Name: Emplacement, dissection et analyse du ganglion radié murin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Apprenez à localiser et disséquer le ganglion stellaire murin pour étudier le système nerveux autonome cardiaque. Cette méthode permet d'analyser les mécanismes moléculaires impliqués dans les arythmies ventriculaires.

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Les auteurs tiennent à remercier Hartwig Wieboldt pour son excellente assistance technique, et l’installation d’imagerie par microscopie UKE (Umif) du centre médical universitaire de Hambourg-Eppendorf pour avoir fourni des microscopes et un soutien. Cette recherche a été financée par le DZHK (Centre allemand de recherche cardiovasculaire) [FKZ 81Z4710141].

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La compréhension des processus cellulaires et moléculaires dans les neurones et les cellules gliales du système nerveux sympathique qui précèdent l’apparition de l’AV est d’un grand intérêt, car l’arrêt cardiaque soudain reste la cause de décès la plus fréquente dans le monde5. Par conséquent, dans le manuscrit actuel, nous fournissons un répertoire de base de méthodes pour identifier le SG murin – un élément murin au sein de ce réseau – et effectuer des analyses ultérieures au niveau de l’ARN, de...

Le système nerveux autonome cardiaque est un équilibre étroitement régulé de composants sympathiques, parasympathiques et sensoriels qui permet au cœur de s’adapter aux changements environnementaux avec la réponse physiologique appropriée1,2. Des perturbations dans cet équilibre, par exemple, une augmentation de l’activité sympathique, ont été établies comme un facteur clé pour l’apparition ainsi que le maintien des arythmies ventriculaires (VA)3,4. Par conséquent, la modulation autonome, réalisée par l’intermédiaire de la réduction pharmacologique de l’activité sympathique avec des bêta-bloquants, a été une pierre angulaire dans le traitement des patients avec VA pendant des décennies5,6. Mais malgré les interventions pharmacologiques et à base de cathéter, un nombre pertinent de patients souffre toujours de VA7récurrent.
L’entrée sympathique au cœur est principalement médiée par l’intermédiaire de corps cellulaires neuronaux dans les ganglions étoilés (SG), structures bilatérales en forme d’étoile de la chaîne sympathique, qui relaient l’information via de nombreux nerfs intrathoraciques du tronc cérébral au cœur8,9,10. Le nerf germant du SG après blessure est associé à va et à la mort cardiaque subite11,12,soulignant le SG comme cible pour la modulation autonome13,14. Une réduction de l’apport sympathique au coeur peut être réalisée temporairement par injection percutanée d’anesthésiques locaux ou de façon permanente par retrait partiel du SG par thoracoscopie vidéo-assistée15,16. L’énervation sympathique cardiaque présente une option pour des patients présentant le VA thérapie-réfractaire avec des résultats prometteurs14,16,17. Nous avons appris de SG explanted de ces patients que le remodelage neuronal et neurochimique, la neuro-inflammation et l’activation glial sont des cachets du remodelage sympathique qui pourrait contribuer ou aggraver le dysfonctionnement autonome18,19. Pourtant, les processus cellulaires et moléculaires sous-jacents dans ces neurones restent obscurs à ce jour, par exemple, le rôle de la transdifférenciation neuronale dans un phénotype cholinergique20,21. Les études expérimentales présentent des approches nouvelles pour traiter l’AV, par exemple, la réduction de l’activité nerveuse sympathique via l’optogénétique22, mais la caractérisation en profondeur du SG fait encore défaut dans de nombreuses pathologies cardiaques qui vont de pair avec l’AV. Des modèles murins imitant ces pathologies permettent d’étudier le remodelage neuronal qui précède potentiellement l’apparition d’arythmies12,23. Ceux-ci peuvent être complétés par d’autres analyses morphologiques et fonctionnelles pour la caractérisation autonome du coeur et du système nerveux. Dans le protocole actuel, nous fournissons un répertoire de base des méthodes permettant de disséquer et de caractériser le SG murin pour améliorer l’entente de VA.

