מיפוי לולאות R ו-RNA: היברידיות DNA עם שיטות אימונו-משקעים מבוססות S9.6

סיכום

לולאות R מהוות מחלקה נפוצה של מבני DNA שאינם B מונעי שעתוק המתרחשים בכל הגנומים בהתאם הן לרצף ה-DNA והן להעדפה טופולוגית. בשנים האחרונות, לולאות R היו מעורבות במגוון תפקידים אדפטיביים ולא מסתגלים ונקשרו לחוסר יציבות גנומית בהקשר של הפרעות אנושיות. כתוצאה מכך, המיפוי המדויק של מבנים אלה בגנום מעורר עניין רב עבור חוקרים רבים. DRIP-seq (DNA:RNA Immunoprecipitation ואחריו ריצוף תפוקה גבוהה) מתואר כאן. זוהי טכניקה חזקה וניתנת לשחזור המאפשרת מיפוי מדויק וחצי כמותי של לולאות R. מתואר גם איטרציה עדכנית של השיטה שבה מתבצע פיצול באמצעות סוניקציה (sDRIP-seq), המאפשרת מיפוי ספציפי לגדיל וברזולוציה גבוהה של לולאות R. sDRIP-seq מתייחס אפוא לכמה מהמגבלות הנפוצות של שיטת DRIP-seq מבחינת רזולוציה ותקיעות, מה שהופך אותה לשיטה הנבחרת למיפוי לולאת R.

תקציר

לולאות R מהוות מחלקה נפוצה של מבני DNA שאינם B מונעי שעתוק המתרחשים בכל הגנומים בהתאם הן לרצף ה-DNA והן להעדפה טופולוגית. בשנים האחרונות, לולאות R היו מעורבות במגוון תפקידים אדפטיביים ולא מסתגלים ונקשרו לחוסר יציבות גנומית בהקשר של הפרעות אנושיות. כתוצאה מכך, המיפוי המדויק של מבנים אלה בגנום מעורר עניין רב עבור חוקרים רבים. DRIP-seq (DNA:RNA Immunoprecipitation ואחריו ריצוף תפוקה גבוהה) מתואר כאן. זוהי טכניקה חזקה וניתנת לשחזור המאפשרת מיפוי מדויק וחצי כמותי של לולאות R. מתואר גם איטרציה עדכנית של השיטה שבה מתבצע פיצול באמצעות סוניקציה (sDRIP-seq), המאפשרת מיפוי ספציפי לגדיל וברזולוציה גבוהה של לולאות R. sDRIP-seq מתייחס אפוא לכמה מהמגבלות הנפוצות של שיטת DRIP-seq מבחינת רזולוציה ותקיעות, מה שהופך אותה לשיטה הנבחרת למיפוי לולאת R.

מבוא

לולאות R הן מבני חומצות גרעין תלת-גדיליות הנוצרים בעיקר במהלך השעתוק עם הכלאה של תעתיק ה-RNA המתהווה לגדיל ה-DNA של התבנית. זה מביא להיווצרות הכלאה של RNA:DNA וגורם לתזוזה של גדיל ה-DNA שאינו תבנית במצב לולאה חד-גדילי. בנייה מחדש ביוכימית ^1,2,3,4 ומודלים מתמטיים⁵, בשילוב עם מדידות ביופיזיקליות אחרות ^6,7, קבעו כי לולאות R נוטות יותר להתרחש באזורים המציגים מאפיינים חיוביים ספציפיים. לדוגמה, אזורים המציגים אסימטריה של גדיל בהתפלג....

פרוטוקול

הפרוטוקול הבא מותאם לקו תאי Ntera-2 אנושי שגדל בתרבית, אך הוא הותאם בהצלחה ללא שינוי למגוון קווי תאים אנושיים אחרים (HEK293, K562, HeLa, U2OS), תאים ראשוניים (פיברובלסטים, תאי B) וכן באורגניזמים אחרים עם שינויים קטנים (עכברים, זבובים).

