Name: ניתוח תגובות תאי T HBV ספציפיות ל- CD4 וזיהוי של Epitopes תאי T מוגבלים HLA-DR-CD4 המבוססים על מטריצת פפטיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: למדו הערכת תגובות תאי T CD4 ספציפיות ל-HBV וזיהוי אפיטופים באמצעות מטריצת פפטידים. שיטה זו מאפשרת אפיון תת-אוכלוסיות תאי T פונקציונליות בחולים עם דלקת כבד כרונית B.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81930061), הקרן למדעי הטבע צ'ונגצ'ינג (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) ומפתח סיני פרויקט מתמחה במחלות זיהומיות (2018ZX10723203).

הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל מטופל שנכלל במחקר. פרוטוקול המחקר תואם את ההנחיות האתיות של הצהרת הלסינקי משנת 1975, כפי שבאו לידי ביטוי באישור מוקדם של ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים סאות'ווסט.
1. עיצוב מטריצת הפפטיד שמקורה ב-HBV
<ol><li>הורד רצפי חומצות אמינו של אנטיגן הליבה HBV ממסדי נתונים NCBI (GenBank: AFY98989.1).</li>
	<li>רכישת פפטידים שמקורם באנטיגן ליבה HBV (פאנל של פפטידים 15-mer חופפים על ידי 10 שאריות, טוהר &gt; 90%, 4 מ"ג / פפטיד) מספק שירות סינתזת פפטיד.</li>
	<li>הגדר מטריצת פפטיד מרובעת של 6×6 עם כל מיקום במטריצה המכילה פפטיד אחד בלבד. ישנן 12 בריכות פפטיד: 6 בריכות פפטיד בשורה ו-6 בריכות פפטידים, 5-6 פפטידים בכל בריכה16. בריכות הפפטיד בשורה ובריכות הפפטיד בעמודה במטריצה מייצגות 2 תצורות נפרדות של אנטיגן ליבת HBV.</li>
	<li>עבור 3/4 של פפטידים שנרכשו, לערבב פפטידים באותה שורה / עמודה של המטריצה לתוך 12 בריכות פפטיד נפרדות על ידי המסת אותם יחד דימתיל סולפוקסיד (DMSO) (2 מיקרוגרם / μL עבור כל פפטיד). יש לאחסן ב- -80 °C לניתוח תגובות תאי T ספציפיים ל- CD4 HBV.</li>
	<li>ממיסים את שאר הפפטידים בנפרד (10 מיקרוגרם/מיקרו-לן) ומאחסנים ב-80 מעלות צלזיוס לזיהוי אפיטופ.</li>
</ol>2. בידוד של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs)
<ol><li>דגימה 5 מ"ל של דם ורידים מחולי זיהום HBV כרוניים. הערה: נפח הדם צריך להיות מוערך בערך על פי מספר בריכות פפטיד בתוספת 1 בקרת רקע ושליטה חיובית אחת. ניתוח של מאגר פפטיד אחד צריך 3 x 105 מחשבים אישיים. בממוצע, 1 x 106 PBMCs ניתן להשיג מ 1 מ"ל של דם.</li>
	<li>בודדו מחשבים אישיים מדם באמצעות צנטריפוגה הדרגתית הדרגתית בצפיפות פיקול (800 × גרם, 20 דקות) והקפאו מחשבי PBMCs מבודדים בחנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר.</li>
	<li>השתמש פיפטה פסטר כדי לאסוף גרנולוציטים בין שכבת פיקול ברורה לשכבת תא הדם האדום. לחלץ DNA גנומי מגרנולוציטים באמצעות ערכת טיהור DNA גנומית על פי פרוטוקול היצרן.</li>
	<li>שלח את דגימת הדנ"א לספקי שירותי genotyping כדי לקבוע את הגנוטיפ HLA-DRB1.</li>
</ol>3. הרחבה במבחנה של מחשבים אישיים באמצעות מטריצת פפטיד HBV
<ol><li>הפשר מחשבים אישיים.<ol>
<li>RPMI חם 1640 בתוספת 1:10,000 בנזונאז (25 U/mL) עד 37 °C (50 °F) באמבט מים. הערה: בנזונאז עוזר להגביל את גושי התאים במהלך ההפשרה. כל מדגם ידרוש 20 מ"ל של RPMI 1640 עם בנזונאז. חשב את הסכום הדרוש להפשרת כל הדגימות, והכן aliquot נפרד של מדיה (37 °C) עם 1:10,000 בנזונאז (25 U / mL). להפשיר לא יותר מ-5 דגימות בכל פעם.</li>
		<li>הסר דגימות חנקן נוזלי ולהפשיר במהירות בקבוקונים קפואים באמבט מים (37 °C (37 °F).</li>
		<li>העבר את השעיית התא המופשרת לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של בנזונאז RPMI 1640 (37 °C) טיפה לצינור. לאט להוסיף 6 מ"ל של RPMI RPMI 1640 בנזונאז (37 °C) לצינור הצנטריפוגה, לשטוף cryovial עם עוד 2 מ"ל של RPMI 1640 בנזונאז (37 °C) כדי לאחזר את כל התאים. המשך עם שאר הדגימות מהר ככל האפשר. הערה: דילול איטי של דגימות cryopreserved הוא המפתח כדי לשמור על הכדאיות של תאים מופשרים.</li>
		<li>צנטריפוגה (400 × גרם, 10 דקות), להסיר את supernatant, ולשחרר את הכדור על ידי הקשה על הצינור.</li>
		<li>בעדינות resuspend הכדור ב 1 מ"ל של RPMI RPMI 1640 בנזונאז חם. מערבבים בעדינות ומסננים תאים באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרומטר במידת הצורך (כלומר, אם קיים גוש גלוי).</li>
		<li>Aliquot השעיה 10 μL לדלל מלוחים פוספט של Dulbecco חוצץ (DPBS), להוסיף כחול טריפן (0.04%), לטעון על hemocytometer, לחכות 1 דקה, ולספור את מספר התאים קיימא (תאים ברורים).</li>
		<li>הוסף 9 מ"ל של RPMI RPMI 1640 בנזונאז (37 °C) לצינור, צנטריפוגה (400 × גרם, 10 דקות), להסיר את supernatant, ולשחרר את הכדור על ידי הקשה על הצינור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBMCs resuspend ב RPMI 1640 בתוספת 25 mM HEPES, 2 mM L-גלוטמין, 1 mM נתרן pyruvate, 100 פניצילין U / mL, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו 10% סרום AB אנושי (מדיום תרבות מלאה). התאם את צפיפות התאים ל- 1.5 x 106 תאים/מ"ל. צלחת PBMCs בלוחות 96-באר (תחתון שטוח) בצפיפות של 3 x 105 תאים / טוב.</li>
	<li>הוסף בריכות פפטיד נגזר HBV (2 מיקרוגרם / מ"ל עבור כל פפטיד יחיד) לכל באר. עבור בארות של בקרת רקע ושליטה חיובית, הוסף את אותה כמות ממס (DMSO, 1 μL / mL). הוסף 10 U /mL IL-2 ו 10 ננוגרם / מ"ל IL-7. דגירה ב 37 °C (5°F) ו 5% CO2.</li>
	<li>ביום 3, תוספת תרבות בינוני עם 50 U/mL של IL-2 ו 10 ננוגרם / מ"ל של IL-7. הערה: במהלך היום הראשון עד יום 3, לא תצפה התפשטות ברורה של תאי T. מספר התא הכולל יקטן בדרך כלל ב- 1/3 עד 1/2, עקב מותם של תאים שאינם T כגון תאי B, תאי NK, תאי NKT ומונוציטים.</li>
	<li>ביום 7, החליפו חצי מהמדיום התרבותי במדיום טרי המכיל פפטידים (4 מיקרוגרם/מ"ל), IL-2 (100 U/mL) ו-IL-7 (20 ננוגרם/מ"ל). הערה: כדי למנוע הפרעה לתאים בתחתית, pipette על 90 μL של תרבות בינוני בזהירות מהחלק העליון של המדיום. במהלך היום 3 עד יום 7, התפשטות תאי T חזקה תיצפה, ותאי T מתרבים בדרך כלל מצטברים כדי ליצור אשכולות.</li>
	<li>ביום 10, בעדינות pipette תרבית תאים בכל באר 7-9 פעמים כדי disaggregate אשכולות תאים, לספור את מספר התאים קיימא, ולהעביר2×10 5 תאים בכל באר ללוח 96 באר (תחתית עגולה) עבור ניתוח תגובת תאי T-T ספציפי HBV.</li>
