Name: Trapianto sottoretinico di tessuto retinico derivato da cellule staminali embrionali umane in un modello animale felino di grandi dimensioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Scopri la tecnica chirurgica per il trapianto sottoretinico di organoidi retinici derivati da cellule staminali embrionali umane in un modello felino di grandi dimensioni. Questo metodo avanzato permette la somministrazione diretta del tessuto al sito bersaglio per terapie cellulari contro le degenerazioni retiniche.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione NEI Fast-track SBIR R44-EY027654-01A1 e dalla sovvenzione SBIR 3 R44 EY 027654 - 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; Dr. Petersen-Jones è un co-PI). Gli autori desiderano ringraziare la signora Janice Querubin (MSU RATTS) per il suo aiuto con l'anestesia e la cura generale per gli animali inclusi in questo studio, nonché l'aiuto con l'impostazione chirurgica e la preparazione / sterilizzazione degli strumenti. Gli autori desiderano ringraziare la dottoressa Paige Winkler per l'aiuto nel ricevere gli organoidi e metterli nei media il giorno prima dell'impianto e per l'aiuto il giorno dell'impianto. Gli autori sono anche grati al signor Randy Garchar (LCTX) per la spedizione diligente di organoidi retinici, assemblando lo spedizioniere e scaricando i record di temperatura e stress G dopo ogni spedizione. Questo lavoro è stato eseguito mentre l'autore Igor Nasonkin era impiegato da Biotime (ora Lineage).

Ratnesh K. Singh, Ph.D., Francois Binette, Ph.D., e Igor O. Nasonkin Ph.D. sono dipendenti di Lineage Cell Therapeutics, Inc. Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

L'impianto di tessuto retinico derivato da hPSC (organoidi retinici) nello spazio sottoretinico è un approccio sperimentale promettente per ripristinare la vista per le malattie degenerative retiniche in stadio avanzato causate dalla morte delle cellule PR (cecità profonda o terminale). L'approccio presentato si basa su una terapia sperimentale precedentemente sviluppata e testata con successo basata sull'innesto sottoretinico di un pezzo di tessuto retinico fetale umano23,24,25<sup cla...

