Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Met behulp van de fluorescerende kleurstof, Rhodamine B, om paringsconcurrentievermogen bij mannelijke Aedes aegypti-muggen te bestuderen
Chapters
Summary May 7th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hier presenteren we een protocol voor het bestuderen van de paringsconcurrentie van mannelijke Aedes aegypti met fluorescerende kleurstof als marker. Vrouwelijke muggen worden blootgesteld aan zowel gemarkeerde als ongemarkeerde mannetjes voor copulatie. Na de paring worden hun spermathecae onderzocht onder een fluorescentiemicroscoop om hun paringspartner te bepalen.
Transcript
Dit protocol meet het concurrentievermogen van mannelijke muggenparing, wat een voorwaarde is voor op mannelijke vrijlating gebaseerde muggenpopulatieonderdrukkingsprogramma's. Dit geschiktheidscriterium wordt beoordeeld als onderdeel van kwaliteitscontrole en stamevaluatie. Deze methode vermindert de experimentele tijd met 90% en maakt de directe vergelijking van de paringsconcurrentie tussen twee steriele of Wolbachia-geïnfecteerde lijnen mogelijk.
Deze procedure wordt uitgevoerd door Irene Li en Keng Wai Mak. Om te beginnen, seks de mannelijke en vrouwelijke muggen in het popstadium, volgens hun grootteverschillen. Breng voor elke set muggen 100 mannelijke poppen over in een vooraf gelabelde kooi voor sucrosevoeding of Rhodamine B sucrose-voeding.
Plaats de vrouwelijke poppen in kleine partijen van 40 tot 50 per kooi. Controleer bij het verschijnen van de imago's de kooien op de aanwezigheid van mannelijke muggen. Om de 0,2% Rhodamine B sucrose-oplossing te bereiden, lost u 200 milligram Rhodamine B-poeder op voor elke 100 milliliter 10% sucrose-oplossing.
Meng goed om ervoor te zorgen dat al het poeder is opgelost. Bereid 20 suikervoederflessen voor met een lont. Voeg 10 milliliter 10% sucrose toe aan 10 feederflessen en 10 milliliter 0,2% Rhodamine B sucrose-oplossing voor de andere 10 feederflessen.
Plaats vijf voederflessen in elke voorbereide mannelijke kooi en laat de mannelijke muggen zich drie dagen voeden voor het paringsexperiment. Zet de kwikbranderlamp en de stereomicroscoop aan. Laat de lichtbron naar de kwikbranderlamp gedurende 10 minuten stabiliseren.
Stel vervolgens de fluorescentiefilters in voor rode fluorescentie-eiwit één. Aspirateer een klein aantal muggen tegelijk in de glazen buis van de orale aspirator. Observeer door de glazen buis het lichaam van de mannelijke muggen onder de fluorescerende stereomicroscoop.
Gebruik alleen mannelijke muggen gemarkeerd met Rhodamine B voor het experiment. Transfer set Een mannelijke muggen in 12 papieren bekers vastgezet met gaas. Plaats 10 sucrose gevoede mannelijke muggen per kopje in zes kopjes, en 10 Rhodamine B sucrose gevoed mannelijke muggen per kopje in de andere zes kopjes.
Herhaal deze stap voor set B mannelijke muggen. Stel 12 kooien in voor de paringstest. In elk van de zes kooien, omvatten 10 set A mannelijke muggen die Rhodamine B gemarkeerd zijn, 10 ongemarkeerde set B mannelijke muggen en 10 maagdelijke wilde vrouwelijke muggen.
In de andere zes kooien, omvatten 10 ongemarkeerde set A mannelijke muggen, 10 Rhodamine B gemarkeerde set B mannelijke muggen en 10 maagdelijke wilde vrouwelijke muggen. Label deze kooien om duidelijk onderscheid te maken tussen de twee paringscombinaties. Plaats de respectievelijke kopjes van mannetjes in de paringskooien volgens de labels.
Verwijder het gaas en tik zachtjes op de beker om de mannetjes uit de beker te duwen. Verwijder voorzichtig de papieren beker en het gaas uit de kooi om ervoor te zorgen dat er geen muggen uit de kooi ontsnappen. Laat de mannelijke muggen minstens een uur acclimatiseren in de paringskooi.
Breng met behulp van een orale aspirator maagdelijke wilde vrouwelijke muggen over in 12 papieren bekers, elke beker bevat 10 muggen. Na de acclimatisatieperiode voor de mannelijke muggen, breng een kopje vrouwtjes over in elke paringskooi en verwijder het gaas. Duw de beker voorzichtig om eventuele resterende vrouwelijke muggen uit de beker te halen en verwijder vervolgens voorzichtig de papieren beker en het gaas uit de kooi om ervoor te zorgen dat er geen muggen uit de kooi ontsnappen.
Laat de paring drie uur plaatsvinden en beëindig vervolgens het paringsexperiment door alle muggen uit elke kooi te verwijderen met een mechanische aspirator. Verdoof de muggen op ijs gedurende ten minste vijf minuten. Wanneer de muggen volledig zijn verdoofd, pak je de vrouwelijke muggen voorzichtig op en huisvest je ze in een aparte papieren beker die is beveiligd met gaas.
Label de papieren beker door het betreffende etiket van de paringskooi op de beker over te brengen. Om vrouwelijke spermathecae te scoren, verdoving je de vrouwelijke muggen op ijs gedurende ten minste vijf minuten voordat ze onder een stereomicroscoop worden gediscedeerd. Ontleed de vrouwelijke mug onder de stereomicroscoop.
Onderzoek de spermathecae onder microscoop. Als het vrouwtje niet geïnsemineerd is, zouden alle drie de spermathecae leeg zijn en als ze geïnsemineerd zouden twee of drie van de spermathecae gevuld zijn met beweeglijk sperma. Voor geïnsemineerde individuen, bepaal of de spermathecae Rhodamine B gemarkeerde zaadvloeistof bevatten door ze te onderzoeken onder de fluorescerende stereomicroscoop uitgerust met een RFP1-filter.
Als de spermathecae is gevuld met zaadvloeistof die niet is gemarkeerd met Rhodamine B, wordt geen fluorescentie waargenomen. Aan de andere kant, als de spermatheca Rhodamine B gemarkeerde zaadvloeistof bevat, zou het oranje fluoresceren. Het doel van deze paringsconcurrentietest was om te bepalen of er een verlies in mannelijke paringsfitheid zou kunnen zijn na verschillende generaties inteelt.
Experimentele drievoud van de paringsconcurrentietest werden uitgevoerd en de inseminatiegegevens worden hier weergegeven. Wild-type vrouwtjes werden geïnsemineerd door de inteelt- of outcross-mannetjes, met wederzijdse markering. De resultaten tonen aan dat het aandeel vrouwtjes geïnsemineerd door de inteelt- of outcross-mannetjes niet werd beïnvloed door de Rhodamine B-markering.
Een significant hoger percentage vrouwtjes paarde met de outcross-mannetjes dan met de inteeltmannetjes in alle drie de replicants, wat aangeeft dat inteelt kan leiden tot verlies van paringsfitheid. Het is belangrijk om extra kooien van vrouwelijke muggen voor te bereiden. Gebruik geen vrouwelijke muggen uit een kooi die is besmet met mannelijke muggen, omdat vooraf geïnsemineerde vrouwtjes alle gegevens ongeldig zouden maken.
Anders dan laboratoriumgebaseerde paringsconcurrentietest, kan deze procedure worden gebruikt in mark release-recapture-experimenten om de biologie van de paring van insecten, populatiedynamiek en de verspreiding ervan te bestuderen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