	<li>המשך פולחן שאר התאים לזיהוי אפיטופ ביום 12, להתאים את נפח של מדיום תרבית עד 100 μL (השלכת מדיום מוגזם), ותוספת תרבות עם 100 μL של מדיום תרבות מלאה טרי המכיל פפטידים (4 מיקרוגרם / מ"ל), IL-2 (100 U / mL), ו IL-7 (20 ננוגרם / מ"ל). הערה: במהלך היום 7 עד יום 10, תאי T ממשיכים להתרבות במרץ. החלף את מדיום התרבות כמו בשלב 3.5 אם המדיום הופך צהוב. באופן כללי, מספר התא יעלה על 6×105 ביום 10. כל באר מציגה בדרך כלל מספר תא דומה, סופרת מספר תא ב- 3 בארות ומשתמשת בערך הממוצע כהערכה של מספר התא עבור כל הבארות.</li>
</ol>4. ניתוח תגובות תאי T-T ספציפיים ל- CD4 HBV על ידי ציטומטריית זרימה תאית
<ol><li>מחשבים אישיים מגרה עם בריכות פפטיד<ol>
<li>עבור התאים שהועברו ללוח 96 באר (תחתית עגולה), לשטוף 3 פעמים בצלחת (550 × גרם, 3 דקות). השתמש 200 μL של בינוני עבור כל לשטוף (RPMI 1640 עבור 2 שטיפות הראשונות, תרבות מלאה בינונית עבור הכביסה האחרונה). זרוק את אנטנטי העל. הערה: הסרת ציטוקינים שיורית בתרבות על ידי כביסה חוזרת עלולה להפחית ביעילות את הרקע בניתוח ציטומטריית זרימה תאית.</li>
		<li>עבור כל באר של תאים מגורה עם בריכת פפטיד ספציפית, להוסיף 200 μL של מדיום תרבות מלאה בתוספת אותן בריכות פפטיד (2 מיקרוגרם / מ"ל עבור כל פפטיד יחיד). לקבלת הבאר של בקרת רקע, להוסיף מדיום תרבות מלאה בתוספת 1 μL / mL של DMSO. עבור הבאר של שליטה חיובית, להוסיף מדיום תרבות מלאה בתוספת 1 μL / mL של DMSO, 150 ng / mL של פורבול 12-myristate 13-אצטט (PMA), ו 1 מיקרומול / L של ionomycin. הערה: מינון גבוה של DMSO יחסום את הפרשת ציטוקינים של תאי T (המשמעותי ביותר עבור TNF-α). מינון של DMSO גבוה מ 5 μL / mL אינו מומלץ. בדרך כלל, המינון של DMSO בניסוי שלנו אינו עולה על 1 μL / mL.</li>
		<li>דגירה ב 37 °C (5° C) ו 5% CO2 עבור 6 שעות.</li>
		<li>לאחר שעה אחת של דגירה, להוסיף Monensin (1.37 מיקרוגרם / מ"ל) לתרבות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ציטומטריית זרימה<ol>
<li>אחרי 6 שעות של דגירה. הסר supernatant לאחר צנטריפוגה (550 ×, 3 דקות), לשטוף תאים פעם אחת עם 200 μL של DPBS (550 × גרם, 3 דקות), סמני משטח כתם (CD3, CD4, ו- CD8) וסמן קיימא (באמצעות צבע קיימא תיקון) במקרר 4 °C למשך 30 דקות.</li>
		<li>לשטוף פעם אחת עם 200 μL של DPBS (550 × גרם, 3 דקות). לתאים מקובעים ומחלחלים, ולהכתים ציטוקינים תאיים (TNF-α ו-IFN-γ) במקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.</li>
		<li>לאחר השטיפה הסופית בהכתמה תאית, תאים resuspend ב 150 μL של חוצץ cytometry זרימה (DPBS + 0.5% BSA).</li>
		<li>השג נתוני ציטומטריית זרימה על ציטומטר זרימה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניתוח תוצאות ציטומטריית הזרימה<ol>
<li>הגדרה של טוב חיובי: שקול גם כמו חיובי אם יש לו תדירות של ציטוקינים הפרשת תאי T לפחות פעמיים של בקרת הרקע היטב (איור 1).</li>
		<li>על פי הנוסחה הבאה, חשב את שיעור התגובה עבור כל ציטוקין שנותח (איור 2): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62387/62387eq01.jpg"> הערה: מאגר הפפטיד בשורה ובריכות הפפטיד בעמודה במטריצה מייצגות 2 תצורות נפרדות של אנטיגן ליבה HBV, כך שקצב התגובה הסופי צריך להיות מחולק ב- 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. זיהוי אפיטופים מוגבלים של תאי T HLA-DR HLA-DR
<ol><li>להפשיר ולשמור על קווי תאים לימפובלסטואידים B אלוגניים (BLCLs) בבקבוקון T-75 (5-20 ×106 תאים, 20 מ"ל של מדיום תרבית מלאה). הערה: כדי להבטיח את המצב הטוב של BLCLs, שלב זה צריך להיות יזם 2 שבועות לפני הפשרת PBMCs של חולים. BLCLs חייב להיות הומוזיגוס ב אליל HLA-DRB1. על פי התוצאה genotyping, חולים צריכים לחלוק את אותו אלל HLA-DRB1 כמו BLCLs.</li>
	<li>הקרנת פפטידים מועמדים לזיהוי (איור 3)<ol>
<li>על פי תוצאות שיעור התגובה לתאי T ביום 10, לסנן 2 בריכות פפטיד עם שיעור התגובה הגבוה ביותר (בריכת פפטיד שורה 1 ובריכת פפטיד 1 עמודה).</li>
		<li>הגדר את הפפטיד ב 2 בריכות אלה כמו פפטיד מועמד אם מאגר פפטיד האחר המכיל פפטיד זה גם מראה תוצאה חיובית בניתוח תגובת תא T. השתמש PBMCs מורחב עם מאגר פפטיד אחרים לזיהוי epitope מאוחר יותר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>BLCLs פועם עם פפטיד<ol>
<li>ביום 12, לספור את מספר BLCLs קיימא, להעביר תאים צינורות צנטריפוגות 15 מ"ל, צנטריפוגה (350 × גרם, 10 דקות) ולהסיר את supernatant. resuspend את גלולה התא במדיום תרבות מלאה, ו aliquot BLCLs לצלחת 96-well (תחתית עגולה) ב 4×104 תאים / גם במדיום תרבות מלאה 80 μL.</li>
		<li>הוסף פפטיד יחיד (10 מיקרוגרם / מ"ל), דגירה ב 37 °C (5% CO2 עבור 2 שעות. הגדר 2 בקרת רקע: פפטיד פועם עם חסימת HLA-DR (טיפול מקדים עם אנטי HLA-DR (10 מיקרוגרם / מ"ל) עבור 1 שעה); DMSO (1 μL/mL) פועם. הנפח הסופי של מדיום תרבות שלמה בכל באר הוא 100 μL.</li>
		<li>הוסף mitomycin C (100 מיקרוגרם / מ"ל), דגירה ב 37 °C ו 5% CO2 עבור 1 שעה.</li>
		<li>לשטוף 3 פעמים עם 200 μL של RPMI 1640 (550 × גרם, 3 דקות) בצלחת כדי להסיר פפטיד לא פעמו mitomycin C. עבור לשטוף הראשון, להשלים את תרבות הדגירה עם 100 μL של RPMI 1640.</li>
		<li>תאים resuspend ב 120 μL של מדיום תרבות מלאה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBMCs מגרה עם BLCLs פעום פפטיד.<ol>
<li>ביום 12, להעביר PBMCs לצלחת 96 באר (תחתית עגולה).</li>
		<li>הסר את supernatant לאחר צנטריפוגה (550 × גרם, 3 דקות) בצלחת, לשטוף פעמיים עם 200 μL של RPMI 1640 (550 × גרם, 3 דקות) בצלחת. הערה: הסרת שאריות ציטוקינים ופפטידים בתרבות על ידי כביסה חוזרת היא הצעד העיקרי להקטנת הרקע בניתוח ציטומטריית זרימה תאית. במיוחד עבור פפטידים שיורית, זה יהיה להיקשר BLCLs ולהגדיל באופן משמעותי את הרקע.</li>
		<li>מחשבי PBMd resuspend בכל באר עם 210 μL של מדיום תרבות מלאה.</li>
		<li>עבור הבאר של PBMCs שנבחרו לזיהוי epitope, לערבב את aliquot (70 μL כל אחד) עם BLCLs פעימה פפטיד (3 בארות, כולל 2 פקדי רקע). הערה: ביום 12, מספר בריכות הפפטידים המורחבות PBMCs יגיע בדרך כלל מעל 5-7×105 לבאר, כך היחס של PBMCs / BLCLs הוא על 6/1 עד 4/1.</li>
		<li>דגירה ב 37 °C (5° C) ו 5% CO2 עבור 6 שעות.</li>
		<li>לאחר שעה אחת של דגירה, להוסיף Monensin (1.37 מיקרוגרם / מ"ל) לתרבות. הנפח הסופי של מדיום תרבות שלמה בכל באר הוא 200 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ציטומטריית זרימה<ol>
<li>חזור על אותן פעולות כמו בשלב 4.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניתוח תוצאות ציטומטריית הזרימה<ol>
