Identification à haut débit de la résistance aux seringues Pseudomonas pv. Tomate dans la tomate à l’aide de semis Flood Assay

Ce protocole à haut débit permet un criblage rapide des semis de tomates des accessions sauvages à l’agent pathogène bactérien Pseudomonas seringues. L’analyse des inondations de semis minimise le temps de croissance des plantes et les besoins en chambre de croissance, permet un roulement rapide des plantes et permet de tester de grandes tailles d’échantillons. Cet essai est un outil puissant qui peut être utilisé pour dépister la résistance dans les accessions sauvages et d’autres lignées avec des antécédents génétiques complexes.

Le protocole fournit des indications spécifiques pour l’innoculation des inondations de deux souches de seringues Pseudomonas. Cependant, il est polyvalent et peut être modifié pour détecter la résistance de l’hôte à d’autres pathogènes bactériens. Yana Hasan, spécialiste de la recherche dans mon laboratoire, démontrera la procédure.

Commencez par faire pousser les semis de tomates. Placer les graines de tomate dans un tube de microcentrifugeuse de 2,2 millilitres et ajouter deux millilitres de solution d’eau de Javel à 50 %. Faire basculer le tube pendant 25 minutes, puis retirer la solution d’eau de Javel à l’l’intérieur d’une pipette.

Ajouter deux millilitres d’eau ultra pure et laver les graines en inversant le tube cinq fois. Aspirer le liquide du tube, et répéter le lavage quatre fois de plus. Après le lavage final, ajouter deux millilitres d’eau ultra-pure et verser les graines dans une boîte de Pétri stérile.

Stériliser les forceps en les flamant dans l’éthanol, puis les utiliser pour transférer cinq à sept graines sur une plaque de 100 par 25 millilitres avec 0,5 XMS plus 0,8 pour cent de médias d’agar. Sceller les bords de la plaque avec du ruban chirurgical. Assurez-vous que les plaques sont empilées à plat et face vers le haut.

Stratifier les graines stérilisées à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pendant au moins trois jours pour synchroniser la germination. Après trois jours, orientez verticalement les plaques de façon à ce que les racines poussent le long de la surface de l’assiette et que la ligne de graines soit orientée horizontalement. Transférer les graines dans une chambre de croissance réglée à 22 degrés Celsius avec un cycle sombre de 16 heures de lumière et de 8 heures.

Faites pousser les semis pendant dix jours dans la chambre, à ce moment-là, ils afficheront généralement des cotyléons entièrement émergés et élargis et des premières feuilles vraies émergentes. Striez les bactéries fraîches sur l’agar KB approprié avec un cure-dent plat et stérile. Pour le PstT1, incuber la plaque à 28 degrés Celsius pendant 48 heures avant d’utiliser les bactéries dans l’expérience d’inondation.

Pour préparer l’inoculum, résusquer aseptiquement les bactéries dans le chlorure de magnésium stérile et dix millimolaire à une densité optique de 0,1. Ensuite, faire deux dilutions en série pour obtenir une concentration de travail avec un OD600 de 0075. Préparez également une dilution d’un à dix de copolymer surfactant d’organosilicone non ionique dans le chlorure de magnésium de dix millimolar.

Vortex et l’ajouter aux bactéries, tourbillonnant le tube pour mélanger. Transférer les assiettes avec les semis vieux de dix jours de la chambre de croissance à l’armoire de biosécurité et enlever le ruban chirurgical. Transférer ensuite six millilitres d’inoculum à chaque assiette.

Poussez doucement les semis dans l’inoculum à l’aide d’une pointe de pipette et démarrez une minuterie pendant trois minutes. Tenez une assiette dans chaque main et inclinez l’avant de la plaque vers le bas pour submerger les cotyléons et les feuilles des semis. Swish le côté inoculum à côté cinq à sept fois, puis incliner les plaques en arrière pour couvrir les racines avec l’inoculum.

Inclinez à nouveau les plaques et répétez le cycle pendant un total de trois minutes. Versez l’inoculum des assiettes, ez-les sur une surface plane et versez l’inoculum résiduel une deuxième fois. Ré-envelopper les assiettes et les remettre dans la chambre de croissance.

Les cultivars Moneymaker-PtoR et Moneymaker-PtoS ont été inondés de PSTDC3000 et phénotypés sept à dix jours après les inondations. Les semis Moneymaker-PtoR sont porteurs du groupe génétique PtoPRF et étaient résistants au PSTDC3000. Alors que les semis Moneymaker-PtoS quasi isogéniques, qui ne peuvent pas reconnaître les effecteurs PSTDC3000 AVRPto ou AVRPto-B sont morts rapidement, dans les sept jours suivant les inondations.

Les semis vieux de dix jours ont été inondés de PstT1 et phénotypés au moins dix jours après les inondations. Les accessions sensibles étaient mortes, avaient des meristems apical bruns et manquaient de nouvelle croissance. En revanche, les semis résistants ont montré un niveau élevé de nouvelle croissance verte et ont survécu à l’infection avec PstT1.

Des analyses de croissance bactérienne ont été effectuées pour confirmer quantitativement la résistance pstT1 et Solanum NeoRici LA1329. Il y avait une différence de 1,7 bille dans la croissance bactérienne entre la LA1329 résistante et sensible et une différence de 1,6 journal entre la LA1329 résistante et Moneymaker-PtoS, qui était corrélée avec les résultats phénotypiques. Lors de cet essai, les choses les plus importantes à retenir sont de prêter une attention particulière à la technique aseptique tout au long du protocole et de s’assurer que tous les semis sur la plaque sont complètement inondés.

Assurez-vous d’autoclaver les tissus végétaux et les bactéries infectés et d’éliminer les matériaux conformément à la réglementation appropriée.