Name: Visualisatie en analyse van faryngeale boogslagaders met behulp van Whole-mount Immunohistochemie en 3D Reconstructie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Leer 3D-reconstructie van faryngeale boogslagaders in muizenembryo's met whole-mount immunofluorescentie en confocale microscopie. Deze methode kwantificeert endotheelcellen en visualiseert vaatontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Brianna Alexander, Caolan O'Donnell en Michael Warkala voor het zorgvuldig lezen en bewerken van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door de financiering van het National Heart, Lung and Blood Institute van het NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 aan SA; AJR wordt ondersteund door NHLBI HL103920-08S1 en het National Institute of Artritis en Spier- en Huidziekten Training subsidie T32052283-11.

<ol><li>Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+pharyngeal+arch+arteries+in+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo.</a> Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).</li>
<li>Hutson, M. R., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+for+the+study+of+heart+development+and+disease+Cardiac+neural+crest+and+conotruncal+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium+in+the+pharyngeal+arches+3%2C+4+and+6+is+derived+from+the+second+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field.</a> Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).</li>
<li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene%2C+Tbx1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).</li>
<li>Lindsay, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx1+haploinsufficieny+in+the+DiGeorge+syndrome+region+causes+aortic+arch+defects+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice.</a> Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).</li>
<li>Weninger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualising+the+Cardiovascular+System+of+Embryos+of+Biomedical+Model+Organisms+with+High+Resolution+Episcopic+Microscopy+%28HREM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM).</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58(2018).</li>
<li>Phillips, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax9+is+required+for+cardiovascular+development+and+interacts+with+Tbx1+in+the+pharyngeal+endoderm+to+control+4th+pharyngeal+arch+artery+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis.</a> Development. 146 (18), (2019).</li>
<li>Vlaeminck-Guillem, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ets+family+member+Erg+gene+is+expressed+in+mesodermal+tissues+and+neural+crests+at+fundamental+steps+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis.</a> Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).</li>
<li>Ertürk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).</li>
<li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Clearing+and+Dehydration+of+GFP+Expressing+Mouse+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains.</a> PLoS One. 7 (3), e33916(2012).</li>
<li>Ertürk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De mogelijkheid om het endotheel in muisembryo's in 3D te visualiseren heeft nieuwe inzichten opgeleverd in hun ontwikkeling3. Hier presenteren we een protocol dat het mogelijk maakt voor hoge resolutie 3D-beeldvorming van embryo's, visualisatie van vasculaire connectiviteit, en kwantitatieve analyses van PAA-vorming. Dit protocol kan worden gebruikt om te zien hoe genetische veranderingen of milieubeledigingen van invloed paa ontwikkeling. De hier gerapporteerde procedure maakt gebruik van antili...

Tijdens de embryogenese van de muis ontstaan faryngeale boogslagaders (PAA's) als symmetrische, tweelaterale paren slagaders die het hart verbinden met de dorsaleaorta1. Naarmate het embryo zich ontwikkelt, de eerste en tweede paar PAA's achteruit, terwijl de3e,4e, en 6e PAA's ondergaan een reeks van asymmetrische remodelleren gebeurtenissen om de aortaboog slagaders te vormen2.
Paa's 3, 4 en 6 ontwikkelen zich via vasculogene, dat is de de novo vorming van bloedvaten3. Afwijkingen in de vorming of remodelleren van deze boogslagaders leiden tot verschillende aangeboren hartafwijkingen, zoals die gezien bij patiënten met digeorge syndroom4,5. Daarom kan het begrijpen van mechanismen die de ontwikkeling van PAA's reguleren leiden tot een beter begrip van aangeboren hart-en vaatziekten (CHD) etiologie.
De huidige benaderingen voor het visualiseren en analyseren van PAA-ontwikkeling omvatten immunofluorescentie van weefselsecties, vaatwerpt, India-inktinjectie, hoge resolutie episcopic microscopie en/of immunohistochemie aan de hele berg1,4,5,6,7. Hierin beschrijven we een protocol dat hele immunofluorescentie, confocale microscopie en 3D-beeldweergave combineert om volumetrische gegevens, vasculaire connectiviteit en celidentiteit te verzamelen, analyseren en kwantificeren. Verder detailleren we een methode om de aantallen EC's in elke faryngeale boog te compartimenteren en te kwantificeren als een middel om de vorming van de faryngeale boog vasculaire plexus en de remodelleren ervan in de PAA's te bestuderen. Hoewel dit protocol is ontworpen voor het analyseren van PAA-ontwikkeling, kan het worden gebruikt om andere zich ontwikkelende vasculaire netwerken te analyseren.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>MP Biomedicals</td><td>PBS10X02</td><td></td></tr><tr><td>20x water immersion objective</td><td>Nikon</td><td>MRD77200</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1613101</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-goat</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 anti-mouse</td><td>Invitrogen</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>Analysis Software</td><td>Imaris 9.2.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzyl Alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>305197</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl Benzoate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8.18701.0100</td><td></td></tr><tr><td>Cover Slips</td><td>VWR</td><td>16004-312</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (5 mg/mL stock)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes (2.0 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes (50 mL)</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Fast wells</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664113</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-VEGFR2</td><td>R&amp;D Systems, Inc.</td><td>AF644</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>A1HD25</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-ERG</td><td>Abcam</td><td>ab214341</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (35 mm)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (60 mm)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-105</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Molds</td><td>VWR</td><td>18000-128</td><td></td></tr><tr><td>Scapels</td><td>Exelint International Co.</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 151-500</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisatie en analyse van faryngeale boogslagaders met behulp van whole-mount immunohistochemie en 3d reconstructie