<li>אמת פפטיד כאפיטופה מוגבלת של תאי T CD4 מוגבלים של HLA-DR אם מחשבי PBMCs דוגרים עם BLCLs פפטידי זה פעמו להראות תדירות של ציטוקינים מפרישים תאי CD4 T לפחות פעמיים של PBMCs דגירה עם פקדי רקע (פפטיד פועם עם HLA-DR מראש חסימה; DMSO פועם) (איור 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+of+T-cell+epitopes+in+hepatitis+B+virus%3A+identification%2C+genotypic+variation+and+relevance+to+antiviral+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Therapy%22%5BJournal%5D)">A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics.</a> Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).</li>
<li>Mizukoshi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+immune+responses+to+the+hepatitis+B+virus+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase.</a> Journal of Immunology. 173, Baltimore, Md. 5863-5871 (2004).</li>
<li>Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+CD137+to+study+the+full+repertoire+of+CD8%2B+T+cells+without+the+need+to+know+epitope+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities.</a> Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).</li>
<li>Reiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+activation+induced+marker+%28AIM%29+assays+for+sensitive+identification+of+antigen-specific+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells.</a> PLoS One. 12, 0186998(2017).</li>
<li>Herati, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successive+annual+influenza+vaccination+induces+a+recurrent+oligoclonotypic+memory+response+in+circulating+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells.</a> Science Immunology. 2, (2017).</li>
<li>Bowyer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation-induced+Markers+Detect+Vaccine-Specific+CD4%2B+T+Cell+Responses+Not+Measured+by+Assays+Conventionally+Used+in+Clinical+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials.</a> Vaccines. 6, (2018).</li>
<li>Morou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+differentiation+is+central+to+HIV-specific+CD4%28%2B%29+T+cell+dysfunction+in+progressive+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease.</a> Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).</li>
<li>Grifoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targets+of+T+Cell+Responses+to+SARS-CoV-2+Coronavirus+in+Humans+with+COVID-19+Disease+and+Unexposed+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals.</a> Cell. 181, 1489-1501 (2020).</li>
<li>Meckiff, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imbalance+of+Regulatory+and+Cytotoxic+SARS-CoV-2-Reactive+CD4%2B+T+Cells+in+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19.</a> Cell. , (2020).</li>
<li>Boni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+hepatitis+B+virus+%28HBV%29-specific+T-cell+dysfunction+in+chronic+HBV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection.</a> Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).</li>
<li>Chang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+hepatitis+B+virus+%28HBV%29-specific+CD4%2B+T-cell+responses+in+human+immunodeficiency+virus+type+1-HBV-coinfected+individuals+receiving+HBV-active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy.</a> Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).</li>
<li>Boni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restored+Function+of+HBV-Specific+T+Cells+After+Long-term+Effective+Therapy+With+Nucleos%28t%29ide+Analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues.</a> Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).</li>
<li>Kennedy, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+T-cell+function+in+children+and+young+adults+with+immune-tolerant+chronic+hepatitis+B%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B.</a> Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).</li>
<li>de Niet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+T+cell+function+in+chronic+hepatitis+B+patients+upon+treatment+with+interferon+based+combination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy.</a> Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).</li>
<li>Rinker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus-specific+T+cell+responses+after+stopping+nucleos%28t%29ide+analogue+therapy+in+HBeAg-negative+chronic+hepatitis+B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B.</a> Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-%CE%B1%2FIFN-%CE%B3+profile+of+HBV-specific+CD4+T+cells+is+associated+with+liver+damage+and+viral+clearance+in+chronic+HBV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection.</a> Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).</li>
<li>Hoffmeister, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+T+cell+epitopes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping T cell epitopes by flow cytometry.</a> Methods. 29, 270-281 (2003).</li>
<li>Anthony, D. D., Lehmann, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+epitope+mapping+using+the+ELISPOT+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach.</a> Methods. 29, 260-269 (2003).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה מפורטים באופן הבא: 1) מספיק מחשבי PBMCs בעלי כדאיות גבוהה כדי להתחיל הרחבת מחשבים אישיים; 2) סביבה מתאימה להרחבת מחשבים אישיים; ו -3) הסרה מלאה של שאריות בריכות פפטיד בתרבות PBMCs לפני זיהוי אפיטופ.
כל הניתוח בפרוטוקול זה תלוי בשגשוג החזק של תאי CD4 T. באופן כללי, מספר מחשבי PBMCs לאחר הרחבה של 10 ימים יהיה פי 2-3 מהמספר ההתחלתי. מספר התא והיכולת של מחשבים אישיים הם 2 גורמי מפתח בהרחבת מחשבים אישיים. אם המטרה היא רק לנתח תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV ללא זיהוי אפ...

