In vitro에서 급성 고립된 성인 미세아교세포와 뇌 대식세포의 식세포 특성을 특성화하기 위한 유세포 분석 접근법

요약

미세아교세포와 뇌 대식세포의 식세포 특성 평가는 분자 프로파일링 연구에 중요한 기능적 차원을 제공할 수 있습니다. 우리는 유세포 분석을 사용하여 마우스 모델에서 급성 분리된 미세아교세포와 뇌 대식세포에 의한 형광 미세구 및 아밀로이드 베타 피브릴의 식세포작용을 빠르고 안정적으로 정량화하는 검증된 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

총칭하여 CNS 단핵 식세포(CNS-MP)라고 하는 미세아교세포와 중추신경계(CNS) 침투 대식세포는 신경변성 및 뇌졸중을 포함한 신경 질환에서 중심적인 역할을 합니다. CNS-MP는 병리학적 단백질, 파편 및 신경 세포 시냅스의 식세포 제거에 관여하며, 각각 고유한 기본 분자 경로를 가지고 있습니다. 이러한 식세포 특성을 특성화하면 기존의 유세포 분석, 전사체학 및 단백질체학 접근법을 사용하여 미세아교세포의 분자 프로파일링을 보완하는 기능적 판독값을 제공할 수 있습니다. 미세아교세포의 식세포 프로파일링은 마우스 신생아 미세아교세포의 현미경 시각화와 체외 배양에 의존해 왔습니다. 전자의 접근법은 제한된 샘플링으로 어려움을 겪는 반면, 후자의 접근법은 본질적으로 성인 CNS-MP의 실제 생체 내 상태를 제대로 반영하지 못합니다. 이 논문은 유세포 분석을 통해 급성 분리된 마우스 CNS-MP의 식세포 특성을 표현형하기 위한 최적화된 프로토콜에 대해 설명합니다. CNS-MP는 기계적 해리 후 밀도 구배 원심분리를 사용하여 성체 쥐의 뇌에서 급성으로 분리하고, 형광 미세구 또는 형광 Aβ 원섬유로 배양하고, 세척한 다음, 표면 마커(CD11b, CD45)에 대한 항체 패널로 표지합니다. 이 접근법을 사용하면 뇌 상주 미세아교세포와 CNS 침투 대식세포의 식세포 특성을 비교한 다음 이러한 식세포 표현형에 대한 노화 및 질병 병리의 영향을 평가할 수 있습니다. 이 신속한 방법은 또한 사후 검시 또는 수술 뇌 표본에서 급성으로 분리된 인간 CNS-MP를 기능적으로 표현형화할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 또한, CNS-MP subset에 의한 식세포작용의 특정 메커니즘은 선택적 식세포 경로를 억제하여 조사할 수 있습니다.

서론

중추신경계(CNS)의 선천성 면역 세포는 주로 미세아교세포와 침윤 단핵구/대식세포로 구성되며, 이를 통틀어 CNS-단핵 식세포(CNS-MPs)라고 합니다¹. CNS-MP는 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD), 신경염증성 질환, 뇌졸중과 같은 신경퇴행성 질환과 관련이 있다 ^2,3,4. CNS-MP는 성상세포(astrocyte), 주위세포(pericyte) 및 뇌실막세포(ependymal cell)와 함께 식세포 기능을 가지고 있습니다 ^5,6. 항상성 상태에서 CNS-MP는 자가사멸 세포 파편 및 단백질의 식세포 제거, 뉴런 연결을 리모델링하기 위한 시냅스 가지치기와 함께 국소 미세환경에 대한 지속적인 감시에 관여합니다 7,8,9,10.<....

프로토콜

모든 마우스 연구는 Emory University의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받은 후 수행되었으며 National Institutes of Health의 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에 따라 엄격하게 수행되었습니다.

1. 격리 당일의 준비

1. 분리 절차 전반에 걸쳐 모든 시약, 완충액 및 세포 현탁액을 차갑게 유지하기 위해 얼음 양동이를 준비합니다.
2. 관류 전 30분에서 1시간 동안 4°C에서 1× 인산염 완충 식염수(PBS) 병(최소 1L)을 놓고 관류 및 분리 절차 동안 1× PBS를 얼음 위에 보관합니다.
3. 밀도 구배 매체의 작업 농도를 준비합니다(35% SIP라고 함, 재료 표 참조).
4. 세포 분리 전에 실험에 사용된 모든 원뿔형 및 유세포 분석 튜브에 라벨을 부착하여 처리 시간 지연을 방지합니다. 또한 관류 전에 분리에 필요한 다른 모든 공급품(예: 40μm 세포 여과기, 주사기 및 바늘)을 수집합니다.

