Neuroscience
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In Vivo Registrazione intracellulare di Motoneuroni Spinali Ratti Identificati dal Tipo durante la stimolazione a corrente diretta trans-spinale
Chapters
Summary May 11th, 2020
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Questo protocollo descrive la registrazione intracellulare in vivo dei motoneuroni lombari con stimolazione simultanea della corrente diretta trans-spinale. Il metodo ci permette di misurare le proprietà della membrana e di registrare la cottura ritmica dei motoneuroni prima, durante e dopo la polarizzazione anodale o tadale del midollo spinale.
Transcript
Questo protocollo utilizza registrazioni intracellulari di motoneuroni spinali, per indagare direttamente l'influenza della stimolazione della corrente continua trans-spinale sulla funzione delle reti spinali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di eseguire registrazioni intracellulari su un sistema nervoso completamente maturo. Facilitare la traduzione delle osservazioni sperimentali in applicazioni pratiche.
Dopo aver confermato la mancanza di risposta al riflesso del pedale, un ratto Wistar maschio anestetizzato di sei mesi, usa un microscopio sezionante e una lama numero 21, per fare un'incisione longitudinale della pelle dallo sterno al mento. E usa la dissezione smussata per esporre la vena giugulare destra. Posizionare due legature 4-0 sotto la sezione della vena senza punti ramificati.
E fare un nodo sciolto sull'estremità prossimale del segmento delle vene. E un nodo sciolto sull'estremità distale del segmento. Fissare la vena prossimale al cuore e ligarare l'estremità distale della vena.
Utilizzare le forbici dell'iride per fare un'incisione tra il morsetto e la legatura distale. E, tenendo un lembo della vena, introdurre un catetere pre-riempito nel punto in cui la vena è bloccata dal morsetto. Quindi rimuovere il morsetto e spingere il catetere di diversi millimetri nella vena.
Per un posizionamento del tubo tracheale, utilizzare forcep smussate per separare le due ghiandole mandibolari che coprono i muscoli sternoioidi. E separare i muscoli sternoioidi alla linea mediana, per esporre la trachea. Posizionare tre legature 4-0 sotto la trachea e fare due nodi sotto il punto di inserimento del tubo tracheale e un nodo sopra.
Quindi inserire un tubo tracheale nella trachea sotto la terza cartilagine tracheale. E fissare il tubo in posizione con le legature pre-preparate. Per sezionare i nervi degli arti posteriori, utilizzare una lama numero 21 per fare un taglio longitudinale sul lato posteriore dell'arto posteriore sinistro, dal tendine d'Achille all'anca.
E usa le forbici per fare un taglio tra le regioni anteriore e posteriore della fossa poplitea, nella parte posteriore dell'articolazione del ginocchio. Tagliare due teste del bicipite femoris, per esporre il nervo sciatico. E separare la testa laterale dalla testa mediale del muscolo gastrocnemio, per esporre il nervo tibiale e i suoi rami.
Quindi utilizzare le forcep numero 55, per sezionare attentamente il gastrocnemio mediale e i nervi gastrocnemio laterale e soleo. Disconnettendoli dai tessuti circostanti mantenendo la loro connessione con i rispettivi muscoli. Per eseguire la laminectomia, utilizzare una lama numero 21 per fare un'incisione longitudinale dall'osso sacro fino alle vertebre toraciche.
E identificare la vertebra Th13, come un segmento toracico più basso con un inserimento toracico. Quindi utilizzare rongeurs fini per rimuovere i processi spinosi e le laminae dal Th13 alle vertebre L2, per esporre i segmenti lombari del midollo spinale. Per fissare la colonna vertebrale, posizionare il topo in un telaio su misura su una pastiglia riscaldante a 37 gradi Celsius, collegata a un sistema di riscaldamento a circuito chiuso.
E usare i lembi della pelle per formare una piscina profonda sul midollo spinale esposto. Posizionare i morsetti metallici al di sotto dei processi trasversali Th12 e ai processi spinosi L3 e riempire la piscina con olio minerale di 37 gradi Celsius. Utilizzare i lembi della pelle per creare una profonda pozza di olio minerale sui nervi tibiali, mediali e gastrocnemio laterale e soleus esposti.
E posizionare i nervi sugli elettrodi stimolanti bipolari del filo d'argento. Quindi collegare gli elettrodi a uno stimolatore a impulsi quadrati utilizzando canali di stimolazione separati per ogni nervo. Per il posizionamento di un elettrodo di superficie, al microscopio sezionato, posizionare un elettrodo a sfera d'argento sul lato caudale sinistro del midollo spinale esposto.
Con un elettrodo di riferimento inserito nei muscoli della schiena. E collegare entrambi gli elettrodi all'amplificatore CC differenziale. Usa uno stimolatore di corrente costante per stimolare il gastrocnemio mediale e i nervi gastrocnemio laterale e soleo, con impulsi quadrati della durata di 0,1 millisecondi ripetuti con una frequenza di tre hertz e osservare le raffiche afferenti.