נכון לעכשיו, ישנן 3 גישות עיקריות לנתח תאי T ספציפיים אנטיגן. הגישה הראשונה מבוססת על האינטראקציה בין קולטן תא ה- T לפפטיד (אפיטופ). תאי T ספציפיים לאנטיגן יכולים להיות מוכתמים ישירות עם ריבוי קומפלקס היסטו-תאימות (MHC) גדול פפטיד. היתרון של שיטה זו הוא שהיא יכולה להשיג תאי T ספציפיים אנטיגן קיימא, מתאים לניתוח תמלול במורד הזרם / מטבולומיה. מגבלה של שיטה זו היא כי זה לא יכול לספק מידע על התגובה כולה של תא T אנטיגן מסוים, כפי שהוא דורש פפטידים epitope מאומת בעוד מספר אפיטופים מזוהים עבור אנטיגן מסוים מוגבל לעת עתה. בהשוואה לנגיף הפטיטיס B (HBV)-ספציפי CD8 T-cell epitopes, פחות אפיטופים ספציפיים HBV CD4 T-cell זוהו1,2, מה שהפך שיטה זו פחות ישימה לניתוח של תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV כיום.
הגישה השנייה מבוססת על upregulation של סדרה של סמנים המושרה הפעלה לאחר גירוי פפטיד אנטיגן3. הסמנים הנפוצים כוללים CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. שיטה זו שימשה כעת לניתוח תגובות תאי T ספציפיים אנטיגן אצל אנשים מחוסנים5,6, זיהום וירוס חיסוני אנושיחולים 7, ותסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2 חולי זיהום8,9. שלא כמו הבדיקה המבוססת על ריבוי פפטיד-MHC, שיטה זו אינה מוגבלת על ידי אפיטופים מאומתים ויכולה להשיג תאים ברי קיימא לניתוח במורד הזרם. מגבלה של שיטה זו היא כי זה לא יכול לספק מידע על פרופיל ציטוקינים של תאי T ספציפי אנטיגן. כמו כן, הביטוי של סמנים אלה המושרה הפעלה על ידי כמה תאים אנטיגן-ספציפיים מופעלים עשוי לתרום אותות הרקע בניתוח, אשר יכול להיות בעיה במיוחד כאשר תאי T אנטיגן ספציפיים היעד הם נדירים. נכון לעכשיו, קיים יישום מוגבל של שיטה זו בתאי CD4 T ספציפיים ל- HBV4. השאלה אם ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לנתח תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV באופן אמין זקוקה לחקירה נוספת.
הגישה השלישית מבוססת על הפרשת הציטוקינים לאחר גירוי פפטיד אנטיגן. בדומה לניתוח מבוסס סמן המושרה על-ידי הפעלה, שיטה זו אינה מוגבלת על-ידי אפיטופים מאומתים. שיטה זו יכולה לחשוף ישירות את פרופיל הציטוקינים של תאי T ספציפיים לאנטיגן. הרגישות של שיטה זו נמוכה יותר מאשר השיטה מבוססת סמן המושרה הפעלה כפי שהוא מסתמך על הפרשת ציטוקינים של תאי T ספציפיים אנטיגן ומספר ציטוקינים נבדק מוגבל בדרך כלל. נכון לעכשיו, שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב בניתוח של תאי T ספציפיים ל- HBV. כמו ציטוקינים הפרשת תאי T ספציפיים HBV בקושי ניתן לזהות על ידי גירוי פפטיד ex vivo ישיר10,11, פרופיל ציטוקינים של תאי T ספציפיים HBV מנותח בדרך כלל לאחר 10 ימים במבחנה פפטיד מגורההרחבה 12,13,14,15,16. סידור של בריכות פפטיד בצורת מטריצה נוצל כדי להקל על זיהוי של אפיטופים ספציפיים אנטיגן17,18. עם השילוב של מטריצת פפטיד וניתוח הפרשת ציטוקינים, פותחה שיטה להערכת תגובות תאי T ספציפיים ל- CD4 HBV ולזיהוי אפיטופים ספציפיים ל- CD4 T-cell בו זמנית16. בפרוטוקול זה, הפרטים של שיטה זו מתוארים. אנטיגן הליבה HBV נבחר כדוגמה של הדגמה בפרוטוקול זה.