<table><tbody><tr><td>Plaque à 96 puits</td><td>TPP</td><td>92097</td><td>RNAscope</td></tr><tr><td>Lames d’adhérence SuperFrost plus&nbsp ; 25 x 75 x 1 mm</td><td>R. Langenbrinck</td><td>03-0060</td><td>Microscopie</td></tr><tr><td>Albumine bovine Fraction V récepteur lyophil.</td><td>Serva</td><td>11924.03</td><td>Coloration de monture entière</td></tr><tr><td>bisBenzimide H33342 trichlorhydrate (Hoechst)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>B2261</td><td>Coloration de monture entière</td></tr><tr><td>Poulet anti-neurofilament</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5539</td><td>Coloration de monture entière</td></tr><tr><td>Diméthyl sulfoxyde (DMSO)</td><td>Merck, KGA, Darmstadt, Allemagne</td><td>D8418</td><td>Coloration de monture</td></tr><tr><td>entière Donkey anti poulet IgY Alexa 647&nbsp ;</td><td>Merck, KGA, Darmstadt, Allemagne</td><td>AP194SA6</td><td>Coloration de monture entière Donkey</td></tr><tr><td>anti chèvre IgG Alexa 568&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11057</td><td>Montage entier coloration</td></tr><tr><td>Âne anti lapin IgG Alexa 488&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td>Montage entier coloration</td></tr><tr><td>Bloc de séchage 37-100 mm</td><td>Whatman (Sigma Aldrich)</td><td>WHA10310992&nbsp ;</td><td>Coloration de l’ensemble du montage</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4009</td><td>Coloration à montage entier</td></tr><tr><td>Éthanol 99 % dénaturé au MEK, IPA et Bitrex (min. 99,8 %)</td><td>Th.Geyer</td><td>2212.5000</td><td>Coloration à montage entier</td></tr><tr><td>Eukitt moyen de montage</td><td>AppliChem</td><td>253681.0008</td><td>Coloration à montage entier</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Coloration à montage entier</td></tr><tr><td>Fluoromount-G + DAPI</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-20</td><td>Coloration à monture entière</td></tr><tr><td>Chèvre anti choline acétyltransférase</td><td>EMD Millipore</td><td>AP144P</td><td>Coloration à monture entière</td></tr><tr><td>H2O2 30 % (w/p)</td><td>Merck, KGA, Darmstadt, Allemagne</td><td>H1009</td><td>Coloration à monture entière</td></tr><tr><td>Héparine sodique 25.000 UI / 5ml</td><td>Rotexmedica</td><td>PZN : 3862340</td><td>Préparation SG</td></tr><tr><td>Kit de transctiption inverse d’ADNc haute capacité</td><td>Life technologies</td><td>&nbsp ; 4368813</td><td>Isolement de l’ARN</td></tr><tr><td>Isoflurane (Forene)</td><td>Abbott Laboratories</td><td>2594.00.00</td><td>Préparation SG</td></tr><tr><td>Mayer’s hemalum solution</td><td>Merck</td><td>1.09249.0500</td><td>Coloration à monture entière</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>Coloration à monture entière</td></tr><tr><td>Verres de protection pour microscope 20x20 mm ou moins</td><td>Marienfeld</td><td>0101040</td><td>Coloration à monture entière</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>isolement de l’ARN</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000C</td><td>Isolement de l’ARN</td></tr><tr><td>Opal 570 Pack de réactifs</td><td>Akoya Bioscience</td><td>FP1488001KT</td><td>RNAscope</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde, 16 % p/v aq. soln., sans méthanol&nbsp ;</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368</td><td>Coloration à montage entier</td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur, LDPE, non stérile, 3 ml, 154 mm</td><td>Th.Geyer</td><td>7691202</td><td>Coloration à montage entier</td></tr><tr><td>Comprimés de solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td>Coloration à montage entier</td></tr><tr><td>Pinzette Dumont SS Forceps</td><td>FineScienceTools</td><td>11203-25</td><td>Préparation SG</td></tr><tr><td>QIAzol Lysis Reagent</td><td>Qiagen&nbsp ;</td><td>79306</td><td>Isolement de l’ARN</td></tr><tr><td>Lapin anti tyrosine hydroxylase</td><td>EMD Millipore</td><td>AB152</td><td>Coloration à montage entier</td></tr><tr><td>ARNLATER</td><td>Merck</td><td>R0901-100ML</td><td>Isolement de l’ARN (facultatif)</td></tr><tr><td>RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2</td><td>biotechne (ACD)</td><td>323100</td><td>RNAscope</td></tr><tr><td>RNAscope Probe-mm-S100B-C2</td><td>biotechne (ACD)</td><td>431738-C2</td><td>RNAscope</td></tr><tr><td>RNAscope Probe-Mm-Tubb3</td><td>biotechne (ACD)</td><td>423391</td><td>RNAscope</td></tr><tr><td>Billes d’acier inoxydable 7 mm&nbsp ;</td><td>Qiagen&nbsp ;</td><td>69990</td><td>Isolement de l’ARN</td></tr><tr><td>Sudan black B</td><td>Roth</td><td>0292.2</td><td>Coloration de l’ensemble du montage</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay Cdkn1b (Mm00438168_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> 4331182 Analyse de <td>l’expression</td><td>génique</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay Choline acétyltransférase (Mm01221880_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>Analyse</td></tr> <tr><td>de l’expression géniqueTaqMan Gene Expression Assay MKi67 (Mm01278617_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>Analyse de l’expression génique</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay PTPCR (Mm01293577_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>Analyse de l’expression génique</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay S100b (Mm00485897_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331182</td><td>Analyse</td></tr> <tr><td>de l’expression géniqueTaqMan Gene Expression Assay Tyrosin Hydroxylase (Mm00447557_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> 4331182 Analyse de <td>l’expression</td><td>génique</td></tr><tr><td>TaqMan mastermix</td><td>Biosystèmes appliqués</td><td>4370074</td><td>Analyse de l’expression génique&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tissue Lyser II</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>Isolement de l’ARN</td></tr><tr><td>Triton X-100 Solution à 10 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ml</td><td>Coloration à montage entier</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-100ML</td><td>RNAscope</td></tr><tr><td>Stylo en bambou Wacom</td><td>Wacom</td><td>CTL-460/K</td><td>Mesures de la taille des cellules</td></tr><tr><td>Papier filtre qualitatif préplissé Whatman, Grade 595 1/2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA10311647</td><td>Coloration à montage entier</td></tr><tr><td>Germe de blé Agglutinine, Alexa Fluor 633 Conjugué</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W21404</td><td>RNAscope</td></tr></tbody></table>