Milioni di persone in tutto il mondo sono colpite dalla degenerazione retinica (RD) con conseguente compromissione visiva o cecità associata alla perdita dei fotorecettori sensibili alla luce (PR). La degenerazione maculare legata all'età (AMD) è una delle principali cause di cecità derivante da una combinazione di fattori di rischio genetici e fattori ambientali / stile di vita. Inoltre, oltre 200 geni e loci sono stati trovati per causare RD ereditaria (IRD)1. La retinite pigmentosa (RP), l'IRD più comune, è geneticamente eterogenea con più di 3.000 mutazioni genetiche in circa 70 geni segnalati 2,3,4. Anche l'amaurosi congenita di Leber (LCA), che causa cecità nell'infanzia, è geneticamente eterogenea 5,6. La terapia di aumento genico è stata sviluppata ed è in studi clinici per il trattamento di un piccolo numero di IRD 3,7. Tuttavia, deve essere sviluppata una terapia separata per il trattamento di ciascuna forma genetica distinta di IRD e quindi trattare solo un piccolo sottogruppo di pazienti. Inoltre, l'aumento genico si basa sulla presenza di una popolazione di fotorecettori salvabili e, pertanto, non è applicabile per la degenerazione avanzata.
Vi è, quindi, un bisogno clinico urgente e ancora insoddisfatto per lo sviluppo di terapie che affrontino e trattino le RD avanzate e la cecità da profonda a terminale. Negli ultimi 2 decenni gli impianti neuroprotesici sono stati sviluppati e testati in modelli animali di grandi dimensioni, come il gatto, prima dell'uso umano 8,9,10,11,12,13,14. Allo stesso modo, negli ultimi 20 anni sono state sviluppate terapie di sostituzione della retina retinica di mammiferi embrionali o addirittura mature innestate sottoretiniche 15,16,17,18,19,20,21,22 e persino testate con successo in pazienti con RD 23,24,25. Entrambi gli approcci utilizzano l'idea di introdurre nuovi sensori (fotodiodi fotovoltaici al silicio nel caso di dispositivi neuroprotesici26,27 e fotorecettori sani privi di mutazioni organizzati in fogli, nel caso di impianto di fogli retinici) nella retina con PR degenerati. Studi recenti hanno studiato l'uso di approcci basati su cellule staminali come il trapianto di progenitori retinici derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)28,29, fotorecettori hPSC 30 e organoidi retinici hPSC31,32,33. Gli organoidi retinici consentono la formazione di tessuto retinico in un piatto e la derivazione di fogli fotorecettori con migliaia di PR privi di mutazione, che assomigliano allo strato di fotorecettori nella retina fetale umana in via di sviluppo 34,35,36,37,38,39,40. Il trapianto di tessuto retinico derivato da hPSC (organoidi) nello spazio sottoretinico di pazienti con condizioni di RD è uno dei nuovi e promettenti approcci di terapia cellulare sperimentale, perseguito da un certo numero di team31,32,41,42. Rispetto al trapianto della sospensione cellulare (di giovani fotorecettori o progenitori della retina), è stato dimostrato che fogli trapiantati di fotorecettori fetali determinano miglioramenti della vista negli studi clinici23,24.
Il protocollo qui presentato descrive, in dettaglio, una procedura di trapianto per la consegna sottoretinica dell'intero organoide retinico (piuttosto che dei bordi organoidi33,41) come un modo potenzialmente migliore per introdurre fogli retinici intatti con PR, per aumentare la sopravvivenza dell'innesto e migliorare la conservazione del foglio. Sebbene le procedure per l'introduzione di un pezzo piatto di retina umana e anche di cerotti RPE siano stati sviluppati43,44,45, il trapianto di innesti 3D più grandi non è stato studiato. Gli organoidi retinici derivati dalle cellule staminali forniscono una fonte inesauribile di fogli fotorecettori per lo sviluppo di tecnologie di ripristino della vista, sono privi di restrizioni etiche e sono considerati un'eccellente fonte di tessuto retinico umano per terapie incentrate sul trattamento della RD avanzata e della cecità terminale46. Lo sviluppo di metodi chirurgici per l'impianto sottoretinico preciso di organoidi retinici con lesioni minime alla nicchia retinica dell'ospite (retina neurale, epitelio pigmentato retinico e vascolarizzazione retinica e coroideale) è uno dei passi critici per far avanzare tale terapia verso applicazioni cliniche31,32. Grandi modelli animali come gatti, cani, maiali e scimmie hanno dimostrato di essere buoni modelli per studiare i metodi di consegna chirurgica e per dimostrare la sicurezza di fogli di tessuto impiantati (cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE)) e studiare l'uso di organoidi 41,44,45,47,48,49,50 . Il grande occhio animale ha dimensioni del globo simili a quelle umane e un'anatomia simile, compresa la presenza di una regione ad alta densità di fotorecettori, compresi i coni (l'area centrale), simile alla macula umana 6,51,52.
