Laser Doppler Perfusion Imaging i musen Hindlimb

Hudsår med otillräcklig sårläkning är en ledande orsak till amputation hos mänskliga patienter. Adekvat sårläkning kräver högre nivåer av kranskärlens överflöd som behövs för att upprätthålla intakt hud, som äventyras hos patienter med perifer arteriell sjukdom. Flera andra reumatologiska tillstånd och diabetes kan också leda till störd och otillräcklig hudmikrocirkulation för att läka sår.

Många diabetiker patienter har samtidig perifera kranskärlens sjukdom, vilket placerar dem i särskilt hög risk för amputation. Laser Doppler perfusion imaging eller LDPI används i kliniska situationer för att utvärdera hudens mikrocirkulation samt i forskningssituationer för att utvärdera blodflöde och blodflöde återhämtning efter experimentell hindlimb ischemi, ischemi reperfusion och mikrokirurgiska klaffar. LDPI-systemet projicerar en lågeffektlaserstråle som avleds av en skanningsspegel för att röra sig över en region av intresse.

Detta skiljer sig från laser Doppler flödesmetri, vilket ger en perfusionsmätning för det lilla området av vävnad i direkt kontakt med flödessonden. När laserstrålen interagerar med rörligt blod i mikrovaskulaturen genomgår den en Dopplerfrekvensförskjutning som fotodetecteds av skannern och omvandlas till godtyckliga perfusionsenheter. Eftersom LDPI är en ljusbaserad teknik är den begränsad när det gäller penetrationsdjup till 0,3 till 1 millimeter, vilket innebär att för det mesta bedöms dermal perfusion.

Dermalt flöde kan ändras av hudtemperaturen och det sympatiska nervsystemet, som kan påverkas av olika bedövningsmedel. Mätningar från den optiska lasern påverkas också av omgivande ljusförhållanden, hudpigmentering och kan blockeras av överbådande päls eller hår. LDPI är den vanligaste forskningstekniken för att övervaka profusionsåterhämtning efter ischemi eftersom det är icke-invasivt, inte kräver kontrastadministration och har snabba skanningstider som tillåter datainsamling på flera djur.

Detta gör det idealiskt för att avgöra om behandlingar som syftar till terapeutisk arteriogenes eller angiogenes är effektiva i små djurmodeller. Återhämtning av blodflödet efter bakbens ischemi mätt med LDPI korrelerar väl med utvecklingen av säkerhetsartären när den bedöms på annat sätt såsom mikrofyllningsgjutning eller mikro-CT. Målet med detta protokoll är att visa bedömningen av hindlimb perfusion med hjälp av LDPI. Justera skannerhöjden så att avståndet till skanningsobjektet är cirka 30 centimeter.

Slå på bildaren och starta den tillhörande programvaran. Öppna mätprogrammet. Om programvaran kommunicerar korrekt med skannern visas den infraröda laservarningen.

Justera skannerinställningarna så att de passar bakgrundsmaterialet och belysningsinställningarna i rummet. Ställ in bakgrundströskeln genom att rikta laserstrålen mot det svarta bakgrundsmaterialet och tryck på Auto BK Set. Ställ in induktionskammaren isofluran med lämplig rensning av spillgas.

Att placera induktionskammaren på en uppvärmningsplatta hjälper till att förhindra mustemperaturförlust under anestesiinduktion. Slå på den hematermiska filten, som placeras i skanningsområdet under en icke-reflekterande yta. I det här fallet ett svart neoprentyg.

Den hematermiska filten är inställd på att upprätthålla en kroppstemperatur på 37 grader Celsius. Placera temperatursonden och smörjmedlet så att de är klara för införing. Placera anestesi ansiktsmasken och rensningssystemet i skanningsområdet också.

Söv musen med en isofluranförångare. Syrehastigheten är inställd på en liter per minut flöde. Och isofluranen justeras till 4%för anestesiinduktion.

Flödet sätts på anestesiinduktionskammaren och musens andningshastighet saktar ner. Adekvat anestesi uppnås när musen förlorar sin högerreflex. Överför musen till en bedövningsmask näskon med fäst spillgasrenare och justera isofluranen till 1,5%Denna anestesinivå är i allmänhet tillräcklig för att hålla musen liggande relativt stilla under skanning men är inte avsedd att ge kirurgiska nivåer av anestesi.

Så anestesidjupet kontrolleras inte. Att ändra isoflurannivån orsakar förändringar i hjärtfrekvens, andning och hudprofusion. Så en konsekvent procentandel bör användas under alla tidskursexperiment och för alla experimentella ämnen.