Alla fine della simulazione, spostare l'elettrodo di superficie rostralmente e ripetere la stimolazione per identificare i segmenti spinali in cui le ampiezze delle raffiche sono le più alte per ogni nervo. Dopo aver determinato la posizione della massima raffica, fornire un bloccante neuromuscolare per via endovenosa per paralizzare il topo. Mentre un assistente collega il tubo tracheale a un ventilatore esterno in linea con un cap nominatore compatibile con i roditori.
Per aprire la dura e la pia mater, utilizzare le forcelle numero 55 per sollevare delicatamente la dura mater e tagliare il tessuto caudally dal segmento L5, rostralmente fino al segmento L4. Quindi usa un paio di forcep 5SF ultra sottili, per fare un piccolo cerotto nella pia, coprendo la colonna dorsale tra i vasi sanguigni. Esattamente al livello della massima raffica afferente dal gastrocnomio mediale e dal gastrocnomio laterale e dal nervo soleo.
Per posizionare gli elettrodi di stimolazione a corrente continua trans-spinale, posizionare una spugna salina imbevuta sul lato dorsale delle vertebre Th12. E utilizzare una manipolazione fine per premere la spugna con un elettrodo di stimolazione a corrente continua trans-spinale attivo. Quindi montare un microelettrodo in pool personalizzato, sul micro manipolatore, consentendo un movimento di passo da uno a due micron e calibrazione stereotassica.
E guidare una punta di micropipetta in un cerotto selezionato nella pia, con un angolo laterale mediale da 15 a 20 gradi. Per registrare la membrana motoneurone e le proprietà di cottura, nella modalità ponte dell'amplificatore intracellulare, stimolare i rispettivi rami nervosi a identificare il motoneurone sulla base dell'aspetto tutto o nulla, del potenziale di azione antidromica. Nella modalità di bloccaggio di corrente discontinua dell'amplificatore intracellulare con una modalità di commutazione di corrente da quattro a otto kilohertz, utilizzare un impulso di corrente depolarizzante intracellulare di 0,5 millisecondi, per evocare un potenziale di azione ortodontica, nel motoneurone.
Per calcolare la resistenza all'input cellulare, stimolare un motoneurone, con 40 brevi impulsi di 100 millisecondi di corrente iperpolarizzante di un nanogrammo. Per determinare il valore di base reale come ampiezza minima della corrente depolarizzante necessaria per ottenere un singolo picco, stimolare un motoneurone con impulsi d'onda quadrati di 50 millisecondi ad ampiezze crescenti. Quindi iniettare impulsi d'onda quadrati di 500 millisecondi di corrente depolarizzante, ad ampiezze crescenti.
In 0,1 a due nano ampere, per evocare scariche ritmiche di motoneuroni. Per una stimolazione della corrente continua trans-spinale, avviare le procedure di polarizzazione mediante applicazione trans-spinale della corrente continua, pur mantenendo una penetrazione stabile del motoneurone. Qui viene mostrato un tipico potenziale di azione ortotropica, evocato dalla stimolazione intracellulare che soddisfa tutti i criteri per l'inclusione dei dati.
In questa analisi, una risposta cellulare ad un impulso di corrente iperpolarizzante di 100 millisecondi di un nanogrammo. Da cui si può osservare sia la resistenza di ingresso del picco che dell'altopiano di un motoneurone, può essere determinata dalla deflessione della tensione. Questa traccia di tensione espansa di un vero picco di base, mostra una soglia di tensione chiaramente marcata del picco.
Indicando il livello di depolarizzazione della membrana a cui vengono attivati i canali del sodio gated di tensione per avviare il potenziale d'azione. Questi grafici forniscono esempi di tracce di tensione intracellulare. Da due motoneuroni, stimolati intracellularmente con impulsi quadrati di 500 millisecondi di corrente depolarizzante.
Prima, durante e dopo un'applicazione di stimolazione della corrente continua trans-spinale. Si è scoperto che la stimolazione della corrente continua trans-spinale anodale agisce verso una maggiore eccitabilità del motoneurone e frequenze più elevate di cottura ritmica. Mentre la stimolazione della corrente continua trans-spinale catodale, ha agito verso l'inibizione del fuoco.
Inoltre, gli effetti di entrambi i tipi di stimolazione della corrente continua trans-spinale, hanno superato il periodo di polarizzazione. I dati imprecisi possono essere acquisiti, se i criteri di inclusione dei dati sono compromessi a causa della penetrazione imperfetta delle cellule. Un fallimento nel compensare la resistenza e la capacità del microelettrodo o l'instabilità del midollo spinale.
È imperativo che non si danneggi il midollo spinale durante la dissezione in quanto la lesione può causare shock spinale, rendendo impossibili ulteriori registrazioni. È possibile raccogliere campioni di tessuto per ulteriori analisi istologiche o immuno citochimicologiche. Ad esempio, la misurazione dell'espressione c-fos può essere usata come proxy dell'attività neuronale.
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