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Onjuiste vorming of remodelleren van de faryngeale boogslagaders (PAA's) 3, 4 en 6 dragen bij aan enkele van de meest ernstige vormen van aangeboren hart-en vaatziekten. Om de vorming van PAA's te bestuderen, ontwikkelden we een protocol met behulp van immunofluorescentie van de hele berg in combinatie met benzylalcohol/benzylbenzoaat (BABB) weefselclearing en confocale microscopie. Dit maakt de visualisatie van de faryngeale boog endotheel op een fijne cellulaire resolutie evenals de 3D-connectiviteit van de vasculatuur. Met behulp van software hebben we een protocol opgesteld om het aantal endotheelcellen (EV's) in PAA's te kwantificeren, evenals het aantal E's in de vasculaire plexus rond de PAA's binnen faryngeale bogen 3, 4 en 6. Wanneer toegepast op het hele embryo, biedt deze methodologie een uitgebreide visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale vasculatuur.

Het hier gepresenteerde immunofluorescentieprotocol met hele mount levert duidelijke en schone resultaten op, waardoor de 3D-reconstructie van faryngeale boogendotheel mogelijk is, zoals te zien is in figuur 1A. Het is belangrijk om embryo's voldoende lang in elke antilichaamoplossing uit te broeden om volledige penetratie door het monster te garanderen, evenals, het grondig wassen van embryo's na de incubatie. In figuur ...

Hier beschrijven we een protocol om de faryngeale boogslagaders 3, 4 en 6 muisembryo's te visualiseren en te analyseren met behulp van immunofluorescentie, weefselclearing, confocale microscopie en 3D-reconstructie.

Visualisatie en analyse van faryngeale boogslagaders met behulp van Whole-mount Immunohistochemie en 3D Reconstructie

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

Met deze methode kan elke faryngeale boog worden gecompartimenteerd. Endotheelcelnummers kunnen dan in elke boog worden gekwantificeerd als een middel om de ontwikkeling van de faryngeale boogslagader te bestuderen. De belangrijkste voordelen van deze aanpak zijn het vermogen om de relatie tussen verschillende vasculaire structuren te visualiseren en het vermogen om kwantitatief te bepalen hoe de structuren de mutanten beïnvloedden.Aorta boog slagaders worden vaak gemuteerd in aangeboren hart-en vaatziekten. Onze methode maakt het mogelijk om te bestuderen hoe mutaties het fysiologische proces van vaatvorming en remodellering veranderen. Hoewel we deze methode gebruiken om inzicht te krijgen in de mechanismen van aangeboren hartziekten, kan het worden toegepast op andere systemen, met name met de komst van lichtbladige microscopie.Begin met het gebruik van een glazen pipet om elke embryonale dag 9.5 of 10.5 embryo over te brengen in individuele twee milliliter buizen met één milliliter PBS. Gebruik na fixatie fijne tangen om het embryo voorzichtig net boven de achterpoot te knijpen en een dwarse snede te maken om de achterste helft van het embryo te verwijderen. Om de embryo's te d

visualization-analysis-pharyngeal-arch-arteries-using-whole-mount

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Ex vivo analyse van arteriële laesies uit diermodellen van hart- en vaatziekten is klassiek gebaseerd op histologische en immunohistochemische technieken. Deze bieden 2-dimensionale metingen in 3-dimensionale laesies. Dit manuscript beschrijft de generatie van arteriële laesies voor kwantitatieve analyse in 3-dimensies met behulp van optische projectietomografie.