Alternativa bedövningsmedel tekniker, såsom IP injektion av ketamin xylazin kan också användas men samma bedövningsteknik bör användas under hela kursen studie som olika anestetika påverkar dermal profusion annorlunda. Om den planregion av intresse som ska skannas täcks av päls, använd en liten elektrisk trimmer och/eller depilatorisk kräm för att ta bort håret från intresseområdet. Depilatoriska krämerna ska tas bort helt och mushuden torkas innan den skannas eftersom våt hud kan orsaka reflektioner från lasern Sätt in den smörjda rektaltemperatursonden i samband med den hematermiska filten i musdroppen.

Balansera mustemperaturen för att önska skanningstemperatur, 37 grader Celsius. Detta kan ta upp till fem till tio minuter. Välj Skannerinställningar som kan nås från den övre menyn eller från ikonen Skannerinställningar.

Skanningsområdet bör justeras genom att X-, Y-koordinaterna ändras så att de passar den region som är av intresse. Skanningshastigheten beror på skanningsupplösningen. Högre upplösning resulterar i längre skanningstider.

För upprepad skanning, med fokus på global överflöd, i motsats till högre upplösning med fokus på anatomisk perfusion, är den högsta skanningshastigheten på fyra millisekunder per pixel tillräcklig. Om du utför upprepade skanningar väljer du fliken Upprepa och radskanning. Antalet skanningar kan ändras.

I det här fallet tre skanningar, liksom det upprepade intervallet. Den minsta tiden för upprepningsintervallet skulle vara de uppskattade skanningstiderna som visas i det nedtonade området till höger om rutan, som bestäms av skanningsområdet och skanningsupplösningen. Genom att lägga till några sekunder kan användaren pausa och eventuellt flytta musen om det behövs mellan skanningarna.

Den totala skanningstiden i det här fallet är tre minuter och 21 sekunder. Välj fliken Bildsökning och välj knappen Markera. Detta gör att lasern beskriver skanningsområdet.

Justera muspositionen så att målet som ska skannas ligger inom det markerade området. Starta upprepad mätning genom att välja ikonen Upprepa skanning och trycka på play-knappen för att initiera skanningen. Ett popup-fönster som bekräftar skanningsavståndet visas.

Klicka på OK för att börja skanna. Den första skanningen av en mus före induktion av hindlimb ischemi visas i realtid. Den andra och tredje upprepade skanningen accelereras till 16x hastighet.

Huvudfönstret visar resultaten av skanningen eftersom den genereras av programvaran. Infällningen längst ner till höger visar laserskanningen av musens fotplattor. För fotplatta eller fotplatta och dorsala kalvskanning ger benägen positionering med bakbenen utsträckta mot svansen en mer konsekvent region av intresse för supine positionering.

Lårartären, saphenous gatan och säkerheter är mycket nära den ventrala ytan av låret och kalven. Så supine positionering föredras om man använder dessa regioner av intresse. Övervaka musen under skanningen efter musrörelser.

Om musen rör sig tillräckligt för att fotplattorna inte längre finns i skanningsregionen mitt i en skanning startar du om skanningen. Små variationer i musfotplattans position kan rymmas för i analysprogramvara. Övervaka också mustemperaturen under skanningsprocessen eftersom den kan fluktuera även med hjälp av den hematermiska filten.

Om det finns för mycket variation i mustemperaturen kan detta resultera i betydande variation mellan skanningar. I allmänhet resulterar ett temperaturområde på 36,8 till 37,2 i acceptabla data. Spara den infångade genomsökningen under fönstret Spara som med ett filnamn som innehåller musidentifierare och tidspunkt för enklare dataanalys.

Ange information om mus och tidpunkt om så önskas i fönstret Ämnesinformation. Ventral bakbensskanning med musen i supin position visas här efter justering av skanningsområdet. Observera att förslaget med musen supine resulterar i att en variabel del av sidan av foten skannas.

Ta bort rektaltemperatursonden och desinficera den med 70% etanol så att den är redo för nästa mus. Minska isofluran till 0%Musen återhämtar sig snabbare om den fortsätter att få syre, men den kan också återvinnas utan extra syre. Låt musen återhämta sig från anestesi till den punkt där den visar en högerreflex genom att vända från den supin positionen till den utsatta positionen innan den returneras till buren.

Återhämtning kan utföras antingen på en värmande filt för isofluran, eftersom återhämtningen är mycket snabb eller i en varm återhämtningsbur för ketamin xylazin. Öppna programvaran för bildgranskning. Ett nytt fönster för att granska skanningar öppnas.

