld FhuA wordt uitgedrukt in E-coli stam AW740 voor 18 uur in amine media. De bacteriën worden geoogst door centrifugatie bij 5.000 G's 10 minuten bij vier graden Celsius.
De resulterende celpellet wordt opnieuw opgehangen in de TSG-buffer en vervolgens getunced om cellulaire klonten te breken en een grondige lyse te garanderen. TMSF wordt toegevoegd aan de opnieuw opgehangen cellen aan een laatste concentratie van een millimolar net voor lysis. Cellyse wordt bereikt door drie passages door middel van een microfluidizer op 15,000 PSI of een Franse pers op 8.000 PSI.
De lysed cellen worden verzameld en een lage snelheid centrifugatie op 5, 000 G's gedurende 10 minuten op vier graden wordt uitgevoerd. Een supernatant van de slow-speed spin wordt geladen in een TI70 ultracentrifuge rotor en centrifuged op 200, 000 G's gedurende 40 minuten op vier graden om de ruwe E.coli membraan pellet. Na ultracentrifugatie wordt de supernatant weggegooid en wordt de ruwe membraanpel weer opgehangen in een minimale hoeveelheid TSG-buffer.
Een ruw membraan wordt geheronced om de homogeniteit te garanderen. Een Bradford Assay wordt uitgevoerd om de eiwitconcentratie van het opnieuw opgehangen ruwe membraan te controleren. TSG buffer wordt gebruikt om het ruwe membraan te verdunnen tot ongeveer drie milligram per milliliter voorafgaand aan oplosvorming.
Triton X-100 wordt toegevoegd aan het opnieuw opgehangen ruwe membraan bij een uiteindelijke concentratie van 1%om het bacteriële binnenmembraan selectief op te raken. Solubilisatie wordt uitgevoerd voor een uur op vier graden, met zachte schommelen. Het niet-oplosbaar buitenste membraan wordt geïsoleerd door ultracentrifugatie bij 200,000 G's gedurende 40 minuten, op vier graden.
De resulterende supernatant met het oplosbaar binnenmembraan wordt weggegooid. Terwijl de pellet, die het buitenste membraan bevat, opnieuw wordt opgehangen zoals voorheen in TSG. LDAO wordt toegevoegd aan een laatste concentratie van 1% aan het opnieuw opgehangen buitenste membraan, en oplos gedurende een uur op vier graden.
Ten slotte wordt een ultracentrifugatie uitgevoerd, zoals voorheen, om onoplosbaar materiaal te pelleteren. De resulterende supernatant bevat oplosbaar buitenmembraan, met inbegrip van ons doel, zijn-tagged FhuA, nu klaar voor gelijktijdige IMAC zuivering en Peptidisc reconstitutie. Een Nickel-NTA IMAC zwaartekrachtkolom is vooraf geëquilibreerd met twee kolomvolumes IMAC-wasbuffer.
Imidazool wordt toegevoegd met een uiteindelijke concentratie van vijf millimolar aan het oplosbaar buitenste membraan, verdund tot 0,04%LDAO. Het oplosbaar buitenste membraan wordt geladen op de Nickel-NTA hars, en de stroom door verzameld. Deze stroom door wordt herladen op de hars om de hars binding van FhuA te verhogen.
Na het laden wordt de hars gewassen met 250 milliliter IMAC wasbuffer en de eerste 50 milliliter verzameld. Na het wassen wordt de wasbuffer afgevoerd tot net boven de hoogte van het harsbed en de kolomstopcock gesloten. Een milliliter geconcentreerd, 10 milligram per milliliter, Peptide Peptide peptide wordt toegevoegd aan de kolom.
