Abordagem de citometria de fluxo para caracterizar propriedades fagocíticas de micróglia adulta e macrófagos cerebrais agudamente isolados in vitro

Resumo

A avaliação das propriedades fagocíticas da microglia e dos macrófagos cerebrais pode fornecer uma dimensão funcional valiosa para estudos de perfil molecular. Descrevemos um protocolo validado que usa citometria de fluxo para quantificar de forma rápida e confiável a fagocitose de microesferas fluorescentes e fibrilas beta amilóides por micróglia agudamente isolada e macrófagos cerebrais de modelos de camundongos.

Resumo

Os macrófagos infiltrantes da microglia e do sistema nervoso central (SNC), coletivamente chamados de fagócitos mononucleares do SNC (MP-SNC), desempenham papéis centrais em doenças neurológicas, incluindo neurodegeneração e acidente vascular cerebral. Os CNS-MPs estão envolvidos na depuração fagocítica de proteínas patológicas, detritos e sinapses neuronais, cada uma com vias moleculares subjacentes distintas. A caracterização dessas propriedades fagocíticas pode fornecer uma leitura funcional que complementa o perfil molecular da microglia usando abordagens tradicionais de citometria de fluxo, transcriptômica e proteômica. O perfil fagocítico da microglia baseou-se na visualização microscópica e em culturas in vitro da microglia neonatal de camundongos. A primeira abordagem sofre de amostragem limitada, enquanto a última abordagem é inerentemente pouco reflexiva do verdadeiro estado in vivo de CNS-MPs adultos. Este artigo descreve protocolos otimizados para propriedades fagocíticas de fenótipos de CNS-MPs de camundongos agudamente isolados por citometria de fluxo. Os CNS-MPs são isolados agudamente do cérebro de camundongos adultos usando dissociação mecânica seguida de centrifugação com gradiente de densidade, incubados com microesferas fluorescentes ou fibrilas Aβ fluorescentes, lavados e depois marcados com painéis de anticorpos contra marcadores de superfície (CD11b, CD45). Usando essa abordagem, é possível comparar as propriedades fagocíticas da micróglia residente no cérebro com macrófagos infiltrantes no SNC e, em seguida, avaliar o efeito do envelhecimento e da patologia da doença nesses fenótipos fagocíticos. Este método rápido também tem potencial para fenotipar funcionalmente MP-MPs do SNC humano agudamente isolados a partir de amostras cerebrais post-mortem ou cirúrgicas. Além disso, mecanismos específicos de fagocitose por subconjuntos de SNC-MP podem ser investigados inibindo vias fagocíticas selecionadas.

Introdução

As células imunes inatas do sistema nervoso central (SNC) são predominantemente compostas por micróglia e monócitos/macrófagos infiltrantes, juntos chamados de fagócitos mononucleares do SNC (SNC-MPs)¹. Os MP-SNC estão implicados em doenças neurodegenerativas, como doença de Alzheimer (DA), distúrbios neuroinflamatórios e acidente vascular cerebral ^2,3,4. Os MPs do SNC, juntamente com os astrócitos, pericitos e células ependimárias, têm funções fagocíticas ^5,6.....

Protocolo

Todos os estudos com camundongos foram conduzidos após a obtenção da aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Emory (IACUC) e em estrita conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde.

1. Preparação no dia do isolamento

1. Prepare um balde de gelo para manter todos os reagentes, tampões e suspensões celulares frios durante todo o procedimento de isolamento.
2. Coloque o frasco de solução salina tamponada com fosfato 1× (PBS) (pelo menos 1 L) a 4 °C por 30 min a 1 h antes da perfusão e mantenha 1× ....

Resultados

Para exemplificar os resultados típicos da captação fagocítica de microesferas e fibrilas Aβ42 por CNS-MPs agudamente isolados, CNS-MPs agudamente isolados foram obtidos do hemisfério ipsilateral após oclusão arterial cerebral média transitória (MCAO)⁸. Para obter detalhes sobre as propriedades fagocíticas dos CNS-MPs no modelo MCAO, consulte publicações anteriores⁸. Resumidamente, após uma recuperação de 72 horas, os CNS-MPs foram isolados agudamente do cérebro fresco usan.......

Discussão

A citometria de fluxo é uma técnica que pode detectar a expressão de proteínas ou marcadores de interesse na superfície celular ou em compartimentos intracelulares usando sondas marcadas com fluorescência (normalmente anticorpos) para rotular esses marcadores de interesse. Os anticorpos de superfície celular ou intracelulares são tipicamente conjugados com fluorocromos excitáveis a laser que possuem espectros de emissão únicos. As células incubadas com esses anticorpos podem ser categori.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10x solução salina balanceada de Hank (10x HBSS)	ThermoFisher	14065056	Armazenar a 4 ° C. Usado para fazer SIP conforme descrito no protocolo
1x solução salina balanceada de Hank (1x HBSS)	ThermoFisher	14175095	Armazenar a 4 ° C. Usado para fazer 35% SIP conforme descrito no protocolo
1x Solução salina tamponada com fosfato (PBS)			https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/western-blotting/buffers-recipes/10x-phosphate-buffered-saline.html Armazene 10xPBS em temperatura ambiente. Prepare 1xPBS fresco diluindo uma parte de 10xPBS em nove partes de MilliQ dH20 e armazene-o a 4 & C por uma hora antes de usar. Certifique-se de que o pH do 1xPBS seja 7,0 antes da refrigeração.
35% SIP			Para fazer 20 mL de 35% SIP, use 7 mL de SIP e 13 mL de gelada 1&vezes; HBSS. Mantenha no gelo até o processamento adicional
APC-Cy7 rato anti-CD11b	BD Pharmingen 557657		Armazene em 4 > C ou mantenha no gelo quando em uso. Escudo da luz. Diluição por citometria de fluxo - 1:100
FITC rat anti mouse CD145	BD Pharmingen	553080	Armazene a 4 ° C ou mantenha no gelo quando em uso. Escudo da luz. Diluição por citometria de fluxo - 1:100
VIVO/MORTO Kit de Coloração de Células Mortas Azuis Fixável	ThermoFisher	L34961	Armazene a -20 °C. Adicione 50ul de DMSO a um tubo do corante, vortex completamente e centrifugue na velocidade máxima por 1 min. Faça 10µ L e armazená-las a -20 ° C. Utilizar uma alíquota nova para cada experiência e adicionar às amostras na diluição de 1:500.
Contas de compensação OneComp eBeads	ThermoFisher	01-1111-42	Loja em 4 ° C, vórtice completamente o tubo antes de adicionar ao(s) tubo(s) de amostra, mantenha no gelo quando em uso.
PE-Cy7 rato anti rato CD145	BD Pharmingen 552848		Armazenar em 4 ° C ou mantenha no gelo quando em uso. Escudo da luz. Diluição por citometria de fluxo - 1:100
Percoll pH8,5-9,5	Sigma	P1644	Armazenar a 4 °C. Para fazer 10 mL de Percoll Isotônico Padrão (SIP): Use 9 mL de Percoll frio e 1 mL de frio 10&vezes; HBSS.
Microesferas conjugadas com ficoeritrina	ThermoFisher	F13083	Armazenar a 4 ° C ou mantenha no gelo quando em uso.
β-Amilóide (1 - 42), HiLyte Fluor 488 - marcado, AnaSpec Humano		AS-60479-01	A concentração final de fibrilas Ab é 200µ M que é então diluído antes do uso. Armazene a -20 graus C. Prepare uma nova solução de trabalho para cada experimento.