מבחני נדידת תאים והידבקות תאים לחקירת אינטראקציה בין לישמניה-תא מארח

סיכום

כאן אנו חוקרים את ההשלכות של אינטראקציה בין לישמניה-מארח על ידי חקירת נדידת תאים דנדריטיים נגועים בלישמניה. מתוארים התמיינות וזיהום של תאים דנדריטיים, ניתוח נדידה והערכת מתחמי הידבקות ודינמיקת אקטין. ניתן ליישם שיטה זו במחקרי נדידת תאים מארחים אחרים כאשר הם נגועים בלישמניה או מיני טפילים תוך-תאיים אחרים.

תקציר

לישמניה הוא טפיל פרוטוזואי תוך-תאי הגורם לספקטרום רחב של ביטויים קליניים, החל מנגעים עוריים מקומיים המתפרקים מעצמם ועד לצורה קרבית קטלנית ביותר של המחלה. על פי הערכות, 12 מיליון אנשים ברחבי העולם נדבקים כיום, ועוד 350 מיליון נמצאים בסכנת הדבקה. ידוע שתאי מארח הנגועים בטפילי לישמניה , כגון מקרופאגים או תאים דנדריטיים, יכולים לנדוד לרקמות מארח שונות, אך כיצד הנדידה תורמת להפצת הטפילים ולביות נותרה לא מובנת היטב. לכן, הערכת יכולתם של טפילים אלה לווסת את תגובת התא המארח, ההידבקות והנדידה תשפוך אור על המנגנונים המעורבים בהפצת מחלות ובוויסרליזציה. נדידת תאים היא תהליך מורכב בו תאים עוברים קיטוב ובליטה, מה שמאפשר להם לנדוד. תהליך זה, המווסת על ידי דינמיקת מיקרו-צינורות מבוססת אקטין וטובולין, כרוך בגורמים שונים, כולל אפנון ההידבקות התאית למצע. תהליכי הידבקות והגירה תאיים נחקרו באמצעות מספר מודלים. כאן, אנו מתארים שיטה לאפיון ההיבטים הנודדים של תאי מארח במהלך זיהום לישמניה . פרוטוקול מפורט זה מציג את ההתמיינות והזיהום של תאים דנדריטיים, ניתוח התנועתיות והנדידה של תאי המארח, והיווצרות מתחמי הידבקות ודינמיקת אקטין. פרוטוקול מבחנה זה נועד להבהיר עוד יותר את המנגנונים המעורבים בהפצת לישמניה, בתוך רקמות מארחות של בעלי חוליות, וניתן גם לשנות אותו וליישם אותו במחקרי נדידת תאים אחרים.

מבוא

לישמניאזיס, מחלה טרופית מוזנחת הנגרמת על ידי טפילי פרוטוזואים השייכים לסוג לישמניה, גורמת למגוון רחב של ביטויים קליניים, החל מנגעים עוריים מקומיים בריפוי עצמי ועד לצורות קרביות קטלניות של המחלה. ההערכה היא כי עד מיליון מקרי לישמניאזיס חדשים מתעוררים מדי שנה, כאשר 12 מיליון אנשים נדבקים כיום ברחבי העולם¹. לישמניאזיס קרביים (VL), שעלולה להיות קטלנית ביותר מ-95% מהמקרים כאשר אינה מטופלת, גורמת ליותר מ-50,000 מקרי מוות מדי שנה, ומשפיעה על מיליונים בדרום אמריקה, מזרח אפריקה, דרום אסיה^{ואזור הים} התיכון. הגורם האטיולוגי העיקרי של VL בעולם החדש, Leishmania infantum, מועבר לבני א....

פרוטוקול

הנהלים המתוארים כאן אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של מכון גונסאלו מוניז (IGM-FIOCRUZ, פרוטוקול מס' 2.751.345). דגימות דם נלקחו מתורמים מתנדבים בריאים. הליכי ניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לעקרונות האתיים במחקר בבעלי חיים שאומצו על ידי החוק הברזילאי 11.784/2008 ואושרו ואושרו על ידי הוועדה האתית למחקר בבעלי חיים של מכון גונסאלו מוניז (IGM-FIOCRUZ, פרוטוקול מס' 014/2019).