<table><tbody><tr><td>אלבומין בקר V (BSA)</td><td>Beyotime</td><td>ST023</td><td></td></tr><tr><td>מצומד APC אנטי אנושי TNF-& אלפא;</td><td>eBioscience</td><td>17-7349-82</td><td>שמור מוגן מפני אור</td></tr><tr><td>בנזונאז נוקלאז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E1014</td><td>הגבל</td></tr><tr><td>קווי תאים לימפובלסטואידים B גושים (BLCs)</td><td>מרכז פרד האצ'ינסון לחקר הסרטן</td><td></td> IHW09126 <td>HLA-DRB1*0803</td></tr><tr><td>קווי תאים לימפובלסטואידים מסוג B הומוזיגוט B (BLCLs)</td><td>המרכז לחקר הסרטן פרד האצ'ינסון</td><td></td> IHW09121 <td>HLA-DRB1*1202 הומוזיגוט</td></tr><tr><td>בקבוק תרבית תאים (T75)</td><td></td>צלחת תרבית תאים 430641 <td></td><td>קורנינג</td></tr><tr><td>(96 בארות, תחתית שטוחה)</td><td>קורנינג</td><td>3599</td> צלחת תרבית תאים <td>תחתונה שטוחה</td></tr><tr><td>(96 בארות, תחתית עגולה)</td><td>קורנינג</td><td>3799</td> מסננת תאים <td>תחתונה עגולה</td></tr><tr><td></td><td>קורנינג</td><td>CLS431751</td><td>גודל נקבוביות 70&nbsp; &mu; m, לבן,</td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה סטרילי (15 מ"ל)</td><td>KIRGEN</td><td>KG2611</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה סטרילי (50 מ"ל)</td>צנטריפוגה <td>סטרילית 430829 קורנינג</td><td></td><td></td></tr>, צנטריפוגה מקוררת <tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr>, צנטריפוגה <tr><td>Thermo</td><td>ST16R</td><td></td><td>מקוררת</td></tr><tr><td>, קירור</td><td>Thermo</td><td>Legend Micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ציטופיקס/ציטופרם (סט מאגר גורמי שעתוק)</td><td>BD Biosciences</td><td>562574</td><td>הכן תמיסה לפני השימוש</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>שמור בטמפרטורת החדר כדי למנוע התגבשות</td></tr><tr><td>Dulbecco' s תמיסת</td><td></td><td></td> מלח חוצצת פוספט <td>מכינים ddH2O (1000 מ"ל) המכילים NaCl (8000 מ"ג), KCl (200 מ"ג), KH2PO4 (200 מ"ג) ו-Na2HPO4.7H2O (2160&nbsp; מ"ג). התאם את ה-PH ל-7.4. לעקר באמצעות חיטוי.</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לסינון (0.5-10)</td><td>Kirgen</td><td>KG5131</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לסנן סטרילי (100-1000)</td><td>Kirgen</td><td>KG5333</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לסנן סטרילי (1-200)</td><td>Kirgen</td><td>KG5233</td><td></td></tr><tr><td>סטרילי מצומד FITC אנטי אנושי CD4</td><td>BioLegend</td><td>300506</td><td>שמור מוגן מפני אור</td></tr><tr><td>צבע כדאיות ניתן לתיקון eFluor780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14</td><td>שמור מוגן מפני</td></tr><tr><td>אור מעכב הובלת חלבון GolgiStop (המכיל מוננסין)</td><td>BD Biosciences</td><td>554724</td><td>מעכב הובלת חלבון</td></tr><tr><td>המוציטומטר</td><td>מותג</td><td>718620</td><td></td></tr><tr><td>HBV ליבת אנטיגן</td><td>פפטידים סיןפפטידים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>סרום אנושי AB</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-51</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>יונומיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>סנגון ביוטק</td><td>A100395-0500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>סנגון ביוטק</td><td>A100781-0500</td><td></td></tr><tr><td>LSRציטומטר</td><td></td><td></td><td></td>זרימה BD</tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>שפופרת</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה 100 מ"ל (1.5 מ"ל)</td><td>קורנינג</td><td>MCT-150-C</td><td>עיקור חיטוי לפני השימוש</td></tr><tr><td>ב-Microplate</td><td>Shakers Scientific</td><td>Industries MicroPlate Genie</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100348-0500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>צינורות A100241-0500</td><td></td></tr><tr><td>PCR (0.2 מ"ל)</td><td>Kirgen</td><td>KG2331</td><td></td></tr><tr><td>מצומד PE/Cy7 אנטי אנושי CD8</td><td>BioLegend</td><td>300914</td><td>שמור מוגן מפני אור</td></tr><tr><td>מצומד PE IFN-&גמא אנטי אנושי;</td><td>eBioscience</td><td>12-7319-42</td><td>שמור מוגן מפני אור</td></tr><tr><td>פניצילין סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>מצומד PerCP-Cy5.5 אנטי אנושי CD3</td><td>eBioscience</td><td>45-0037-42</td><td>שמור מוגן מפני אור</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IL-7</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>RPMI בינוני 1640</td><td>Gibco</td><td>C11875500BT</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>נתרן פירובט, 100 מ"מ</td><td>Gibco</td><td>15360070</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כתם כחול (0.4%)</td> <td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF מטוהר אנטי אנושי HLA-DR</td><td>BioLegend</td><td>307648</td><td></td></tr><tr><td>Wizard DNA גנומי ערכת טיהור</td><td>Promega</td><td>A1125</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח תגובות תאי t hbv ספציפיות ל- cd4 וזיהוי של epitopes תאי t מוגבלים hla-dr-cd4 המבוססים על מטריצת פפטיד