Generatie en 3-dimensionale kwantificering van arteriële laesies in Muizen met behulp van optische projectie Tomografie

Hier presenteren we een protocol om faryngeale bogen te kweken om de biologie van hart- en spiervoorlopercellen en hun micro-omgeving te bestuderen.

Ex Vivo Cultuur van pharynxbogen to Heart en Muscle voorouders en hun niche Studie

Een procedure voor het maken van een gezichtspreparatie van de muizencarotisarterie en aorta wordt beschreven. Dergelijke preparaten, wanneer immunofluorescent gekleurd met specifieke antilichamen, ons in staat stellen om lokalisatie van eiwitten en identificatie van celtypen in de gehele vaatwand door confocale microscopie te bestuderen.

En Voorbereiding van Muis Bloedvaten

Wij stellen voor een gestandaardiseerde protocol karakteriseren de cellulaire samenstelling van laat-stadium lymfkliertest atherosclerotische laesies met inbegrip van systematische methoden voor dierlijke dissectie, weefsel insluiten, afdelen, kleuring en analyse van brachiocephalic slagaders van atheroprone gladde spieren cel lineage tracering muizen.

Kwantitatieve analyse van cellulaire samenstelling in geavanceerde atherosclerotische laesies van de gladde spieren cel Lineage-Tracing muizen

Murine modellen van atherosclerose zijn nuttige instrumenten om te onderzoeken van pathogene trajecten op moleculair niveau, maar vereisen gestandaardiseerde kwantificering van de ontwikkeling van de laesie. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te bepalen van de laesie grootte in de grote arteriële vaten, met inbegrip van de aorta wortel, aortaboog, en brachiocephalische slagader.

Kwantificering van atherosclerose bij muizen

We bieden een stapsgewijs protocol voor immunofluorescentiekleuring van de sinoatriale knoop (SAN) en atrioventriculaire knoop (AVN) in muizenharten.

Whole-Mount Immunofluorescentie kleuring, confocale beeldvorming en 3D-reconstructie van de sinoatriale en atrioventriculaire knoop in de muis

Hier beschrijven we computationele hulpmiddelen en methoden die visualisatie en analyse van drie- en vierdimensionale beeldgegevens van muizenembryo's mogelijk maken in de context van axiale elongatie en segmentatie, verkregen door into optische projectietomografie en door live beeldvorming en whole-mount immunofluorescentiekleuring met behulp van multifotonenmicroscopie.

Drie- en vierdimensionale visualisatie- en analysebenaderingen om gewervelde axiale rek en segmentatie te bestuderen

Dit protocol presenteert een uitgebreide pijplijn voor het analyseren van monsters die zijn verkregen uit menselijke harten die de microscopische en macroscopische schaal overspannen.

Pijplijn voor driedimensionale anatomische studie op meerdere schaal van het menselijk hart

Hier presenteren we geoptimaliseerde weefselopruimingsprotocollen om de muizenaorta in drie dimensies (3D) in beeld te brengen. We schetsen state-of-the-art procedures voor immunokleuring, optische klaring en beeldvorming met de bedoeling om de anatomische nabijheid van het perifere zenuwstelsel met atherosclerotische plaques en de adventitia bij atherosclerose te definiëren.

Driedimensionale beeldvorming van aortaweefsels bij atherosclerose

Dit protocol introduceert een snelle methode voor kwantitatieve driedimensionale vasculaire beeldvorming op de hele berg met behulp van light-sheet fluorescentiemicroscopie. De werkzaamheid van de methode wordt aangetoond met behulp van het faryngeale boogslagadersysteem van het kuikenembryomodel, waarbij hemodynamische krachten worden gekwantificeerd via computationele vloeistofdynamica.

Snelle beeldvorming met hoge resolutie van de hele berg van het vaatstelsel van kleine dieren voor kwantitatieve studies

Hier presenteren we een protocol voor het behoud van de menselijke arteriële architectuur door weefselstabiliserende gel in het vaatlumen te infuseren voordat deze wordt doorgesneden voor moleculaire of histopathologische analyse.

In vitro Intraluminale gelinfusie: een geavanceerde benadering voor microscopische analyse van menselijke weerstandsslagaders

Leer 3D-reconstructie van faryngeale boogslagaders in muizenembryo's met whole-mount immunofluorescentie en confocale microscopie. Deze methode kwantificeert endotheelcellen en visualiseert vaatontwikkeling.

Visualisatie en analyse van faryngeale boogslagaders met behulp van Whole-mount Immunohistochemie en 3D Reconstructie

Meer video's verkennen