In questo manoscritto viene descritta una tecnica per l'impianto di tessuto retinico derivato da hPSC (organoidi) nello spazio sottoretinico di modelli animali felini di grandi dimensioni (sia gatti wild-type che CrxRdy / +), che, insieme a risultati di efficacia promettenti32,53, costruisce una base per l'ulteriore sviluppo di tale terapia sperimentale verso applicazioni cliniche per il trattamento di condizioni RD.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m pore siringa filtro con membrana PES</td><td>Cameo</td><td>NA</td><td>può essere trovato attraverso vari fornitori</td></tr><tr><td>iniettore sottoretinico 23G con cannula estensibile da 41 G</td><td>DORC</td><td>1270.EXT</td><td></td></tr><tr><td>250 & micro; L hamilton siringa luer lock a tenuta di gas</td><td>Hamilton</td><td>NA</td><td>può essere trovato attraverso vari fornitori</td></tr><tr><td>6-0 Sutura di seta</td><td>Ethicon</td><td>707G</td><td></td></tr><tr><td>6-0/7-0 sutura poliglactina</td><td>Ethicon</td><td>J570G</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazina maleato 500mg/5mL (Aceproject)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>NA</td><td>può essere trovato attraverso vari fornitori</td></tr><tr><td>Buprenorfina 0,3 mg/mL</td><td>Par Farmaceutico</td><td>NA</td><td>può essere trovato attraverso vari fornitori</td></tr><tr><td>cSLO + SD-OCT</td><td>Heidelberg Engineering</td><td>Spectralis HRA+ OCT</td><td></td></tr><tr><td>Ciclosporina</td><td>Novartis</td><td>NA</td><td>può essere trovato attraverso vari fornitori</td></tr><tr><td>Desametasone 2mg/mL (Azium)</td><td>Vetone</td><td>NA</td><td>può essere trovato attraverso vari fornitori</td></tr><tr><td>Doxiclina 25mg/5mL</td><td>Cipla</td><td>NA</td><td>può essere trovato tramite vari fornitori</td></tr><tr><td>Soluzione Fatal Plus (soluzione di pentobarbital)</td><td>Vortech</td><td>NA</td><td>può essere trovato tramite vari fornitori</td></tr><tr><td>Gentamicina 20mg/2mL</td><td>Hospira</td><td>NA</td><td>può essere trovato tramite vari fornitori</td></tr><tr><td>Capillare in vetro (Borosilicato standard a canna singola a parete sottile (Schott Duran) Tubi in vetro</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150-4</td><td></td></tr><tr><td>Metilprednisolone attetato 40 mg/mL</td><td>Pfizer</td><td>NA</td><td>può essere trovato attraverso vari fornitori</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound)</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Olympic Vac-Pac Size 23</td><td>Natus</td><td>NA</td><td>può essere trovato attraverso vari fornitori</td></tr><tr><td>Soluzione di paraformaldeide al 16%</td><td>EMS</td><td>15719</td><td></td></tr><tr><td>Fenilefrina cloridrato 10% Soluzione oftalmica</td><td>Akorn</td><td>NA</td><td>può essere trovato tramite vari fornitori</td></tr><tr><td>Prednisolone 15mg/5mL</td><td>Akorn</td><td>NA</td><td>può essere trovato tramite vari fornitori</td></tr><tr><td>Propofol 500mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28)</td><td>Zoetis</td><td>NA</td><td>può essere trovato tramite vari fornitori</td></tr><tr><td>RetCam II video fundus camera</td><td>Clarity Medical Systems</td><td>NA</td><td>può essere trovato tramite vari fornitori</td></tr><tr><td>Triamcinolone 400mg/10mL (Kenalog-40)</td><td>Bristol -Myers Squibb Company</td><td>NA</td><td>può essere trovato attraverso vari fornitori</td></tr><tr><td>Tropicamide 1% soluzione oftalmica</td><td>Akorn</td><td>NA</td><td>può essere trovato attraverso vari fornitori</td></tr><tr><td>Vitrectomia 23G porta</td><td>Alcon</td><td>Accurus sistemi</td><td></td></tr><tr><td>Macchina per vitrectomia</td><td>Sistemi Alcon</td><td>Accurus</td><td></td></tr><tr><td>Forbici vitreo-retiniche verticali a 80 gradi con manico a pressione</td><td>Frimen</td><td>FT170206T</td><td></td></tr></tbody></table>