Analysis of HBV-Specific CD4 T-cell Responses and Identification of HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitopes Based on a Peptide Matrix

תאי CD4 T ממלאים תפקידים חשובים בפתוגנזה של הפטיטיס B כרונית. כאוכלוסיית תאים רב-תכליתית, תאי CD4 T סווגו כתת-קבוצות תפקודיות מובחנות בהתבסס על הציטוקינים שהם מפרישים: לדוגמה, IFN-γ עבור תאי עוזר CD4 T 1, IL-4 ו- IL-13 עבור תאי עוזר CD4 T 2, IL-21 עבור תאי עוזר זקיקי CD4 T, ו- IL-17 עבור תאי עוזר CD4 T 17. ניתוח של נגיף הפטיטיס B (HBV)-ספציפי CD4 T תאים המבוססים על הפרשת ציטוקינים לאחר גירוי פפטידים נגזר HBV יכול לספק מידע לא רק על הגודל של HBV ספציפי CD4 T-cell תגובה, אלא גם על תת קבוצות פונקציונליות של תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV. גישות חדשניות, כגון ניתוח תמלול ומטבולומיה, יכולות לספק מידע פונקציונלי מפורט יותר על תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV. גישות אלה דורשות בדרך כלל בידוד של תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV המבוססים על ריבוי ריבוי היסטופלים של היסטו-II, בעוד שכרגע המידע על אפיטופים ספציפיים ל- CD4 T-cell מוגבל. בהתבסס על מטריצת פפטיד שמקורה ב- HBV, פותחה שיטה להערכת תגובות תאי T CD4 ספציפיות ל- HBV ולזיהוי אפיטופים ספציפיים ל- CD4 T-cell בו זמנית באמצעות דגימות תאים חד-גרעיניים בדם היקפיים מחולי זיהום HBV כרוניים.

התדירות של תאי CD4 T מפרישים ציטוקינים מחושבת כסכום של מפיקים בודדים ומפיקים כפולים. כפי שהודגם באיור 1, התדירות של תאי CD4 T4 T מפרישים α ותדירות תאי ה-CD4 T מפרישים Γ IFN בבקרת רקע (DMSO) הם 0.154% ו-0.013% בהתאמה. התדירות של תאי CD4 T4 מפרישים α TNF והתדירות של IFN-γ מפריש תאי CD4 T ספציפיים למאגר פפטיד Core11 הם 0.206 ו- 0.017 בהתאמה, כך שגם TNF-α הפרשת תגובת תאי T של CD4 וגם תגובת תאי T של Γ IFN-γ להפרישת CD4 T-cell עבור מאגר פפטיד זה נחשבים שליליים. התדירות של תאי CD4 T4 T4 מפרישים α ו...

בהתבסס על מטריצת פפטיד שמקורה בוירוס הפטיטיס B (HBV), ניתן להעריך תגובות תאי T ספציפיים ל- CD4 HBV במקביל לזיהוי אפיטופים ספציפיים ל- CD4 T.

ניתוח תגובות תאי T HBV ספציפיות ל- CD4 וזיהוי של Epitopes תאי T מוגבלים HLA-DR-CD4 המבוססים על מטריצת פפטיד

CD4 T cells play important roles in the pathogenesis of chronic hepatitis B. As a versatile cell population, CD4 T cells have been classified as distinct ...

