Rastreamento de partículas 3D para análise in vivo não invasiva da dinâmica dos microtúbulos sinápticos em dendritos e junções neuromusculares de Drosophila

Vivian  T. Chou; Hunkar  Gizem Yesilyurt; Hoyin Lai; Jennifer B. Long; Mercedes Arnes; Kamal Obbad; Michael Jones; Hideki Sasaki; Luciano  A.G. Lucas; Sam Alworth; James  Shih-Jong Lee; David Van Vactor

doi:10.3791/61159

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Artigo de método

Rastreamento de partículas 3D para análise in vivo não invasiva da dinâmica dos microtúbulos sinápticos em dendritos e junções neuromusculares de Drosophila

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DOI:

10.3791/61159

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12 de maio de 2020

Vivian T. Chou^*¹ , Hunkar Gizem Yesilyurt^*¹ , Hoyin Lai^*² , Jennifer B. Long¹ , Mercedes Arnes¹ , Kamal Obbad¹ , Michael Jones² , Hideki Sasaki² , Luciano A.G. Lucas² , Sam Alworth² , James Shih-Jong Lee² , David Van Vactor¹

¹Blavatnik Institute of Cell Biology and Program in Neuroscience, Harvard Medical School, ²DRVision Technologies LLC

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este estudo apresenta uma estratégia de imagem neuronal intravital não invasiva combinada com uma nova estratégia de software para obter rastreamento e análise automatizados e imparciais da dinâmica de microtúbulos (MT) in vivo nos dendritos sensoriais e nas junções neuromusculares de Drosophila.

Resumo

Os microtúbulos (MTs) desempenham papéis críticos no desenvolvimento neuronal, mas muitas questões permanecem sobre os mecanismos moleculares de sua regulação e função. Além disso, apesar do progresso na compreensão dos MTs pós-sinápticos, muito menos se sabe sobre as contribuições dos MTs pré-sinápticos para a morfogênese neuronal. Em particular, estudos da dinâmica de MT in vivo em dendritos sensoriais de Drosophila produziram insights significativos sobre o comportamento em nível de polímero. No entanto, os desafios técnicos e analíticos associados à imagem ao vivo da junção neuromuscular da mosca (NMJ) limitaram estudos comparáveis da dinâmica pré-sináptica da MT. Além disso, embora existam muitas estratégias de software altamente eficazes para análise automatizada da dinâmica de MT in vitro e ex vivo, os dados in vivo geralmente exigem entrada significativa do operador ou análise totalmente manual devido à relação sinal-ruído inerentemente inferior nas imagens e à morfologia celular complexa. Para resolver isso, este estudo otimizou uma nova plataforma de software para detecção de partículas in vivo automatizada e imparcial. A análise multiparamétrica de imagens confocais de lapso de tempo ao vivo de MTs marcados com EB1-GFP foi realizada em dendritos e no NMJ de larvas de Drosophila e encontrou diferenças marcantes nos comportamentos de MT. A dinâmica da MT foi analisada após o knockdown da proteína associada à MT (MAP) dTACC, um regulador chave do desenvolvimento da sinapse de Drosophila, e identificou mudanças estatisticamente significativas na dinâmica da MT em comparação com o tipo selvagem. Esses resultados demonstram que essa nova estratégia para a análise multiparamétrica automatizada da dinâmica de MT pré e pós-sináptica no nível do polímero reduz significativamente os critérios de human-in-the-loop. Além disso, o estudo mostra a utilidade deste método na detecção de comportamentos distintos de MT após o knockdown de dTACC, indicando uma possível aplicação futura para telas funcionais de fatores que regulam a dinâmica de MT in vivo. Aplicações futuras deste método também podem se concentrar na elucidação do tipo de célula e/ou comportamentos de MT específicos do compartimento, e imagens correlativas multicoloridas de EB1-GFP com outros marcadores celulares e subcelulares de interesse.

Introdução

As células se organizam para formar estruturas funcionais por meio da coordenação de alterações intra e intercelulares via morfogênese. Um exemplo notável de morfogênese é o desenvolvimento da estrutura neuronal altamente especializada. Os neurônios exibem uma polarização notável, na qual estendem dois tipos de processos estrutural e funcionalmente distintos, dendritos e axônios¹, que podem atingir comprimentos imensos. A complexidade do desenvolvimento neuronal surge não apenas do tamanho dos dendritos e axônios, mas também da dificuldade em formar suas geometrias intrincadamente ramificadas^<....