Generatie van een menselijke iPSC-gebaseerde bloed-hersenbarrière chip

Dit protocol zal aantonen hoe gedifferentieerde geïnduceerde pluripotente stamcellen kunnen worden gezaaid op een orgaan-on-chip om een volledig menselijke, gepersonaliseerde, microfluïde bloed-hersenbarrière te genereren, die kan worden gebruikt om de doorlaatbaarheid van het centrale zenuwstelsel te voorspellen en neurologische aandoeningen te bestuderen. Met behulp van een commercieel verkrijgbaar orgaan-op-chip, zullen we laten zien hoe elk biologisch georiënteerd lab deze technologie kan gebruiken om een gepersonaliseerde, microfluïde bloed-hersenbarrière-on-chip te genereren. Het verzamelen van bewijsmateriaal stelt voor dat BBB een rol in neurologische ziekte door het produceren van gepersonaliseerde BBB spaanders die uit iPSCs van individuen met een genetische neurologische ziekte worden afgeleid.

Het zal mogelijk zijn om de rol van de BBB in gezondheid en ziekte te bestuderen. Deze methode kan ook nuttig zijn voor farmaceutische bedrijven, die dit menselijke BBB-platform kunnen gebruiken om te screenen op de doordringbaarheid van kandidaat-neurologische geneesmiddelen in het menselijk brein. De toepassing van organ-on-chip technologieën vereist meestal gespecialiseerde technische vaardigheden.

Het gebruik van commercieel beschikbare platforms maakt de toepassing van deze technologie in elk biologisch georiënteerd lab mogelijk. Om te beginnen, breng de schotel met de bereide chips naar de biosafety kast. Met behulp van een P200 pipet, voorzichtig wassen beide kanalen door het toevoegen van 200 microliters van neurale differentiatie medium in de inlaat en het trekken van de vloeistof uit de uitlaat.

Vermijd contact met de poorten, voorzichtig aanzuigen overtollige media druppels van het oppervlak van de chip. Roer de celsuspensie voorzichtig aan om een homogene celsuspensie te garanderen. Om de iPSC-afgeleide neurale voorloper cellen zaad in het bovenste kanaal om de hersenen kant te genereren, voeg een P200 tip met 30 tot 100 microliters van celsuspensie met de concentratie van een keer 10 tot de zes cellen per milliliter aan de bovenste kanaal inlaat, en voorzichtig laat de tip van de pipet.

Neem een lege P200 pipet, druk de zuiger, steek in het bovenste kanaal uitlaat, en voorzichtig trek de eencellige suspensie door de tip. Breng de chip over naar de microscoop om de zaaidichtheid en homogene verdeling van cellen binnen het bovenste kanaal te controleren. Na bevestiging van de celdichtheid bij 20% dekking, plaats de chips onmiddellijk twee uur in de couveuse bij 37 graden Celsius.

Daarna, wegwassen van de cellen die niet hechten door het toevoegen van verse neurale differentiatie medium in de inlaat en het trekken van de vloeistof via pipet uit de uitlaat. Houd de cellen onder statische omstandigheden op 37 graden Celsius met een dagelijkse neurale differentiatie medium vervanging. Nadat de INPC’s zijn aangesloten of op een volgende dag na het zaaien, breng het gerecht met de bereide chips naar de bioveiligheidskast.

Was het onderste kanaal voorzichtig met 200 microliters endotheelcelmedium. Vermijd contact met de poorten, zame druppel druppels overtollig endotheelcelmedium van het oppervlak van de chip, zorg ervoor dat ze medium in beide kanalen achterlaten. Roer de celsuspensie voorzichtig aan om een homogene celsuspensie te garanderen.

Met behulp van een P200 pipet, opstellen 30 tot 100 microliter van de iPSC-afgeleide hersenen microvasculaire cel suspensie bij de concentratie van 14 tot 20 keer 10 tot de zes cellen per milliliter, en plaats de tip in het onderste kanaal inlaat. De meest kritieke stap om functionele barrière-eigenschappen te bereiken is het zaaien van microvasculaire endotheelcellen in de hersenen. Het is van cruciaal belang om cellen met de juiste dichtheid te zaaien om bellenvorming te voorkomen om homogene verdeling binnen de orgaanchip te verifiëren.

Druk de zuiger op een P200 pipet met een lege punt, steek in het onderste kanaal uitlaat, en langzaam laat de pipet zuiger om voorzichtig trek de single-cell schorsing door het onderste kanaal. De overtollige celsuspensie van het oppervlak van de chip aanzuigen. Vermijd direct contact met de inlaat- en uitlaatpoorten om ervoor te zorgen dat er geen celsuspensie uit de kanalen wordt aangezogen.

Breng de chip naar de microscoop om de zaaidichtheid te controleren. Het onderste kanaal is gevuld met cellen zonder waarneembare gaten ertussen. Na bevestiging van de juiste celdichtheid, zaad de cellen in de resterende chips.

Om de cellen op het poreuze membraan te bevestigen, dat zich op het onderste kanaal bevindt, omkeren van elke chip en laat ze rusten in een spaanwitje. Plaats een klein reservoir met steriele DPBS in de 150-millimeter schotel om vochtigheid te bieden voor de cellen. Incubeer de chips op 37 graden Celsius gedurende ongeveer drie uur of totdat cellen in het onderste kanaal zijn bevestigd.