Gå till Arkiv-menyn, Öppna och leta reda på den sparade filen. Välj ROI-ikonen i verktygsfältet. Välj ikonen Lägg till polygon.

Spåra ett område runt den region som är av intresse med musen. När du är klar går du tillbaka till verktygsfältet och väljer ikonen Statistik. Detta kommer att ta upp ett fönster som visar statistik från intresseområdet.

Vid datagranskning varierar medelprofusionsenheten, eller PU, värdena inte mer än 100 till 150 PUs över de upprepade skanningarna för varje fotplatta. Detta är en acceptabel skanning och indikerar att musen var väl jämvikt under skanningen. Genomsnittliga PU-värden med variation större än 100 till 150 PUs, vilket motsvarar större än 10% av den genomsnittliga perfusionen för en icke-manövrerad musfotplatta över de upprepade skanningarna skulle indikera att musen inte var väl jämvikt och en upprepad skanning föreslås starkt.

Genom att utföra en snabb analys omedelbart efter att skanningen har slutförts kan en upprepad skanning utföras medan musen fortfarande bedövas och undvika att förlora en datapunkt som kan uppstå om skanningarna analyseras vid ett senare tillfälle och en skanning anses oacceptabel på grund av betydande variation mellan de upprepade skanningarna. Resultaten uttrycks som ett förhållande av kirurgisk hindlimb profusion över kontroll hindlimb perfusion som möss ursprungligen vasodilat och sedan utveckla sina inneboende säkerheter, blodflödet återhämtning av LDPI bör ses över en postoperativ tid kurs. Graden av återhämtning är beroende av musstammen och svårighetsgraden av hindlimb ischemi-modellen.

Denna siffra visar ett avslutat tidskursexperiment under 28 dagar där LDPI användes för att mäta fotplattans blodflödesåterhämtning över tid efter femoral arteriell ligatur och P27 knockout och vilda C57Bl/6 möss. Både P27 knockout i vilda typer möss hade nedsatt blod flöde återhämtning när behandlas med muntliga doxycycline, en generaliserad matris metalloproteinass hämmare, vilket tyder på att MMP verksamhet underlättar arteriogenesis. Förstärkningsinställningarna och bakgrundströskeln bör hållas konstanta under hela tidskursexperimentet.

Om bakgrundströskeln är för låg resulterar skanning av bakgrundsmaterialet i låga profusionsvärden. Detta kommer att resultera i att bakgrundsprofusionsvärdena i genomsnitt är indelade i intresseområdet under polygonvalet. För att eliminera det här problemet kan bakgrundströskeln justeras i fönstret Skannerinställningar under fliken Allmänt.

I det här fallet resulterar en ökning av bakgrundströskeln till 118 profusionsenheter i den grå bakgrunden som inte ingår i någon analys. Paletten eller färgskalan för flödesbilden kan justeras både i mätprogramvaran och bildgranskningsprogramvaran. Alla profusionsvärden som är större än det maximala värdet på skalan visas som den högsta överflödsfärgen.

I det här fallet, röd. Om du ökar det dynamiska området, till exempel ändrar du skalan så att den sträcker sig från noll till 1500, kommer att göra den upprepade skanningsvariationen mer uppenbar för ögat eftersom områden som mäter mellan 1 000 och 1 500 profusionsenheter nu visas med färggradienten i stället för att alla visas som röda. Skanningen som visas här erhölls i en mus vars kroppstemperatur ursprungligen var under 36,8 i början av den upprepade skanningen och sedan ökade över de upprepade skanningarna.

Observera att kontrollfotplattans genomsnittliga överflöd påverkades mer av den kallare kroppstemperaturen än den ischemiska fotplattan. En enda skanning av den svalare kroppstemperaturen skulle ha resulterat i att ett högre överflödsförhållande registrerades för denna datapunkt. Variation i mushudpigmentering, som kan ses med C57Bl/6 möss, kan leda till att skanningsområdet ligger under bakgrundströskelvärdet vilket kommer att göra det svårt att analysera regioner av intresse som innehåller pigmenterade områden.

Musfotplattorna i allmänhet har inte hyperpigmentering, vilket gör detta till det mest praktiska området att söka efter denna musstam. Om forskaren vill studera ventral bakben, bör en vit musstam väljas. LDPI är en effektiv, lätt utförd och repeterbar metod för att mäta hindlimb dermal profusion som en återspegling av övergripande kranskärlens perfusion.

Konsekvent teknik krävs när du använder LDPI för att få tillförlitliga data.