Biology
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टेलोमेरेस पर रासायनिक डामरीकरण-प्रेरित प्रोटीन संघनित
Chapters
Summary April 12th, 2021
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यह प्रोटोकॉल क्रोमेटिन पर संघनन बनाने के लिए रासायनिक रूप से प्रेरित प्रोटीन डिमराइजेशन सिस्टम दिखाता है। रासायनिक डिमेराइजर्स के साथ टेलोमेरेस पर प्रोमाइलोसाइटिक ल्यूकेमिया (पीएमएल) परमाणु निकाय के गठन का प्रदर्शन किया जाता है। ड्रॉपलेट ग्रोथ, विघटन, स्थानीयकरण और संरचना की निगरानी लाइव सेल इमेजिंग, इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) और सीटू संकरण (मछली) में फ्लोरेसेंस के साथ की जाती है।
Transcript
यह प्रोटोकॉल टेलोमेरेस पर प्रोटीन संघनित को प्रेरित करने के लिए रासायनिक डामरीकरण प्रणाली का वर्णन करता है। इसे अन्य जीनोमिक लोकी पर संघनितों को प्रेरित करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है, और क्रोमेटिन से जुड़े संघननों के गठन और कार्य की जांच के लिए उपयुक्त है। यह विधि लाइव सेल इमेजिंग के लिए आवश्यक लौकिक संकल्प प्रदान करती है और जैव रासायनिक परख के लिए कोशिकाओं की आबादी में चरण अलगाव को बनाए रखती है।
शुरू करने के लिए, 10 मिलीमोलर में डीएमएसओ में डाइमेजर को भंग करें और उन्हें दीर्घकालिक भंडारण के लिए शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर प्लास्टिक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में स्टोर करें। इमेजिंग माध्यम में 10 मिलीमोलर डिमराइजर का एक एलिकोट 10 माइक्रोमोलर की स्टॉक एकाग्रता के लिए पतला करें और इसे शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। उपयोग करने के लिए तैयार होने पर, विकास माध्यम या इमेजिंग माध्यम में 100 नैनोमोलर की अंतिम कार्य एकाग्रता के लिए डाइमेस्टराइजर्स को पतला करें।
बीज 10 से पांचवीं कोशिकाओं में 12 मिलीमीटर व्यास परिपत्र कवर चश्मे एक छह अच्छी तरह से थाली में पाली-डी-Lysine के साथ लेपित । फिर हेलो-जीएफपी-टीआरएफ1 और एमएचरी-ईडीएचएफआर-सिम या एमएचरी-ईडीएफआर-सिम उत्परिवर्ती प्लाज्मिड्स के साथ कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करें और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए आगे बढ़ने से पहले 24 से 48 घंटे तक प्रतीक्षा करें। कोशिकाओं में पतला 100 नैनोमोलर डाइमेजर जोड़ें और उन्हें चार से पांच घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस में इनक्यूबेट करें।
इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को पार करने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4% फॉर्मलडिहाइड और 0.1% ट्राइटन एक्स-100 युक्त पीबीएस समाधान में कोशिकाओं को ठीक करें। फिर कोशिकाओं को पीबीएस के साथ तीन बार धोएं। वॉश कवर टीबीएस-टीएक्स के 50 माइक्रोलीटर के साथ दो बार और एक बार एंटीबॉडी कमजोर पड़ने वाले बफर के 50 माइक्रोलीटर के साथ फिसल जाता है।
रात भर एक आर्द्रीकृत कक्ष में चार डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटी-पीएमएल, एंटी-सूमो-1, या एंटी-सूमो-2 और 3 एंटीबॉडी के ५० माइक्रोलीटर के साथ प्रत्येक कवर स्लिप को इनक्यूबेट करें । अनबाउंड प्राइमरी एंटीबॉडी को हटाने के लिए एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर के साथ तीन बार कवर स्लिप करें, फिर कमरे के तापमान पर एक अंधेरे बॉक्स में एक घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। धुंधला होने के बाद वॉश कवर टीबीएस-टीएक्स के साथ तीन बार फिसल जाता है।