1. קצירת תאים וליזה

1. תרבית תאי Ntera-2 למפגש של 75%-85%. ודא שספירת התאים האופטימלית היא 5 עד 6 מיליון תאים עם >90% ספירות ברות קיימא כדי להתחיל כל הליך DRIP.
2. שוטפים את התאים פעם אחת עם 1x PBS, מוסיפים 1.5 מ"ל של Trypsin-EDTA 1x, ולאחר מכן מדגרים למשך 2 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס עד שהתאים מתנתקים מהצלחת.
3. הוסף 5 מ"ל של מדיה חמה ופיפטה היטב כדי....

תוצאות

ניתן לנתח DRIP כמו גם sDRIP באמצעות qPCR (איור 2A) ו/או ריצוף (איור 2B). לאחר שלב המשקעים החיסוניים, יש לאשר תחילה את איכות הניסוי על ידי qPCR על מוקדי בקרה חיוביים ושליליים, כמו גם עם בקרות שטופלו ב-RNase H. פריימרים המתאימים למיקומים בשימוש תכוף במספר קווי תאים אנושיים מסופקים בטבלה 2. יש להציג את התוצאות מ-qPCR כאחוז קלט, המתאים לאחוז התאים הנושאים לולאת R בזמן הליזיס עבור לוקוס נתון. בניסוי DRIP מוצלח, התשואה עבור מיקומים שליליים צריכה להיות.......

דיון

מתוארים כאן שני פרוטוקולים למיפוי מבני לולאת R בכל אורגניזם פוטנציאלי המשתמש בנוגדני S9.6. DRIP-seq מייצג את טכניקת המיפוי הראשונה של לולאת R ברחבי הגנום שפותחה. זוהי טכניקה קלה, חזקה וניתנת לשחזור המאפשרת למפות את התפלגות לולאות R לאורך כל גנום. הטכניקה השנייה, המכונה sDRIP-seq, היא גם חזקה וניתנת לשחזור אך משיגה רזולוציה גבוהה יותר וספציפיות גדיל עקב הכללת שלב סוניקציה ופרוטוקול בניית ספריית רצף תקוע. שתי הטכניקות רגישות מאוד לטיפול ב-RNase H לפני משקעים חיסוניים, מה שמאשר שהאות נגזר ב.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
15 מ"ל צינור בצפיפות גבוהה Maxtract פאזה נעילת ג'ל	Qiagen	129065
2 מ"ל צינור פאזה נעילת ג'ל אור	VWR	10847-800
אגרוז A/G חרוזים	ThermoFisher Scientific	20421
Agencourt AMPure XP חרוזים	בקמן קולטר	A63881
AmpErase Uracil N-glycosylase	ThermoFisher Scientific	N8080096
מתאמי אינדקס	Illumina		תואם לאינדקסים הבודדים של TrueSeq
מקטע Klenow (3' עד 5' exo-)	New England BioLabs	M0212S
NEBNext End repair	New England BioLabs	E6050
PCR פריימרים להגברת ספרייה			פריימר 1.0 P5 (5 אינץ' AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCTTTCCCTACACGA 3')
פריימרים PCR להגברת			פריימר PCR 2.0 P7 (5 אינץ' CAAGCAGAAGACGGCATACG AGAT 3')
פנול/כלורופורם איזואמיל אלכוהול 25:24:1	Affymetrix	75831-400ML
Phusion Flash High-Fidelity PCR master mix	ThermoFisher Scientific	F548S
ערכת קשירה מהירה	ניו אינגלנד BioLabs	M2200S
ריבונוקלאז H	ניו אינגלנד BioLabs	M0297S
S9.6 נוגדן	Kerafast	ENH001	שלושת אלה המקורות שווי ערך
לנוגדנים S9.6	Millipore/Sigma	MABE1095
S9.6 נוגדן	Abcam	ab234957

module ספרייה