trapianto sottoretinico di tessuto retinico derivato da cellule staminali embrionali umane in un modello animale felino di grandi dimensioni

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Le condizioni degenerative della retina (RD) associate alla perdita dei fotorecettori come la degenerazione maculare legata all'età (AMD), la retinite pigmentosa (RP) e l'amaurosi congenita di Leber (LCA) causano una perdita progressiva e debilitante della vista. C'è un bisogno insoddisfatto di terapie in grado di ripristinare la visione una volta che i fotorecettori sono stati persi. Il trapianto di tessuto retinico derivato da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) (organoidi) nello spazio sottoretinico di un occhio con RD avanzata porta fogli di tessuto retinico con migliaia di fotorecettori sani privi di mutazioni e ha il potenziale per trattare la maggior parte / tutte le malattie accecanti associate alla degenerazione dei fotorecettori con un protocollo approvato. Il trapianto di tessuto retinico fetale nello spazio sottoretinico di modelli animali e persone con RD avanzata è stato sviluppato con successo, ma non può essere utilizzato come terapia di routine a causa di preoccupazioni etiche e limitato apporto di tessuti. I modelli animali di degenerazione retinica ereditaria (IRD) dei grandi occhi sono preziosi per lo sviluppo di terapie di ripristino della vista che utilizzano approcci chirurgici avanzati per trapiantare cellule / tessuti retinici nello spazio sottoretinico. Le somiglianze nelle dimensioni del globo e nella distribuzione dei fotorecettori (ad esempio, la presenza di un'area centrale della regione simile alla macula) e la disponibilità di modelli IRD che ricapitolino strettamente l'IRD umana faciliterebbero la rapida traduzione di una terapia promettente alla clinica. Qui viene presentata una tecnica chirurgica di trapianto di tessuto retinico derivato da hPSC nello spazio sottoretinico di un grande modello animale che consente la valutazione di questo approccio promettente in modelli animali.