emplacement, dissection et analyse du ganglion radié murin

Location, Dissection, and Analysis of the Murine Stellate Ganglion

Le système nerveux autonome est un moteur important de l’électrophysiologie cardiaque. Particulièrement le rôle de sa branche sympathique est une question continue de recherche dans la pathophysiologie des arythmies ventriculaires (VA). Les neurones dans les ganglions étoilés (SG)   – structures bilatérales en forme d’étoile de la chaîne sympathique –   sont une composante importante de l’infrastructure sympathique. Le SG sont une cible identifiée pour le traitement par l’intermédiaire de l’énervation sympathique cardiaque dans les patients présentant le VA thérapie-réfractaire. Tandis que la retouche neuronale et l’activation glial dans le SG ont été décrites dans les patients présentant le VA, les processus cellulaires et moléculaires fondamentaux qui précèdent potentiellement le début de l’arythmie sont seulement insuffisamment compris et devraient être élucisés pour améliorer la modulation autonome. Les modèles murins nous permettent d’étudier le remodelage neuronal sympathique, mais l’identification du SG murin est difficile pour l’investigateur inexpérimenté. Ainsi, les études biologiques cellulaires et moléculaires approfondies du SG murin font défaut pour beaucoup de maladies cardiaques communes. Ici, nous décrivons un répertoire de base pour disséquer et étudier le SG chez les souris adultes pour des analyses au niveau de l’ARN (isolement de l’ARN pour les analyses d’expression génique, hybridation in situ), au niveau des protéines (coloration immunofluorescente de monture entière) et au niveau cellulaire (morphologie de base, mesure de la taille cellulaire). Nous présentons des solutions potentielles pour surmonter des défis dans la technique de préparation, et comment améliorer la souillure par trempe de l’autofluorescence. Cela permet la visualisation des neurones ainsi que des cellules gliales via des marqueurs établis afin de déterminer la composition cellulaire et les processus de remodelage. Les méthodes présentées ici permettent de caractériser le SG pour obtenir davantage d’informations sur le dysfonctionnement autonome chez les souris sujettes à VA et peuvent être complétées par des techniques supplémentaires étudiant les composants neuronaux et glial du système nerveux autonome dans le coeur.

La figure 1 montre comment identifier et disséquer le SG. La figure 1A montre un dessin schématique de l’emplacement, tandis que la figure 1B présente la vue dans le thorax après le retrait de l’emballage cœur-poumon. Les muscles gauches et droits de colli de longus médiaux du SG et de la cage thoracique sont des points de repère importants pour l’orientation. La dissection est effectuée le long des lignes pointillées entre les musc...

Les changements pathophysiologiques du système nerveux autonome cardiaque, particulièrement dans sa branche sympathique, contribuent au début et à l’entretien des arythmies ventriculaires. Dans le protocole actuel, nous montrons comment caractériser les ganglions radiés murins pour améliorer la compréhension des processus moléculaires et cellulaires sous-jacents.

Emplacement, dissection et analyse du ganglion radié murin

The autonomic nervous system is a substantial driver of cardiac electrophysiology. Especially&#160;the role of its sympathetic branch is an ongoing matter ...

Chaque battement de cœur est sous le contrôle étroit du système nerveux sympathique. La plupart des neurones du neurocontrôle cardiaque interagissent avec les ganglions stellaires. Notre protocole permet d’étudier les processus sous-jacents.Avec la vidéo et les images à portée de main, même l’enquêteur inexpérimenté peut trouver le ganglion étoilé chez la souris et appliquer les techniques à différents modèles de maladies. Le système nerveux sympathique est un élément clé de l’arythmogenèse cardiaque. La modulation des ganglions stellaires semble prometteuse dans le traitement des patients atteints d’arythmies ventriculaires potentiellement mortelles.La compréhension des processus cellulaires et moléculaires dans les neurones et les cellules gliales pourrait ouvrir la voie à des thérapies ciblées. Le principal défi de ce protocole est de localiser les ganglions stellaires. Nous recommandons d’effectuer une coloration de contrôle pour la tyrosine hydroxylase au début afin d’évaluer la qualité de la préparation.Après l’extraction du cœur et des poumons, placez le torse de la souris sous un stéréomicroscope. Assurez-vous d’un bon éclairage avec une source de lumière externe et rincez

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Les principaux ganglions pelviens contiennent des neurones parasympathiques et sympathiques qui innervent les organes pelviens. Ici, nous décrivons une méthode de dissection et fournissons des schémas pour l’identification de ces ganglions et de leurs nerfs associés. Ces méthodes peuvent être appliquées à la manipulation expérimentale de ces ganglions in vivo ou de l’ablation post-mortem pour une étude plus approfondie.

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Ce protocole décrit la préparation détaillée et à faible entrée de l’échantillon pour le séquençage à noyau unique, y compris la dissection des ganglions cervicaux et stellaires supérieurs de souris, la dissociation cellulaire, la cryoconservation, l’isolement du noyau et le codage à barres hashtag.

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