Zodra de iPSC-afgeleide hersenen microvasculaire endotheelcellen hebben aangesloten, flip de chips terug naar een rechte positie om cel bevestiging aan het onderste gedeelte van het onderste kanaal mogelijk te maken. 48 uur na het zaaien van de iPSC-afgeleide microvasculaire endotheelcellen, equilibrate de temperatuur van de endotheelcel medium door opwarming in een 37-graden Celsius waterbad gedurende een uur. Ontgassen het medium vervolgens gedurende 15 minuten onder een vacuümgestuurd filtratiesysteem.

Ontsmet vervolgens de buitenkant van de draagbare moduleverpakking en trays met 70% ethanol, veeg ze af en breng ze over naar de bioveiligheidskast. Open het pakket en plaats de modules in de lade Oriënteer ze met de reservoirs naar de achterkant van de lade. Pipette drie milliliter van de vooraf geëquilibreerde, warme media aan elk inlaatreservoir.

Voeg endotheelcelcultuurmedium toe aan het inlaatreservoir van het onderste kanaal en het neurale differentiatiemedium aan het bovenste kanaalinlaatreservoir van het bovenste kanaal. Vervolgens pipette 300 microliters van de vooraf geëquilibreerde, warme media naar elk uitlaatreservoir, direct over elke uitlaatpoort. Plaats maximaal zes draagbare modules op elke lade.

Breng trays naar de couveuse en schuif volledig in de cultuurmodule met de ladehandgreep naar buiten gericht. Selecteer en voer de hoofdcyclus uit op de cultuurmodule. Sluit de incubatordeur en laat de kweekmodule de draagbare modules ongeveer een minuut primen.

De primingcyclus is voltooid wanneer de statusbalk klaar staat. Haal de lade uit de kweekmodule en breng deze naar de bioveiligheidskast. Inspecteer de onderkant van elke draagbare module in de bioveiligheidskast om te controleren of de draagbare modules met succes zijn voorbereid.

Kijk voor de aanwezigheid van kleine druppels op alle vier de havens. Als een draagbare module geen druppels weer te geven, opnieuw de prime cyclus op deze modules. Als er media op de lade droopen, wat vaker gebeurt door de uitlaatpoorten, reinigt u de lade met 70% ethanol.

Vervolgens, voorzichtig wassen beide kanalen van elke chip met warme, geëquilibreerde cel-specifieke cultuur medium om eventuele bubbels in het kanaal te verwijderen, en plaats kleine druppeltjes media op de top van elke inlaat en uitlaat poort. Steek de chips met dragers in de draagbare modules en plaats maximaal zes op elke lade. Plaats de trays in de kweekmodule.

Programmeer de juiste organchipcultuurvoorwaarden, zoals stroomsnelheid en stretch, op de cultuurmodule. Zodra de regulerende cyclus is voltooid, wat ongeveer twee uur duurt, beginnen de geprogrammeerde omstandigheden. Daarna begint de cultuurmodule te stromen bij de vooraf ingestelde orgaanchipcultuur.

Immunocytochemie op de iPSC-gebaseerde bloed-hersenbarrière chip zeven dagen na het zaaien toont de EZ bollen gedifferentieerd in een gemengde neurale cel populatie in de top hersenen zijkanaal, met inbegrip van S100 beta-positieve astrocyten, Nestin-positieve neurale voorloper cellen, evenals GFAP-positieve astrocyten, en beta III tubuubuline-positieve neuronen. IPSC-afgeleide microvasculaire endotheelcellen gezaaid in de onderste bloedzijde kanaal uitgedrukt GLUT-1 en PECAM-1. Evaluatie van de bloed-hersenbarrière chip doorlaatbaarheid toont aan dat de orgaanchip gezaaid met iPSC-afgeleide hersenen microvasculaire endotheelcellen en EZ bollen had een strakke barrière in vergelijking met orgaanchips gezaaid met iPSC-afgeleide hersenen microvasculaire endotheelcellen alleen.

Orgaanchips die met EZ-bollen alleen zijn gezaaid, vertoonden geen barrière-eigenschappen. Van de eerste oppervlaktebehandeling van het kanaal tot het medium dat elke dag wordt verwisseld, vermijd bellenvorming in het kanaal. Gedurende de stap in het protocol waarin het reagens van oppervlakteactivering, extracellulaire matrix of celhoudend medium via de kanalen moet worden ingevoegd, is het uiterst belangrijk om zorgvuldig te controleren of er geen bel wordt gevonden.

De permeabiliteitstest kan worden uitgevoerd om de menselijke hersenen penetrability van kandidaat-geneesmiddelen te beoordelen. Deze aanpak kan dienen voor het testen van potentiële therapieën. De toepassing van de op iPSC gebaseerde BBB-chip maakt het mogelijk om de rol van de BBB bij verschillende neurologische ziekten te bestuderen.

In de toekomst kan een dergelijk platform nuttig zijn voor voorspellende, gepersonaliseerde geneeskunde toepassingen.