Please note that all translations are automatically generated.
Detta protokoll används för att upprätta och upprätthålla gnotobiotiska amerikanska kackerlackor (Periplaneta americana) genom att ytsterilisera äggfallen (oothecae) före kläckning. Dessa gnotobiotiska insekter innehåller sina vertikalt överförda Blattabacterium endosymbionts men har yxniska tarmar.
Det gnotobiotiska kackerlacka generation protokollet underlättar testning av effekterna av inhemska gut microbial community avlägsnande och ersättning på värd hälsa och mikrobiom montering. Denna teknik använder metoder från flera källor för att bilda ett sammanhängande, strömlinjeformat arbetsflöde för att generera gnotobiotiska kackerlackor utan användning av dyr speciallabbutrustning. Med tanke på de många olika rörliga delarna av detta gnotobiotiska protokoll hjälper visualisering forskare att lättare etablera sina egna småskaliga, billiga, bänk-topp gnotobiotiska anläggningar.
För att underlätta insamlingen av lämpligt antal honor som bär oothecae för de planerade experimenten, använd tång för att flytta kartongrören som innehåller gravida honor i lagertanken. Om ett kartongrör innehåller flera insekter förutom den gravida kvinnan, skaka rörinnehållet i en extra plastbehållare ringad med petroleumgel och uppmuntra målinsekten att klättra tillbaka in i kartongröret ensam. Vid insamling, överför varje gravid kvinna till bb.
När honorna har tappat sin oothecae, returnera kvinnorna till lagertanken och använd tång för att hämta oothecae från kullen. För att rengöra oothecae, placera upp till fem äggfall i ett fem milliliter centrifugerör som innehåller tre milliliter natriumddecylsulfat och virvel oothecae i 10 sekunder. Efter en andra tvätt som just visats, använd en delikat uppgiftsservett för att försiktigt skrubba ytan på varje ootheca för att ta bort skräp och placera den rengjorda ootheca i en vägbåt.
Före sterilisering, fyll två 1,5-milliliter centrifugeringsrör per ootheca med en milliliter sterilt vatten per rör. Tillsätt också 10 mikroliter 32% peracetic acid stock lösning till 3,2 milliliter dubbeldestillerat vatten i ett fem milliliter centrifugerör i en rökhuva. Lock och invertera flera gånger för att blanda och placera upp till fem rengjorda oothecae i den nyberedda 0,1% peracetic syralösningen i fem minuter, invertera röret flera gånger var 60: e sekund.
Peracetic syra är en stark oxidationsmedel ett öga, hud och luftvägarna irriterande, och är brandfarlig och frätande. Använd alltid rätt personlig skyddsutrustning under hanteringen och kassera avfallet på lämpligt sätt. I slutet av inkubationen, använd sterila tångar och en laminär flödeshuv för att överföra varje ootheca till sitt eget centrifugeringsrör med sterilt sköljvatten.
Vänd flera gånger för att blanda innan du överför oothecae till den andra uppsättningen rör med sköljvatten. Efter den andra sköljningen, använd sterila tång för att överföra oothecae till enskilda BHI-snedsteg. Placera snedorna i en steriliserad sekundär behållare och flytta behållaren till en fuktad 30-graders Celsius inkubator i fyra till fem veckor tills den kläcks.
Kontrollera snedheterna regelbundet en till två gånger i veckan för svamp- eller bakterietillväxt fram till den fjärde veckan, då slantsna bör kontrolleras dagligen. När nymferna börjar kläckas, använd sterila tångar och en laminär flödeshuv för att aseptiskt överföra en pellet steriliserad rått chow till en förberedd BHI-kolv. Som en sterilitetskontroll, placera kolven i den sekundära behållaren i 30-graders Celsius inkubatorn i 24 timmar för att bekräfta bristen på förorenande tillväxt.
Om kolven har förblivit steril, skaka nymferna ur lutningen och låt dem falla ner i kolven i laminär flödeshuv. Vattna sedan nymferna med 300 mikroliter sterilt vatten en gång i veckan i laminär flödeshuv. När nymfavföring börjar täcka mellanvåningen, överför nymferna till en ny BHI-kolv som innehåller steriliserad rått chow tillsatt 24 timmar i förväg, vilket visas.
Gravida kvinnor kan identifieras av ootheca fäst vid deras bakre bukar. Oothecae kläcker i genomsnitt 34 dagar efter sterilisering. Vid misslyckad sterilisering kan tillväxt förekomma runt oothecae under inkubationen, vilket äventyrar kläckningarnas gnotobiotiska status.
Då kan nymphal tillväxthastighet spåras genom att mäta insektens kroppslängd. Begränsning fragment längd polymorfism av 16S ribosomal DNA från en homogeniserad nymf kan användas för att bekräfta gnotobiotiska status. Gnotobiotiska kackerlackor kan vaccineras med syntetiska eller xenobiotiska mikrobiella samhällen.
Medan detta specifika arbetsflöde är nytt, har tidigare studier med gnotobiotiska kackerlackor genererat insikt i tarmflora och mikrobiella roller för att forma socialt beteende, tarmhälsa och immunitet hos sina insektsvärdar.
