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Longitudinale in Vivo Imaging e quantificazione dell'isolotto pancreatico umano Innesto e contribuendo cellule ospitanti nella camera occhio anteriore
Chapters
Summary June 11th, 2020
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L'obiettivo di questo protocollo è quello di monitorare continuamente le dinamiche del processo di innesto dell'isolotto pancreatico umano e delle cellule che contribuiscono tra l'ospite e il donatore. Ciò si ottiene trapiantando isolotti umani nella camera anteriore dell'occhio (ACE) di un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-destinatario del mouse seguito da ripetute immagini a 2 fotoni.
Transcript
L'ACE è un mirino di imaging ottimale. Supporta di ripeterlo nell'imaging in vivo a lungo termine di cellule isolotti al fine di studiarne la funzione e la vitalità in una situazione di innesto. Può anche essere esteso per studiare altri aspetti in condizioni fisiologiche e patologiche in tempo reale.
Il vantaggio della tecnica ACE sta nel fatto che gli stessi singoli isolotti pancreatici umani possono essere seguiti in modo non invasivo con risoluzione subcellulare per un lungo periodo di tempo. I tassi di successo della terapia sostitutiva delle cellule beta continuano a migliorare. Tuttavia, valutare l'efficienza dell'innesto di isolotto e la sopravvivenza in vivo, rimane ancora impegnativo.
Questo metodo potrebbe aiutare a valutare e ottimizzare i risultati dei trapianti di isolotto. Questo approccio non si limita solo agli isolotti pancreatici. È anche adatto per studiare i tessuti colpiti.
Ad esempio, nelle complicanze diabetiche, come glomeruli renali o pezzi di fegato, solo per citane alcuni. Per iniziare posizionare il mouse su una calda pastiglia riscaldante posizionarlo nel supporto della testa e indossare la maschera del naso. Utilizzare il pollice e l'indice per sollevare leggermente la testa.
Fissalo con i pezzi metallici sui lati. Assicurarsi che gli auricolari fissino la testa direttamente sotto le orecchie. Iniettare per via sottocutanea la soluzione di buprenorfina nella parte posteriore del mouse.
Ritrarre delicatamente le palpebre dell'occhio da trapiantare con force contundenti. Fai uscire l'occhio e fissalo liberamente con un paio di pinzette coperte da un tubo di polietilene. Dopo aver trasferito le palpebre in una piastra di Petri con PBS, raccogliere circa 20-30 isolotti nell'occhio cannular.
Utilizzando un livello dell'ago calibro 25 verso l'alto, inserire con cura la punta nella cornea e fare una singola incisione laterale. Sollevare con cura la cornea con la cannula precaricata con isolotti e rilasciare lentamente gli isolotti nell'occhio. Ritrarre lentamente la cannula e applicare il gel per gli occhi sull'occhio.
Dopo 10 minuti, rimuovere le forcep, tenendo la palpebra e rimettere l'occhio nella sua posizione normale. Per l'imaging di isolotti umani impiantati con due microscopia fotonica, posizionare la piattaforma portacapo al microscopio e somministrare gel per gli occhi sull'occhio come liquido ad immersione tra la cornea e l'obiettivo. Posizionare l'occhio sotto l'obiettivo e l'immagine degli isolotti umani impiantati come descritto nel manoscritto testuale.
Per rimuovere l'autofluorescenza, passare alla scheda elaborazione immagini, scegliere aritmetica dei canali e digitare il canale uno meno il canale due. Questo crea un nuovo canale quattro. Rinominarlo vasculature.
Ripetere questo processo e digitare il canale tre meno canale due per creare un nuovo canale cinque e rinominarlo pomodoro tutto. Per definire manualmente l'isolotto, creare una nuova superficie e scegliere Modifica manualmente nella procedura guidata. Mantenere il puntatore in modalità di selezione e in visualizzazione 3D.
E fai clic sul volume per visualizzare le sezioni. Nella scheda disegno scegliete il contorno e fate clic su Disegna per iniziare a disegnare i contorni attorno al bordo dell'isolotto, a partire dalla posizione di una sezione. Quindi spostate in una nuova posizione della fetta e ripetete i contorni del disegno.
Completate con l'ultima fetta nella parte superiore dell'isolotto e terminate facendo clic sulla scheda Crea superficie. Segmento successivo, vascucolatura isolotto e fluorescenza del pomodoro isolotto utilizzando maschera isolotto. Scegliere l'oggetto maschera isolotto definito in precedenza, passare alla scheda di modifica e fare clic sulla maschera tutta la scheda, che apre una nuova finestra.