1. בידוד והתמיינות של תאים דנדריטיים אנושיים

1. פיפטה 10 מ"ל של מדיום שיפוע הצפיפות בצינורות צנטריפוגה של 50 מ"ל.
2. סמן את הצינורות של 50 מ"ל בהתאם לדגימה של כל תורם.
3. אסוף ~ 50 מ"ל דם ורידי מתורמים בריאים ולאחר....

תוצאות

פרוטוקול זה המתואר כאן מאפשר להעריך את נדידת התאים והמנגנונים הנלווים אליה, כגון דינמיקת אקטין והדבקה, ובכך מספק כלי לקביעת הנדידה של תאי מארח נגועים בלישמניה בתוך מארח החולייתנים. התוצאות המוצגות כאן מדגימות כי בדיקה חוץ גופית זו מספקת אינדיקציות מהירות ועקביות לשינויים בהידבקות התאית, הנדידה ודינמיקת האקטין לפני ניסוי in vivo .

ראשית, התאים תורבבו בהצלחה בעקבות טכניקות אספטיות ופרוטוקולי מעבדה. נתונים שנוצרו באמצעות ניתוח הגירה באמצעות תוספות קרום תרבית תאים אפשרו .......

דיון

השיטה המתוארת כאן להערכת נדידת תאים באמצעות מערכת הוספות ממברנה של תרבית תאים מאפשרת לחוקרים לחקור את תגובת הנדידה של תאים בסביבה דו-ממדית. בטכניקה זו, שלבים מסוימים נחשבים קריטיים. ראשית, ההבחנה בין DCs אנושיים והדבקה בלישמניה הם מכריעים מכיוון ששיעור ההדבקה תלוי בתורם. שימוש ביותר מתורם אחד בכל ניסוי ותרביות לישמנייה בריאות יאפשרו תוצאות עקביות יותר. כמו כן, חיוני לשמור על טפילים בבעלי חיים מארחים, מה שמעדיף בחירה ותחזוקה של זנים אלימים ויכולת ליישב בקלות תאים מארחים........

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
16 מחט	מד Descarpack	353101
24 באר צלחת תרבית תאים	JET-BIOFIL	J011024
25 מד	מחט Descarpack	353601
אלבומין מסרום בקר	סיגמא אולדריץ'	A2153-100G
אמוניום כלוריד	סיגמא אולדריץ'	A-0171
אנטי עכבר IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A32723
Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11032
Anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11011
CD14 MicroBeads	MACS Myltenyi Biotec	130-050-201
בקבוק תרבית תאים 25 ס"מ2	SPL	70125
Cellstripper	קורנינג	25-056-CI
מיקרוסקופ קונפוקלי	Leica	TCS SP8
עיגולי כיסוי 13 מ"מ	Perfecta	10210013CE
מלקחיים לניתוח	VWR	82027-406
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
צינור בז	KASVI	K19-0051
סרום בקר עוברי	gibco
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	אולימפוס	BX51
זכוכית שקופיות  25,4x76,2 מ"מ	Perfecta	200
Hemin בקר	סיגמא Aldrich	H2250
המוציטומטר	Perfecta	7302HD
Histopaque® 1077	Sigma Aldrich	10771
MACS buffer	MACS Myltenyi Biotec	130-091-221
מינימום חיוני בינוני	Gibco	41090093
עכבר אנטי-RAC1	BD	610650
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	158127
Phalloidin Alexa Fluor 488	Invitrogen	A12379
פוספט חוצץ מלח	ThermoFisher	AM9624
מוסיף טרנסוול ממברנה פוליקרבונט - גודל נקבוביות 5.0 ומיקרו; m	Corning	3421
ProLong זהב DAPI ערכת	Invitrogen	P36931
ארנב אנטי-Cdc42	Invitrogen	PA1-092X
ארנב אנטי-FAK (pTyr397)	Invitrogen	RC222574
ארנב אנטי-פקסילין (pTyr118)	Invitrogen	QF221230
ארנב אנטי-RhoA	Invitrogen	OSR00266W
CCL3 אנושי רקומביננטי	D Systems	270-LD-010
רקומביננטי אנושי GM-CSF	PeproTech	300-03
רקומביננטי אנושי IL-4	PeproTech	200-04
רקומביננטי אנושי M-CSF	PeproTech	300-25
RPMI 1640	בינוני Gibco	21870076
Saponin	Sigma Aldrich	47036 – 50G – מזרק F
3 מ"ל	Descarpack	324201
טריפן כחול	Gibco	15250061

16000044מו"פ