Na de toevoeging van geconcentreerd peptide, 50 milliliter verdund, een milligram per milliliter, peptide Peptide Peptide in TSG wordt toegevoegd. De hars wordt geroerd om de kralen opnieuw op te schorten in TSG, onder de CMC van LDAO, waardoor Peptidisc-deeltjes worden gevormd. Na Peptidisc vangen, de hars is toegestaan om te vestigen en de een milligram per milliliter peptide oplossing wordt afgevoerd via de hars.
De hars wordt gewassen met 50 milliliter TSG om overtollig Peptide Peptide te verwijderen. Ten slotte worden de Peptidisc-deeltjes verdund met 50 milliliter van 600 millimolar imidazool in TSG. Een milliliter fracties worden verzameld en 10 microliter van 0,5 molaire EDTA wordt toegevoegd, een belangrijk licht uitloogde nikkelionen.
De start, flow through, wassen, en ontgaan fracties worden geladen op een 12%SDS gel en elektrophorezed gedurende 30 minuten op 60 milliampère. De gel is gekleurd en gevisualiseerd op een gelscanner. De resulterende gel toont uitputting van FhuA in de stroom door, en verrijking in de elutie.
Kleine verontreinigingsbanden worden ook waargenomen in de ontweken fracties. De fracties drie tot en met zeven worden geselecteerd voor grootteuitsluitingschromatografie om FhuA Peptidisc oplosbaarheid en afbrekende verontreinigingen te bevestigen. Een 30 Kilodome afgesneden centrifugale concentrator wordt gebruikt om fracties drie tot zeven te concentreren.
Een milliliter van de gepoolde IMAC elusie fracties wordt geïnjecteerd op de S200 kolom met een stroomsnelheid van 0,25 milliliter per minuut in TSG buffer. Een milliliter fracties worden verzameld en een 12%SDS gel van de fracties wordt uitgevoerd. De relevante fracties worden samengevoegd en kunnen nu worden gebruikt in downstreamtoepassingen.
BLI werd uitgevoerd in een ForteBio Octet RED96. Dit instrument beweegt BLI pinnen over een 96 put plaat die eerst met de hand wordt opgezet. Alle putten zijn gevuld tot een uiteindelijk volume van 200 microliters.
Kolom één is geladen met kinetiekbuffer om de uiteinden toe te staan om te equilibrate en een basislijnsignaal te vormen. Kolom twee is geladen met een vooraf bepaalde concentratie van de ligand- en kinetiekbuffer. In dit geval is FhuA de ligand en wordt toegevoegd aan de concentratie van 2,5 microgram per milliliter.
De tip in rij E wordt als referentie gebruikt en wordt alleen geladen met buffer. Kolom drie is geladen met kinetiek buffer om overtollige FhuA wassen van de tip. Tweevoudige seriële verdunningen van de analyt, in dit geval ColM, wordt geladen van boven naar beneden in kolom vier.
De hoogste van deze concentraties wordt gebruikt voor de referentierij, om te meten voor niet-specifieke binding van de analyt aan de punt. Kolom vijf is geladen met buffer. Hier zal de ColM zich distantiëren, en de dissociatie gemeten.
Zodra de plaat is voorbereid, worden de sensor-tip lade en de voorbereide plaat in het BLI-instrument geladen. De BLI data acquisition software wordt geopend en er wordt een nieuw kinetisch experiment gestart. Het tabblad Plate Definition wordt gebruikt om de lay-out van de 96-putplaat in de software in te voeren.
Hier wordt de ligand FhuA ingevoerd als de belasting, terwijl de analyt ColM wordt ingevoerd als het monster. Het tabblad Testdefinitie wordt gebruikt om de tijds- en plaatrotatiesnelheid voor elke stap in het experiment te definiëren. Hier nemen we een baseline stap van 60 seconden, gevolgd door een laadstap van 250 seconden, een tweede baseline stap van 300 seconden, een analyt associatie stap van 450 seconden, en ten slotte een dissociatie stap van 900 seconden.