בזיהום כרוני HBV, תאי CD4 T ממלאים תפקידים חשובים הן בסיווג הנגיפי והן בשוחזרים. שיטה זו מאפשרת לנו להעריך תגובות ספציפיות לתאי CD4 T של HBV ולזהות אפיטופים ספציפיים לתאי CD4 T, בו זמנית. מדגים את ההליך יהיה Jianmei שיאו, עוזר מחקר.ושינג וואן, טכנאי מבילאו. כדי להתחיל, לבודד תאים מונונוקלאריים דם היקפי, או PBMCs, מדם, באמצעות צנטריפוגה הדרגתית צפיפות פיקול ב 800 פעמים G במשך 20 דקות. לאחר מכן, לאסוף את granulocytes בין שכבת תא הדם האדום, באמצעות פיפטה פסטר.העבר את ההשעיה התא המפושר לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר, להוסיף מיליליטר אחד של RPMI RPMI 1640 בנזונאז התחמם מראש, טיפה חכם, ולאחר מכן לאט להוסיף עוד שישה מיליליטר. לשטוף את בוויאל cryo עם שני מיליליטר של RPMI 1640 בנזונאז כדי לאחזר את התאים הנותרים. ואז צנטריפוגה הצינור ב 400 פעמים G במשך 10 דקות.הסר את supernatant ולשחרר את הכדור על ידי הקשה על הצינור. בעדינות להשעות מחדש את הכדור במיליליטר אחד של בנסנאז חם NACE RPMI 1640. מערבבים את התאים בעדינות, ומסננים אותם באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרומטר, אם כל גושי תאים גלויים.ספירת תאים ברי קיימא באמצעות כחול טריפן והמוציטומטר. השהו מחדש את מחשבי ה-PBMCs ואת המדיום התרבותי המלא, המכיל 10 יחידות למיליליטר IL2, ו-10 ננוגרם למיליליטר IL7. התאם את צפיפות התאים ל- 1.5x10 ל- 6 תאים למיליליטר.לאחר מכן צלחת התאים בלוחות התחתונים שטוחים 96-ובכן בצפיפות של 3x10 עד התא החמישי לכל באר. הוסף וירוס הפטיטיס B או בריכות פפטיד נגזר HBV לכל באר. עבור הרקע והשליטה החיובית ולס, הוסף את אותה כמות ממס.לדגור על הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. ביום השלישי, להשלים את המדיום התרבותי עם 50 יחידות למיליליטר של IL2, ו 10 ננוגרם למיליליטר של IL7. ביום השביעי, החליפו מחצית מהמדיום התרבותי במדיום טרי המכיל:ארבעה מיקרוגרם למיליליטר פפטידים, 100 יחידות למיליליטר IL2 ו-20 ננוגרם למיליליטר IL7.ביום העשירי, פינט בעדינות את התאים בכל באר שבע עד תשע פעמים כדי לפזר צבירי תאים מצטברים. ספר את מספר התאים בני קיימא והעבר 2x10 לתאים החמישיים לכל באר של צלחת תחתונה עגולה של 96-Well לניתוח תגובת תאי CD4 T ספציפיים של HPV. עבור התאים השיוריים בצלחת התחתונה השטוחה 96-Well, התאם את עוצמת המדיום של התרבות בינונית ל -100 מיקרוליטרים על ידי השלכת מדיום מוגזם.לאחר מכן, להשלים את התרבות עם 100 microliters של טרי, תרבות מלאה בינוני, המכיל:ארבעה מיקרוגרם למיליליטר פפטידים, 100 יחידות למיליליטר IL2, ans 20 ננוגרם למיליליטר IL7. המשך פולחן התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני לזיהוי אפיטופ ביום 12. לשטוף את התאים בצלחת התחתונה העגולה 96-Well על ידי הוספת 200 microliters של RPMI 1640, centrifuging את הצלחת ב 550 פעמים G במשך שלוש דקות, והשלכת supernatant.יש לחזור על הכביסה פעמיים באמצעות מדיום תרבות מלא לכביסה האחרונה. עבור כל באר של תאים מגורה עם בריכת פפטיד ספציפית, להוסיף 200 microliters של מדיום תרבות מלאה בתוספת אותה בריכת פפטיד. עבור באר בקרת הרקע, הוסף מדיום תרבות מלא, בתוספת מיקרוליטר אחד למיליליטר של DMSO.עבור באר הבקרה החיובית, להוסיף מדיום תרבות מלא בתוספת מיקרוליטר אחד למיליליטר DMSO, 150 ננוגרם למיליליטר PMA, ומיקרומול אחד לליטר של ionomycin. לדגור על הלוח ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני במשך שש שעות. לאחר שעה של דגירה, להוסיף 1.37 מיקרוגרם למיליליטר מונסין לתרבות.לאחר הדגירה של שש שעות הושלמה, צנטריפוגה את הצלחת ב 550 פעמים G במשך שלוש דקות. הסר את supernatant לשטוף את התאים פעם אחת עם 200 microliters של DPPs, כפי שהוכח בעבר. כתם עבור סמני שטח CD3, CD4 ו- CD8 וסמן כדאיות.לאחר השעיית התאים עם ויברטור, ולאחר מכן במקרר את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר שטיפת הצלחת פעם אחת עם 200 מיקרוליטרים של DPBS, לתקן ולחלחל לתאים, כתם עבור ציטוקינים תאיים, TNF אלפא ואינטרפרון-גמא, ומקרר את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. לשטוף את התאים שוב, ולהשעות אותם מחדש ב 150 microliters של חוצץ cytometry זרימה.לאחר מכן, לרכוש את נתוני ציטומטריית הזרימה באמצעות cytometer זרימה. לשמור על קווי תאים B-לימפובלסטואידים אלרגניים, או BLCLs, בבקבוק T-75. ביום 12 של הרחבת PBMC, לספור את מספר BLCLs קיימא, ולהעביר אותם צינורות צנטריפוגות 15 מיליליטר.צנטריפוגות התאים ב 350 פעמים G במשך 10 דקות ולהסיר את supernatant. משעים מחדש את גלולה התא ואת המדיום התרבותי המלא. לאחר מכן, תעתיקו את ה-BLCLs לצלחת תחתונה עגולה של 96-Well ב-4x10 עד התא הרביעי לבאר, ו-80 מיקרוליטרים של מדיום תרבותי שלם.הוסיפו 10 מיקרוגרם למיליליטר של פפטיד יחיד, והגדירו שני פקדי רקע. פפטיד פועם עם חסימת HLADR, ופועם DMSO. לדגור על הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, במשך שעתיים.מוסיפים 100 מיקרוגרם למיליליטר מיטומיצין C ודגר את הלוח ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך שעה אחת. לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם 200 microliters של RPMI 1640 כדי להסיר פפטיד בלתי מנוצל Mitomycin C, ולאחר מכן להשעות מחדש את התאים ב 120 microliters של מדיום תרבות מלאה, באמצעות ויברטור. ביום ה-12 של הרחבת ה-PBMC, העבר את מחשבי ה-PBMCs לצלחת תחתונה עגולה של 96 באר.צנטריפוגות התאים בצלחת, להסיר את supernatant, ולשטוף אותם פעמיים עם 200 microliters של RPMI 1640, כפי שהוכח בעבר. השהה מחדש את מחשבי ה-PBMCs בכל באר עם 210 מיקרו-לייטרים של מדיום תרבות מלא. עבור וולס PBMC שנבחר לזיהוי אפיטופה, aliquot 70 מיקרוליטרים של השעיית התא ומערבבים עם BLCLs פעום פפטיד בשלוש וולס, כולל שני פקדי רקע.לדגור על הלוח ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שש שעות. לאחר שעה של דגירה, להוסיף 1.37 מיקרוגרם למיליליטר מונסין לתרבות ולהביא את הנפח הסופי בכל באר ל 200 microliters עם מדיום תרבות מלאה. בדוגמה מייצגת זו, TNF אלפא ואינטרפרון-גמא הפרשת CD4 T תגובות תא עבור מאגר פפטיד Core11 נמוכים פי שניים מערכי הרקע, ולכן, נחשב שלילי.בינתיים, התגובות לבריכת הפפטיד Core09 גבוהות מפי שניים מהדף, ונחשבות חיוביות. הרקע האפור מציין ולס עם תגובה חיובית של תאי CD4 T ופפטידים מועמדים לזיהוי אפיטופ מצוינים באדום, Core01 יש את שיעור התגובה הגבוה ביותר, אם לשפוט על פי תאי CD4T הפרשת TNF אלפא ואינטרפרון-גמא במאגרי פפטיד עמודה. פפטידים C1 עד 15, C31 עד 45, C61 עד 75, ו- C91 עד 105 בבריכת פפטיד זו, מוגדרים כמו פפטידים מועמד כמו שורה של בריכות פפטיד המכיל פפטידים אלה גם להראות תוצאות חיוביות.מחשבי PBMCs מורחבים עם בריכות פפטיד Core07, 08, 09 ו-10, משמשים לזיהוי אפיטופים של פפטידים אלה. באופן דומה, Core09 יש את שיעור התגובה הגבוה ביותר בבריכות פפטיד שורה. כל הפפטידים בבריכה זו מוגדרים כמו פפטידים מועמדים PBMCs מורחבים עם בריכות פפטיד:Core01, 02, 03, 04, 05 ו 06 משמשים לזיהוי אפיטופה של פפטידים אלה.עבור מאגר פפטיד Core08 מורחב PBMCs, לאחר גירוי עם פפטיד C31 עד 45 BLCLs פעמו, התדרים של תאי TNF אלפא ואינטרפרון-גמא מפריש CD4 T גבוהים פי שניים מאשר פקדי רקע. לכן, פפטיד C31 עד 45 הוא epitope תא CD4 T מוגבל HLADR מאומת. זה היה שם, מחשבים אישיים מורחבים נוספים שנותרו לאחר זיהוי אפיטופה.סימון עדין של האפיטופים שזוהו יכול להתבצע באמצעות פאנל של פפטידים מקוצרים.

analysis-hbv-specific-cd4-t-cell-responses-identification-hla-dr

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הליך זה מדגים את טיהור בהרחבת במבחנה של אנטיגן ספציפי CD4 + T תאים מדם היקפי שלם להדמיה שלהם באמצעות MHC בכיתה tetramers השנייה. Tetramers לאפשר הדמיה ישירה של תאים T עם סגוליות לאנטיגן יחיד ומוגדר הגבלה MHC Class II.