결과

급성 고립된 CNS-MP에 의한 미세구 및 Aβ42 피브릴의 식세포 흡수의 전형적인 결과를 예시하기 위해, 과도성 중대뇌동맥 폐색(MCAO^{) 8} 후 동측 반구에서 급성 고립된 CNS-MP를 얻었습니다. MCAO 모델에서 CNS-MP의 식세포 특성에 대한 자세한 내용은 이전 간행물⁸을 참조하십시오. 간단히 말해서, 72시간의 회복 후 CNS-MP는 기계적 해리 후 밀도 구배 원심분리를 사용하여 새로운 뇌에서 급성으로 분리하고 형광 미세구 또는 Aβ 피브릴로 배양했습니다(그림 1). 그 후, CNS-MPS를 CD11b 및 CD45의 두 가지 표면 마커에 대한 형광 접합 항체 패널로 라벨링하고 유세포 분석기에서 미세구 또는 Aβ 원섬유의 식세포 흡수를 분석했습니다(그림 1). 이 프로토콜은 노화, 진행성 신경병리학 및 허혈성 뇌

토론

유세포 분석(Flow-cytometry)은 형광 표지 프로브(일반적으로 항체)를 사용하여 세포 표면 또는 세포 내 구획에서 관심 있는 단백질 또는 마커의 발현을 검출하여 이러한 관심 마커를 라벨링할 수 있는 기술입니다. 세포 표면 또는 세포 내 항체는 일반적으로 고유한 방출 스펙트럼을 가진 레이저 여기성 형광 색소와 결합됩니다. 이러한 항체로 배양된 세포는 이러한 마커의 발현 패턴에 따라 여러 하위 집단으로 분류할 수 있습니다. CNS-MP는 주로 미세아교세포와 CNS 침투 단핵구/대식세포를 포함합니다. 미세아교세포와 CNS 단핵구/대식세포는 뚜렷한 기능적, 분자적 특성을 가지고 있으며, 이는 알츠하이머병과 같은 질병 상태에서 추가로 변경될 수 있습니다. CNS의 대표 상태에서 최소한의 조절로 이러한 차이를 특성화하는 것은 유세포 분석 접근법을 사용하여 촉진할 수 있습니다. 이 원고는 급성 분리된 CNS-MP의 식세포 특성을 신속하게 평가하고 기존 방법에서 일반적으로 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10x Hank's Balanced Salt Solution(10x HBSS)	ThermoFisher	14065056	Store at 4 °C. 프로토콜에 설명된 대로 SIP를 만드는 데 사용됨
1x Hank's balanced salt solution(1x HBSS)	ThermoFisher	14175095	Store at 4 °C. 프로토콜에 설명된 대로 35% SIP를 만드는 데 사용됨
1x Phosphate Buffered Saline (PBS)			https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/western-blotting/buffers-recipes/10x-phosphate-buffered-saline.html 10xPBS를 실온에서 보관하십시오. 10xPBS 1부를 MilliQ dH20 9부에 희석하여 새로운 1xPBS를 준비하고 4°C에 보관합니다. C를 복용하기 전에 한 시간 동안 복용하십시오. 냉장 보관하기 전에 1xPBS의 pH가 7.0인지 확인하십시오.
35% SIP			35% SIP 20mL를 만들려면 SIP 7mL와 얼음처럼 차가운 13mL를 1회 사용하십시오. HBSS. 추가 처리
APC-Cy7 쥐 anti-CD11b	BD Pharmingen 557657		4 °에서 저장 때까지 얼음에 보관하십시오. C 또는 사용 중에는 얼음 위에 보관하십시오. 빛을 피하십시오. 유세포 분석 희석 - 1:100
FITC 쥐 안티 마우스 CD145	BD Pharmingen	553080	에 보관; C 또는 사용 중에는 얼음 위에 보관하십시오. 빛을 피하십시오. 플로우 사이토메트리 희석 - 1:100
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34961	-20°C에서 보관. 염료 튜브 하나에 DMSO 50ul을 추가하고, 전체적으로 소용돌이치며 최대 속도로 1분 동안 원심분리합니다. 10µ를 만듭니다. L 부분 표본을 사용하여 -20 °C에서 보관합니다. 각 실험에 대해 새로운 부분 표본을 사용하고 1:500 희석으로 샘플에 추가합니다.
OneComp eBeads 보상 비즈	ThermoFisher	01-1111-42	4 ° C, 샘플 튜브에 추가하기 전에 튜브를 완전히 와류로 만들고 사용 중에는 얼음에 보관하십시오.
PE-Cy7 쥐 안티 마우스 CD145	BD Pharmingen	552848	4 °에 저장; C 또는 사용 중에는 얼음 위에 보관하십시오. 빛을 피하십시오. 유세포 분석 희석 - 1:100
Percoll pH8.5-9.5	Sigma	P1644	4°C에 보관 표준 Isotonic Percoll (SIP)의 10 mL를 만들기 위하여는: 찬 Percoll의 9 mL 및 찬 10times의 1개 mL를 사용하십시오; HBSS.
Phycoerythrin-conjugated microspheres	ThermoFisher	F13083	Store at 4 ° C 또는 사용 중에는 얼음 위에 보관하십시오.
β - 아밀로이드 (1 - 42), HiLyte Fluor 488 - 표지, 인간	AnaSpec	AS-60479-01	Ab 섬유의 최종 농도는 200µ입니다. 그런 다음 사용하기 전에 희석합니다. -20°C에서 보관하십시오. 각 실험에 대해 새로운 작업 용액을 준비합니다.

4°C