एक माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर DAPI के दो माइक्रोलीटर जोड़कर लेबल स्लाइड, तो कवर पर फिसल जाता है फ्लिप और उन्हें DAPI ड्रॉप पर जगह है। कवर स्लिप के किनारे से अतिरिक्त तरल पदार्थ को एस्पिरेट करें। नेल पॉलिश के साथ स्लाइड सील, इसे सूखने के लिए अनुमति देते हैं, और पानी के साथ कवर पर्ची के शीर्ष कुल्ला ।
इमेजिंग तक फ्रीजर में स्लाइड्स रखें। बीज 10 से पांचवीं कोशिकाओं को 12 मिलीमीटर परिपत्र कवर चश्मे पर एक छह अच्छी तरह से थाली में पाली-डी-Lysine के साथ लेपित और उंहें हेलो-TRF1 और mCherry-eDHFR-सिम या mCherry-eDHFR-सिम उत्परिवर्ती plasmids के साथ ट्रांसफेक्ट । कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4% फॉर्मलडिहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें और उन्हें पीबीएस के साथ चार बार धोएं।
आईएफ-फिश के लिए, प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को दाग दें और उन्हें कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4% फॉर्मलडिहाइड के साथ फिर सेफिक्स करें, फिर उन्हें पीबीएस के साथ चार बार धोएं और एक इथेनॉल श्रृंखला में कवर स्लिप को निर्जलित करें। पांच मिनट के लिए ७५ डिग्री सेल्सियस पर संकरण समाधान के पांच माइक्रोलीटर में ४८८ टेलोमेरे सी-पीएनए जांच के साथ कवर स्लिप इनक्यूबेट, तो कमरे के तापमान पर एक आर्द्रीकृत कक्ष में रात भर कवर फिसल जाता है । कवर स्लिप को कमरे के तापमान पर दो मिनट प्रति वॉश प्रति वॉश के लिए वॉश बफर के साथ तीन बार धोएं और इमेजिंग के लिए बढ़ते मीडिया में एक माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर DAPI के साथ उन्हें माउंट करें ।
लाइव इमेजिंग के लिए, एक पर्यावरण कक्ष में एक गर्म चरण पर चुंबकीय कक्षों में कवर फिसल जाता है, फिनोल लाल बिना इमेजिंग माध्यम के एक मिलीलीटर में कोशिकाओं को बनाए रखने माउंट । पाठ पांडुलिपि में वर्णित माइक्रोस्कोप और पर्यावरण नियंत्रण तंत्र की स्थापना करें। साइटोसोल में टेलोमेरेस और डिफ्यूजिव रीचेरी सिग्नल पर एक उज्ज्वल जीएफपी सिग्नल वाली कोशिकाओं का पता लगाएं।
लगभग 20 कोशिकाओं का पता लगाएं, XYZ जानकारी के साथ प्रत्येक स्थिति को याद है, और समय चूक इमेजिंग के लिए मापदंडों की स्थापना की । जेड में कुल आठ माइक्रोमीटर के लिए 0.5 माइक्रोमीटर अंतर और जीएफपी और रीचेरी दोनों चैनलों के लिए दो से चार घंटे के लिए पांच मिनट के समय अंतराल का उपयोग करें। 200 मिलीसेकंड के एक्सपोजर समय और 300 के कैमरा लाभ के साथ 594 नैनोमीटर का 30%और 488 नैनोमीटर पावर तीव्रता का 50%का उपयोग करें।
इमेजिंग शुरू करें और प्री-डाइमराइजेशन के रूप में एक बार लूप लें। फिर इमेजिंग को रोकें, इमेजिंग कक्ष में 10 माइक्रोमोलर डाइमराइजर के 15 माइक्रोलीटर युक्त इमेजिंग मीडिया के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें, जिसमें मंच को छूने का ध्यान नहीं रखा जाता है, और इमेजिंग फिर से शुरू करें। जब डाइमराइजेशन को रिवर्स करने के लिए तैयार हो, तो इमेजिंग को रोकें और इमेजिंग मीडिया के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें जिसमें इमेजिंग चैंबर में 100 मिलीमोलर स्टॉक टीएमपी के दो माइक्रोलीटर शामिल हैं।