Antigen CD4 + הדמיה ספציפיות תאים T באמצעות MHC Class II Tetramers

אפיון של T-cell epitopes של פתוגנים הגורמים לזיהומים מקומיים, כגון נגיף הפפילומה האנושי, מהווה אתגר בשל מספרם המוגבל של תאי T במחזור הדם. בשיטה המתוארת, תאי T נדירים בודדו ואופיינו החל ממספר קטן מאוד של תאים.

השימוש באינטרפרון-γ Assay האנזים המקושר Immunospot לאפיין רומן T-cell אפיטופים של וירוס הפפילומה האנושי

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בפפטיד: tetramers MHC וmicrobeads המגנטי לבודד אוכלוסיות בתדירות נמוכה של תאי T epitope ספציפיים ולנתח אותם על ידי cytometry זרימה. שיטה זו מאפשרת למחקר הישיר של אוכלוסיות תאי T אנדוגני עניין...

פפטיד: העשרת tetramer מבוסס MHC של תאי T epitope ספציפיים

הסרטון מדגים בדיקה באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC) שמקורם בתאי CD8+ T כדי לעכב שכפול נגיף הפטיטיס B (HBV) בעכברים. תאי T אלה, שהונדסו עם קולטנים ספציפיים ל-HBV, מועברים לעכברים טרנסגניים. פלסמידים של גנום HBV בעלי יכולת שכפול מוזרקים ישירות לכבד, ומאפשרים ספיגת DNA נגיפי. ברגע שאנטיגנים נגיפיים באים לידי ביטוי ומוצגים על ידי מולקולות MHC-I היברידיות, תאי T מהונדסים מזהים קומפלקסים אלה ונקשרים אליהם. זה מעורר שחרור של מולקולות ציטוטוקסיות, וכתוצאה מכך הרס של תאי כבד...

דיכוי שכפול נגיף הפטיטיס B באמצעות תאי T ספציפיים לאנטיגן נגיפי

מבחני ביוכימיים עם מולקולות MHC II רקומביננטי אדם יכולים לספק תובנות מהירים, כמותיים לזיהוי אפיטופ immunogenic, מחיקה, או עיצוב. הנה, assay מחייב פפטיד-MHC השני טיפס לצלחות 384 גם הוא תאר. פורמט חסכוני זה צריך להיות שימושי בתחומי deimmunization חלבון ועיצוב חיסון ופיתוח.

Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

מתחמי HLA / פפטיד אני כיתה שלמים הם מזילים על ידי תאים סרטניים, המייצגים את סמן ביולוגי לסרטן רלוונטי פוטנציאלי. ניצול טכנולוגיה ללא תווית חיישן וקולט T-cell מחקה נוגדנים חד-שבטיים, זיהוי של הסככה MIF / HLA-A * 02: 01 מתחמים בsupernatants תא מד"א MB-231, זינקו בסרום אנושי, ופלזמה חולה הפגינה, המאפשרת פיתוח של סרטן רומן פלטפורמת אבחון.

איתור של יקוציט האדם Antigen Biomarkers בסרטן שד ניצול הטכנולוגיה biosensor ללא תווית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור ספירת ואפיון מקוק רזוס CD8 + T תאים נגד נגיף האיידס. מאמר זה הוא שימושי לא רק בתחום האימונולוגיה HIV, אלא גם לאזורים אחרים של המחקר הביו-רפואי שבו התגובות תא CD8 + T ידועים בהשפעתם התוצאה המחלה.

ניתוח של CD8 וירוס ספציפי החיסוני Simian + T-התאים קופי רזוס ידי פפטיד-MHC-I tetramer מכתים

אי-התאמות לויקוציטים אנושיים רצפים אנטיגן (הלע) בין תורם איברים זוגות הנמענים הם הגורם העיקרי של דחיות בתיווך נוגדנים השתלת איברים. כאן אנו מציגים את השימוש מערכים אנטיגן מותאמות אישית המבוססות על רצפים התורמים הבודדים הלע כדי לחקור התורם אנטי alloantibodies הלע ב עוגב נמענים.

אישית פפטיד מערכים גילוי של Alloantibodies הלע בהשתלת איברים

פרוטוקול זה מתאר את השימוש של רשת יחיד MHC מחלקה אני מתחמי לחקור מולקולרית באינטראקציה האנושית CD8 + T תאים הפעלה: דור של הנדסה אנטיגן הצגת תאים המבטאים שרשרת אחת בונה, תרבות של שיבוט אנושי של תא CD8 + T וניסויים תא T הפעלה.

שימוש בטכנולוגיה MHC שרשרת אחת לחקור Co-agonism ב אנושי CD8 + T Cell הפעלה

הציג כאן הוא פרוטוקול לדיכוי יעיל של צהבת B וירוס (HBV) שכפול בעכברים על ידי ניצול התא המאמצת העברה (ACT) של תא גזע הנגזר אנטיגן נגיפי (Ag)-ספציפי לימפוציטים T. הליך זה עשוי להיות מותאם לטיפול חיסוני מבוסס-חוק של זיהום HBV.

גזע תא נגזר ויראלי Ag-לימפוציטים T שכפול HBV לדכא בעכברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לטיהור של MHC class I ומתחמי פפטיד מדרגה II מקווי עכבר ותא אנושי המספקים נתוני אימונופטידומיקה באיכות גבוהה. הפרוטוקול מתמקד בהכנת דגימה באמצעות נוגדנים זמינים מסחרית.

אימונופטידומיקה: בידוד של עכבר ו- MHC אנושי Class I- ופפטידים הקשורים II לניתוח ספקטרומטריית מסה

למדו הערכת תגובות תאי T CD4 ספציפיות ל-HBV וזיהוי אפיטופים באמצעות מטריצת פפטידים. שיטה זו מאפשרת אפיון תת-אוכלוסיות תאי T פונקציונליות בחולים עם דלקת כבד כרונית B.

ניתוח תגובות תאי T HBV ספציפיות ל- CD4 וזיהוי של Epitopes תאי T מוגבלים HLA-DR-CD4 המבוססים על מטריצת פפטיד

גלה סרטונים נוספים