Deze stappen worden individueel toegewezen aan elke kolom in de 96-putplaat door de gewenste stap te selecteren en met de rechtermuisknop op de test toevoegen in elke kolom te klikken. Het tabblad sensortoewijzing wordt gebruikt om ervoor te zorgen dat het Octet-instrument BLI-pinnen van de juiste locatie in de sensorlade haalt. Het tabblad Experiment controleren geeft een definitief overzicht van het experiment voordat het wordt uitgevoerd.
BLI zal nu worden uitgevoerd door het Octet RED. Dit zal een ruwe data sensogram voor analyse te produceren. De analyse wordt uitgevoerd door eerst de Octet biodata analyse software te openen.
Het tabblad Gegevensselectie wordt gebruikt om het experiment te lokaliseren en het experimentele overzicht te controleren. De concentraties van de analyt ColM zijn hier input. Vervolgens wordt het tabblad Verwerken gebruikt om het referentiesignaal af te trekken van de experimentele gegevens.
De basislijn wordt gedefinieerd om de Y-as uit te lijnen alsof de delegeringssnelheid is toegepast. Ten slotte wordt procesgegevens geselecteerd. De gegevens zijn geïsoleerd voor dit experiment en Fit Curves is geselecteerd.
Er wordt gekozen voor een gedeeltelijke associatie en dissociatiecurvemontage. De Kd wordt berekend op basis van deze fitting. De grootte uitsluiting chromatogram wordt gebruikt om de heropbouw van de ambute te valideren.
Het chromatogram vertoont een enkele symmetrische piek, wat wijst op een monodisperse eiwitpreparaat. De piek elutes enkele milliliter na de leegte volume, wat wijst op niet-geaggregeerde oplosbare Peptidisc deeltjes. Eiwit aggregaten zal elute op de leegte volume, terwijl overtollige detergenten en peptide zal elute na de belangrijkste piek.
Verhoogde wassen van de gevormde Peptidiscs, terwijl nog steeds gehecht aan de Nickel-NTA kralen moeten afbreken deze laatste piek. Eiwit aggregaten zijn vaak een gevolg van het blootstellen van geheugen eiwitten aan wasmiddel vrije oplossing voorafgaand aan de reconstructie. Dit laatste uitsluitingschromatogram is een nuttige diagnose voor het oplossen van een reconstructie.
Na verwerking van de experimentele gegevens is een curve geschikt voor het sensogram. De nauwkeurigheid van deze fitting is essentieel voor de berekening van de dissociatieconstante. De restweergaveplot beschrijft het verschil tussen de experimentele gegevens en de computationele fitting.
Hieruit blijkt dat voor de vier verschillende kolomconcentraties drie van de rondingen goed passen. Echter, voor de hoogste concentratie de curve produceert niet een goede pasvorm. Dit suggereert dat bij deze hogere concentratie, is er heterogene binding van kolom aan de pin.
Dit hoogste concentratiesignaal wordt dus niet opgenomen uit de kinetische analyse volgens de ForteBio-toepassingsnotities. De overige drie krommen worden gebruikt voor de kinetische analyse. Een dissociatieconstante tussen FhuA en ColM, bepaald met behulp van de BLI- en Peptidisc-methode, komt overeen met constanten die door andere methoden worden bepaald.
Isothermale calorimetrie en nanodiscs, en microschaal thermoforese en Peptidisc leverde dissociatie constanten niet significant verschillen van onze bepaalde waarde. Deze consistentie valideert de Peptidisc BLI-methode voor het meten van interactiekinetiek. Na het bekijken van deze video hopen we dat je een praktisch inzicht hebt gekregen in de kracht en het voorbehoud van de PeptiQuick methoden.
We hebben deze methode bijzonder nuttig gevonden voor het kwantificeren van de FhuA ColM interactie in de volledige afwezigheid van detergentia. En we vermoeden dat dezelfde workflow kan worden toegepast om elke andere receptor-ligand interactie te karakteriseren. Succes met je experimenten.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