Scegliete il canale di vascucolatura nel menu a discesa selezione canale e attivate il canale duplicato delle opzioni prima di applicare la maschera. Costante all'interno, all'esterno e impostare i voxel fuori dalla superficie su 0,000 che crea un nuovo canale sei. Rinominare questa vascucolatura dell'isolotto del canale.
Ripetete i passaggi precedenti e scegliete il pomodoro tutto nel menu a discesa selezione canale, per creare il nuovo canale, rinominarlo, pomodoro isolotto. Create quindi una nuova superficie nel menu scena e scegliete creazione automatica nella procedura guidata. Impostate il canale di origine sulla vascucolatura isolotto creata in precedenza e scegliete la sottrazione di sfondo.
Facoltativamente, utilizzare i filtri. Ad esempio, scegliere volume e regolare il filtro nella finestra, che può rimuovere gli oggetti servizio selezionati. Completate la procedura guidata e denominate il nuovo oggetto superficie, la vascucolatura isolotto.
Nell'oggetto servizio vasculature isolotto passare alla scheda di modifica e fare clic sulla scheda maschera tutta, che apre una nuova finestra. Scegliete il canale del pomodoro isolotto nel menu a discesa selezione canale e impostate voxel fuori superficie su 10.000 che crea un nuovo canale. Rinominare questa vascucolatura di pomodoro isolotto del canale.
Per segmentare il segnale fluorescente della capsula di pomodoro, scegliete le aritmetiche dei canali nella scheda di elaborazione delle immagini e digitate il canale sette meno il canale otto creando il nuovo canale. Rinominarlo capsula di pomodoro. Create una nuova superficie come descritto in precedenza e scegliete i canali sorgente, la vascucolatura di pomodoro isolotto o la capsula di pomodoro nella procedura guidata.
Quindi eseguire la sottrazione di sfondo. Aprite il file di backscatter isolotto e create una nuova superficie. Nella procedura guidata scegliere creazione automatica e definire l'area di interesse.
Se necessario, regolare la soglia in intensità assoluta. L'oggetto superficie può essere cliccato su o fuori, per eseguire il crosscheck con l'intensità del canale corrispondente. Al termine della chiusura della procedura guidata.
Infine, eseguire la quantificazione, selezionare un oggetto superficie creato nel menu della scena e passare alla scheda statistiche. Per recuperare i dati dettagliati del volume, scegliete la scheda dettagliata e selezionate valori e volume specifici dal menu a discesa. Per recuperare il valore totale del volume, passare alla scheda dettagliata e scegliere i valori medi.
Questo protocollo è stato utilizzato per trapiantare isolotti umani non etichettati nella camera interna dell'occhio di topi riceventi fluorescenti rossi di otto settimane. Il software di imaging interattivo è stato quindi utilizzato per estrarre dati quantitativi dalle immagini. Imaging a fluorescens in vivo, gli innesti di isolotto umano sono stati compromessi da interferenze significative dall'autofluorescenza tissutale che non sono state osservate negli innesti di isolotto dei topi.
Per migliorare il rapporto segnale/rumore, il canale di autofluorescenza è stato sottratto. Quindi il limite dell'isolotto chiamato maschera di isolotto e i canali corrispondenti sono stati definiti manualmente. Infine, la segmentazione del segnale del pomodoro nella vascolarizzazione delle palpebre e nella capsula delle palpebre e nella resa superficiale finale è stata utilizzata per estrarre dati quantitativi.
Qui come sessione di imaging longitudinale rappresentativo dello stesso innesto di isolotto umano a due settimane, due mesi, cinque mesi e otto mesi dopo il trapianto. Vengono visualizzate immagini MIP di dati grezzi originariamente registrati, immagini elaborate dopo la rimozione dell'autofluorescenza dell'isolotto e un isolotto segmentato. Quando si esegue l'iniezione palpebrale, assicurarsi di precaricare gli isolotti in un piccolo volume e utilizzare bracci di luce doppia flessibili sul microscopio stereo, per evidenziare lo spazio della camera degli occhi al fine di iniettare con successo gli isolotti nell'ACE.
Dopo l'imaging in vivo gli occhi possono essere fissati e ulteriormente studiati per la colorazione degli anticorpi e l'istologia convenzionale. Questa tecnica è molto utile per studi funzionali di singoli isolotti umani in tempo reale e in condizioni fisiologiche, specialmente nel contesto della vascolarizzazione, della vitalità e degli studi metabolici.
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