Questa procedura consente l'impianto riuscito e riproducibile di organoidi retinici derivati da hPSC nello spazio sottoretinico di un modello animale di grandi dimensioni (dimostrato qui utilizzando 2 esempi: gatti wild-type con fotorecettori sani (PR) e gatti CrxRdy / + con PR e retina degenerativi). Utilizzando i passaggi indicati nella Figura 1 , preparare e caricare gli organoidi retinici derivati da hPSC nella cannula di vetro borosilicato del dispositivo di...

Qui viene presentata una tecnica chirurgica per il trapianto di tessuto retinico derivato da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) nello spazio sottoretinico di un grande modello animale.

Trapianto sottoretinico di tessuto retinico derivato da cellule staminali embrionali umane in un modello animale felino di grandi dimensioni

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

L'attuale protocollo mostra in dettaglio la consegna sottoretinica dell'intero organoide retinico in un grande modello animale, con l'obiettivo di sviluppare approcci di terapia cellulare per la degenerazione retinica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la consegna di organoidi direttamente al tessuto bersaglio, la retina. La tecnica mira a trattare condizioni degenerative retiniche veicoche avanzate, come la degenerazione maculare legata all'età, la retinite pigmentosa o l'amaurosi congenita di Leber.A dimostrare la procedura sarà il Dr.Peterson Jones. Per l'impianto sottoretinico degli organoidi, utilizzare le forbici per tenotomia di Stevens per eseguire una cantotomia laterale da 0,5 a 1 centimetro in un gatto anestetizzato a digiuno notturno di quattro mesi e posizionare uno speculum palpebrale di Barraquer di dimensioni appropriate nell'incisione per mantenere le palpebre aperte con un assistente chirurgico che irriga regolarmente la cornea con BSS durante la procedura. Utilizzare una pinza da legatura corneale Castroviejo 0,5 e una piccola emostatica di zanzara per afferrare delicatamente la congiuntiva bulbare vicino al limbus.Posizionare due suture di seta 6-0 nella congiuntiva immediatamente adiacente al limbus nelle posizioni a ore 4 e 8 per tenere l'occhio nello sguardo primario e per ritrarre la terza palpebra. Bloccare le estremità delle suture con piccoli emostatici di zanzara per aiutare la loro manipolazione e posizionare un'altra sutura a ore 12 nel limbus parzialmente attraverso lo spessore del limbus, facendo attenzione a non penetrare nell'occhio. Annodare liberamente la sutura, tagliando l'estremità corta, e posizionare una sutura di soggiorno nella congiuntiva immediatamente adiacente al limbus a ore 4 per tenere l'occhio e lo sguardo primario.Riflettere la congiuntiva bulbare tra le ore 10 e le ore 2 e utilizzare le forbici per tenotomia per incidere la congiuntiva a due o tre millimetri dal limbus. Minare la congiuntiva e liberare la capsula di Tenon per esporre la sclera nei siti della porta vitrectomia a ore due e 10 da tre a cinque millimetri dal limbus. Utilizzare i calibri per identificare i siti per la sclerotomia, evitando i principali vasi sclerali che possono essere prominenti nel gatto.Pianificazione di una regione di tre millimetri alla porta dello strumento a ore 10 per un chirurgo destrorso, pre-posizionare suture a modello crociato poliglactina 6-0 o 7-0 senza legare i siti delle sclerotomie proposte. Una volta che le suture sono in posizione, chiedi all'assistente di afferrare le suture a ore 12 per aiutare a mantenere il globo in posizione e usa una pinza Castroviejo da 0,12 millimetri per tenere il tessuto vicino al sito di sclerotomia. Utilizza un trocar per introdurre una porta di vitrectomia calibro 23 attraverso la sclera in entrambe le posizioni a ore 2 e 10 angolate verso il nervo ottico per evitare il contatto con la lente e utilizzare una pinza di legatura per spingere delicatamente la porta di irrigazione per determinare se le punte possono essere visualizzate all'interno del vitreo.Chiedi all'assistente di posizionare una lente vitrectomia irrigua Machemer sulla cornea per consentire la visualizzazione del segmento posteriore dell'occhio e una taglierina per sonda per vitrectomia calibro 23 attraverso la porta dello strumento per eseguire una vitrectomia parziale del nucleo. Quindi, introdurre l'ago di una siringa da un millilitro contenente un millilitro di soluzione di triamcinolone nella porta dello strumento e iniettare da 250 a 500 microlitri della sospensione cristallina. Quando la soluzione è stata consegnata, far avanzare la sonda vitrectomia attraverso la porta dello strumento per chiudere la testa del nervo ottico con la porta rivolta lontano dalla superficie retinica.Utilizzare l'alto vuoto per aiutare a staccare la faccia vitreale dalla retina, inserire l'iniettore attraverso la porta dello strumento verso la superficie retinica ed estrudere la punta della cannula. Premere delicatamente la punta della superficie retinica e chiedere all'assistente di esercitare una leggera spinta rapida sullo stantuffo della siringa per avviare il distacco della retina, riducendo la pressione di iniezione per consentire un lento aumento del distacco di retina fino a raggiungere la dimensione desiderata. Utilizzare una cannula calibro 41 dell'iniettore per allargare leggermente il distacco fino a quando non è possibile introdurre le forbici retiniche e rimuovere la porta sclerale.Quindi utilizzare un coltello a fessura dritto da 2,850 millimetri orientato verso il nervo ottico per evitare di toccare la lente per ingrandire la sclerotomia in questo sito. Effettuare la retinotomia sul bleb lontano dal nervo ottico per evitare di danneggiare le fibre nervose retiniche provenienti dalla regione trapiantata ed evitare di tagliare i principali vasi retinici per ridurre il rischio di emorragia. Per impiantare gli organoidi, inserire un capillare di vetro caricato con organoidi attraverso la sclerotomia allargata verso il sito di retinotomia e utilizzare la punta del capillare per aprire leggermente la retinotomia per consentire l'accesso all'apertura del bleb sottoretinico.Chiedere all'assistente di premere lentamente lo stantuffo dell'iniettore per iniettare gli organoidi nel bleb sottoretinico. BSS dovrebbe procedere organoidi, gli organi, e lavare la retinotomia aperta. Quando tutti gli organoidi sono stati consegnati, lasciare il capillare di vetro in posizione per alcuni secondi prima di rimuovere lentamente il capillare dall'occhio, avendo cura di evitare qualsiasi rilascio improvviso di liquido.Quando il capillare è stato rimosso, chiudere la sclerotomia usando la sutura pre-posizionata in uno schema crociato. Chiedi all'assistente di rimuovere la porta di infusione e legare rapidamente la sutura della sclerotomia e chiudere la peritomia con le suture di poliglactina in un semplice schema continuo. Chiudere la cantotomia laterale con una sutura poliglactina 6-0 e suture cutanee a figura otto per eseguire il canto laterale e utilizzare semplici suture cutanee interrotte per chiudere il resto della ferita.Quindi somministrare il cocktail di steroidi e antibiotici post-chirurgici appropriati. Il carico di organoidi retinici derivati da cellule staminali pluripotenti umane può essere confermato all'interno della cannula di vetro del dispositivo di iniezione e durante l'intervento chirurgico mediante visualizzazione diretta. La presenza degli organoidi all'interno dello spazio sottoretinico può essere confermata postoperatoriamente dall'esame oftalmico e dall'imaging del fondo oculare.Prima dell'eutanasia, l'oftalmoscopia laser a scansione confocale e l'imaging con tomografia a coerenza ottica del dominio spettrale possono anche essere eseguiti per valutare la posizione degli organoidi. Queste tecniche possono essere utilizzate per dimostrare la persistenza di organoidi retinici nello spazio sottoretinico tra la retina neurale e l'epitelio pigmentato retinico dell'occhio ricevente. Le analisi istologiche e immunoistochimiche possono essere utilizzate per illustrare la sopravvivenza dei grafici xenogenici all'interno dello spazio sottoretinico di un grande occhio in un animale immunosoppresso.Solo coloro che sono esperti in chirurgia vitreoretinica, come oftalmologi veterinari addestrati o chirurghi vitreoretinici che hanno familiarità con le differenze di specie nell'occhio di gatto rispetto all'occhio umano dovrebbero intraprendere questa procedura. La tecnica presentata in questo video dovrebbe essere applicabile ad altri modelli animali di grandi dimensioni che vengono utilizzati per tradurre le tecniche chirurgiche vitreoretiniche alle cliniche.

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