Neuroscience
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Préparation de tranches d’hippocampe humaine aiguë pour les enregistrements électrophysiologiques
Chapters
Summary May 7th, 2020
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Le protocole présenté décrit le transport et la préparation du tissu hippocampal humain réséqué dans le but ultime d’utiliser des tranches vitales du cerveau comme outil d’évaluation préclinique pour les substances antiépileptiques potentielles.
Transcript
En utilisant notre technique, nous pouvons tester des substances antiépileptiques potentielles dans des échantillons de cerveau humain pour aider au développement de médicaments pour l’épilepsie du lobe temporal. Le tissu cérébral humain a l’avantage de violer le capuchon translationnel entre la recherche fondamentale et les applications cliniques. Le jour de l’intervention ou le plus tard possible la veille, décongelez 50 millilitres d’une solution aCSF de choline de 10 x dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius et ajoutez la solution décongelée et 50 millilitres de solution 10x deux à environ 300 millilitres d’eau double-distillée.
Ajouter les concentrations finales de glucose et de chlorure de calcium au mélange et remuer jusqu’à dissolution. Ajouter ensuite de l’eau double distillée à un volume final de 500 millilitres. Mesurer l’osmolarité.
Et remplir une bouteille avec environ 100 millilitres de l’aCSF choline 1x. Le jour de l’intervention, réfrigérer l’aCSF 1x choline sur la glace et utiliser un distributeur de gaz en verre relié au gaz carbogen pour carbogenate la solution pendant au moins 10 à 15 minutes. Au moins 10 à 15 minutes avant l’intervention, préchauffer l’aCSF de stockage, le potassium élevé plus l’aCSF de 4-aminopyridine, et le magnésium bas plus la bicuculline à 35 degrés Celsius avec la carbogenation.
Pour préparer la chambre d’interface, coupez deux morceaux de papier filtre de quatre par deux centimètres pour chaque compartiment de fixation des tranches et empilez les morceaux les uns sur les autres. Ensuite, placez de fines ficelles de coton autour des morceaux de papier filtre à l’intérieur des compartiments pour briser la tension de la solution et assurer un flux équitable. Et placez trois à quatre morceaux de papier filtre de 1,5 par un centimètre sur le dessus du plus gros morceau de papier filtre dans chaque compartiment.
Avant d’acquérir les tranches de tissu, utilisez 70% d’éthanol pour essuyer la zone de préparation et placer un couvercle sur la zone. Placez de la colle super, deux pinces pointues, une spatule, un scalpel avec des lames, et une lame pour la coupe rugueuse du tissu cérébral près du vibratome. Essuyez le plateau tampon et la plaque de spécimen du vibratome avec 70% d’éthanol.
Lorsque le plateau tampon est complètement sec, couvrez-le de papier d’aluminium et placez le plateau dans le bain de glace. Remplissez le bain de glace de glace concassée et maintenez le bain à moins 20 degrés Celsius jusqu’à la préparation. Ensuite, essuyez le vibratome et la lame de rasoir avec 70% d’éthanol et calibrez le vibratome pour minimiser les vibrations verticales et les lésions tissulaires pendant la procédure de tranchage.
Immédiatement après l’acquisition de l’échantillon de tissu, retirez le tissu de l’aCSF de choline de transport et coupez toutes les parties brûlées du tissu. Coupez une surface même pour faciliter le collage du morceau de tissu sur la plaque de l’échantillon et utilisez le vibratome pour couper le tissu cérébral en tranches de 400 micromètres d’épaisseur, en ajustant l’amplitude et la vitesse du vibratome au besoin pendant la coupe. Certaines parties de l’hippocampe humain peuvent être plus résistantes à la coupe que d’autres.
Prendre des précautions et du temps supplémentaires peut grandement améliorer la qualité de l’échantillon. Utilisez un scalpel pour couper les tranches de cerveau pour tenir dans la chambre d’enregistrement et utilisez une spatule et de petits forceps pour placer soigneusement les tranches sur les petits morceaux de papier filtre dans la chambre d’interface pendant au moins une heure. Pour l’enregistrement de l’activité épileptiforme, placez une membrane semi-perméable collée à un anneau en plastique dans la chambre et connectez les tubes d’entrée et de sortie de la chambre à une pompe périssaltique.
Remplissez les tubes et la chambre d’aCSF carbogenated préchauffé. Pour préparer les électrodes d’enregistrement, remplissez une à deux pipettes en verre mégaohm avec une solution de chlorure de sodium de 154 millimlaires. Placez les pipettes dans un support d’électrode et utilisez des pinces à épiler et une spatule pour transférer une tranche hippocampe de la chambre d’interface dans une boîte de Pétri remplie d’aCSF carbogenated.
Retirer le papier filtre sans retourner la tranche et placer la tranche dans la chambre d’enregistrement. Maintenez la tranche en place avec le maillage de tranche et placez les électrodes dans la région d’intérêt. Commencez l’enregistrement.
L’activité d’éclatement induite par le potassium élevé plus 4-aminopyridine devrait être visible deux à cinq minutes après lavage, alors que l’induction des événements de saisie-comme par le magnésium bas plus la bicuculline peut prendre jusqu’à 30 minutes. L’application de potassium élevé plus 4-aminopyridine induit l’activité épileptiforme sous la forme d’événements d’éclatement en quelques minutes. Des événements de crise-comme avec une durée de plus de 10 secondes peuvent être induits avec l’application du magnésium bas plus la bicuculline.
Le nombre d’événements d’éclatement diminue à la fois pendant l’application du lacosamide et l’application de diméthylethanolamine, bien que les amplitudes ne soient généralement pas affectées. La qualité du tissu cérébral peut également être améliorée en réduisant la contamination et les dommages pendant la préparation. Les tranches de cerveau humain préparées avec nos méthodes peuvent également être utilisées pour étudier les fonctions physiologiques de base des neurones à l’aide de pinces à timbres ou pour étudier l’expression des gènes à l’aide de diverses techniques.
Les laboratoires du monde entier ont commencé à étudier les mécanismes de base dans le cerveau humain, et ces idées peuvent être utilisées pour aider au développement de médicaments et peuvent être testées en utilisant nos méthodes proposées.
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