Neuroscience
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生きた哺乳類聴覚毛細胞におけるナノスケール分解能によるステレオシリアバンドルイメージング
Chapters
Summary January 21st, 2021
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ここでは、ホッピングプローブイオン伝導顕微鏡(HPICM)、ライブ聴覚ヘアセルの立体束のナノスケールイメージングを可能にする非接触スキャンプローブ技術のプロトコルを提示します。
Transcript
この実用的な研究は、ヘアセルステレオチリアバンドルの表面における機械的電気伝達機構のナノ構造成分の動的変化を研究するのに役立ちます。この技術の主な利点は、単一のナノメートル解像度で、サンプルと物理的に接触することなく、複雑な地形を有する生細胞の表面のタイムラプスイメージングである。この技術は、ほぼすべての生きた細胞に適用することができます。
私たちは以前、ウイルス、筋肉細胞に感染した肺上皮細胞株の表面を私のイメージバクテリアススーンで一致させた。各イメージングセッションの開始時にナノピペットをテストします。ナノピペットを製造した後、気泡を確認し、存在する場合は気泡を取り除き、ホッピングプローブイオン伝導顕微鏡ピペットホルダーにナノピペットを取り付けます。
チャンバーに4ミリリットルの浴液で、チャンバーをHPICMステージに置きます。グランド電極を浴室の溶液に導入し、パッチクランプアンプを通してピペットに印加される電圧がゼロであることを確認します。マイクロマニピュレータを垂直位置に配置した後、ピペットをZに移動して液体に触れ、アンプのオフセットをゼロに設定してから、ピペット電流を確認するためにプラス100ミリボルトを追加します。
シリコン接着剤を使用して、AFMキャリブレーション標準をチャンバに取り付け、サンプルを4ミリリットルのHBSSで覆います。HPICMセットアップのX Y段階にチャンバを固定するために両面テープを使用し、実証したようにホルダーに新しいナノピペットをロードします。ナノピペットの抵抗と直径をテストした後、電流を1ナノアンプに設定します。
粗いパッチクランプマニピュレータを使用して、ナノピペットをキャリブレーション標準の中心より上に配置し、セットポイントを大きくして、オシロスコープ上のZピエゾアクチュエータのセンサーからの信号をリアルタイムで監視します。安定した反復可能なZアプローチサイクルを確立した後、セットポイントを不安定な点のすぐ上の値まで下げ、ピペットを1秒あたり約5ミクロンの速度で下に移動させ、サンプルに到達するまで下に移動します。リアルタイムZポジショニング信号の底面レベルが上昇し、試料表面を感知してナノピペットが抜け出すことを示す。
AFM規格に不均一なマウントがあるため、対象領域の最高点は不明である可能性があります。したがって、ピペットの引き込みの振幅を少なくとも200〜500ナノメートルに設定する。Zピエゾアクチュエータ運動の上限を超えないように注意し、低解像度で撮像を開始する。
一度、イメージング領域内のサンプルの最高点が特定されたら、ホップ振幅を減少させ、ピペットをZ軸に沿って約200ミクロン引き込み、サンプルとの望ましくない衝突を防いでから新しいX Y位置に移動します。対象領域が見つかったら、より高い解像度でイメージングを開始します。聴覚ヘアセルイメージングの場合、歯科フロスまたはフレキシブルガラスピペットを使用して、コルティの新たに単離された器官をチャンバーにしっかりと固定します。
両面テープを使用して、チャンバーをX Yピエゾステージにしっかりと固定し、デモンストレーションしたようにホルダーに新しいナノピペットを積み込みます。ナノピペット耐性を確認した後、パッチクランプマイクロマニピュレータを使用して、逆顕微鏡でCorti X植物の器官を観察しながら、ナノピペットを毛細胞領域の上に配置します。記録、オシロスコープ上のリアルタイム電流とZ位置信号は、システムが0.5%6または低い設定点で安定しているかどうかを確認し、最適な設定点を決定し、サンプルにアプローチする例示のように。
少なくとも6~8ミクロンのホップ振幅を使用して示されているように、サンプルの低解像度イメージングを実行します。ナノピペットを新しいX Y位置に移動する必要がある場合は、ピペットを約500ナノメートル引き込んで組織内の高い特徴との衝突を避け、毛髪細胞が配置される対象領域まで低解像度のHPICMイメージングを繰り返します。その後、15分以内に高い解像度で対象領域を画像化します。
HPICM プロトコルは、ラットの聴覚毛細胞バンドルなどの複雑な地形を持つ任意の生細胞を視覚化するために使用できます。走査型電子顕微鏡画像と比較して低いXY解像度を示しているにもかかわらず、HPICM画像は異なる立体線を正常に解決することができます。立体の先端の形状、さらには隣接する立体を結ぶ小さい5ナノメートルリンク。
HPICMイメージングの非接触性を考えると、同じヘアセルバンドルの連続的なタイムラプスイメージングは、バンドルの凝集性を損なうことなく数時間行うことができる。設定点が非常に低い場合、システムは電流の小さな変動をセル表面に遭遇すると解釈し、画像内のホワイトドットノイズにつながる可能性があることに注意してください。同様に、ホップの振幅が大きいとピペットの横共鳴が増加し、また、騒々しいピクセルの生成をもたらす。
これに対し、ホップの振幅が小さすぎる場合、または設定点が高すぎる場合、ナノピペットがサンプルと衝突して、画像のアーティファクトやヘアバンドルの損傷を引き起こします。この手順を試みる際に覚えておくべきことは、生細胞を使用する際に、1つのヘアセルバンドルあたり15分未満を費やしていくことです。毛束の画像を取得した後、ステレオシリアの表面の特定の場所から単一のチャンネル録音を取得して、メカノトランスダクションチャネルの特性に関する質問に答えようとすることができます。
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