कोशिकाओं को एक से दो घंटे तक इमेजिंग जारी रखें। फिक्स्ड इमेजिंग के लिए, लाइव इमेजिंग के रूप में एक ही माइक्रोस्कोप सेटअप का उपयोग करें, लेकिन मंच हीटिंग के बिना। संक्रमित कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए लाल संकेत के साथ लगभग 30 से 50 कोशिकाओं का पता लगाएं।
Z.में कुल आठ माइक्रोमीटर के लिए 0.3 माइक्रोमीटर अंतर के साथ छवियों का अधिग्रहण करें 647 नैनोमीटर के 80%, 561 नैनोमीटर के 80%, और 488 नैनोमीटर पावर तीव्रता का 70%, 600 मिलीसेकंड के एक्सपोजर समय और 300 के कैमरे लाभ के साथ। सूमो के टेलोमेरिक स्थानीयकरण की पहचान टेलोमेरे डीएनए फिश और सूमो प्रोटीन इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके की गई थी। सिम भर्ती के साथ कोशिकाओं को समृद्ध SUMO-1 और SUMO-2 और 3 सिम उत्परिवर्ती भर्ती के साथ कोशिकाओं की तुलना में, यह दर्शाता है कि सिम dimerization telomeres पर SUMO संवर्धन प्रेरित SUMO-सिम बातचीत पर निर्भर करता है ।
डामरीकरण के बाद टीआरएफ-1 और सिम की टाइम लैप्स मूवी यहां दिखाई गई है। सिम को सफलतापूर्वक टेलोमेरेस में भर्ती किया गया था, और सिम और टीआरएफ-1 फोसी दोनों बड़े और उज्जवल हो गए, जैसा कि तरल बूंद गठन और विकास के लिए भविष्यवाणी की गई थी। इसके अलावा, टीआरएफ-1 फोसी का संलयन देखा गया, जिसके कारण टेलोमेरे क्लस्टरिंग हुई, जैसा कि कम टेलोमेरे संख्या में दिखाया गया है और समय के साथ टेलोमेरे तीव्रता में वृद्धि हुई है।
इसके विपरीत, सिम उत्परिवर्ती को डामरीकरण के बाद टेलोमेरेस में भर्ती किया गया था, लेकिन किसी भी बूंद गठन या टेलोमेरे क्लस्टरिंग को प्रेरित नहीं किया, यह दर्शाता है कि चरण जुदाई और टेलोमेरे क्लस्टरिंग सूमो-सिम इंटरैक्शन द्वारा संचालित है। अतिरिक्त मुक्त टीएमपी जोड़ने के बाद चरण पृथक्करण और टेलोमेरे क्लस्टरिंग के उलट देखा गया। टेलोमेरे संख्या में वृद्धि हुई और समय के साथ टेलोमेरे तीव्रता में कमी आई।
टेलोमेरे डीएनए फिश और पीएमएल प्रोटीन द्वारा पहचाने गए एपीबी की प्रतिनिधि छवियां यदि यहां दिखाई जाती हैं । सिम भर्ती के साथ कोशिकाओं सिम उत्परिवर्ती भर्ती के साथ कोशिकाओं की तुलना में अधिक APBs है, मंदीकरण प्रेरित संघननीय सुझाव वास्तव में APBs हैं । इस प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते समय, प्रकाश के प्रति प्रकाश संवेदनशील डाइमराइजर्स को बेनकाब न करें।
एक दीपक के साथ एक अंधेरे कमरे में काम करें जो लाल बत्ती का उत्सर्जन करता है और इनक्यूबेशन के दौरान एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कोशिकाओं को लपेटता है। इस प्रक्रिया के बाद, प्रेरित संघनन में घटकों की एक व्यापक सूची उत्पन्न करने के लिए निकटता लेबलिंग का उपयोग किया जा सकता है। संघनित में घटकों की गतिशीलता का पालन करने के लिए लाइव इमेजिंग का उपयोग किया जा सकता है।
ये विधियां संघनित संरचना नियंत्रण को नियंत्रित करने की भूमिकाओं को निर्धारित करने में मदद कर सकती हैं।
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