Name: Absorção de Vesículos Extracelulares Fluorescentes Em Vitro e na Medula Espinhal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprenda a marcar vesículas extracelulares pequenas com corantes PKH e rastrear sua absorção in vitro e na medula espinhal. Este protocolo auxilia no estudo de dor e inflamação.

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Este estudo foi apoiado por subsídios do NIH NINDS R01NS102836 e do Departamento de Saúde da Pensilvânia Universal Research Enhancement (CURE) concedidos a Seena K. Ajit. Agradecemos ao Dr. Bradley Nash pela leitura crítica do manuscrito.

NOTA: Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com o Guia nih para o cuidado e uso de animais de laboratório e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade Drexel. Os camundongos CD-1 grávidas foram usados para a cultura astróctica, e todas as barragens foram recebidas 15 dias após a impregnação. Os camundongos C57BL/6 de dez e doze semanas foram usados para experimentos de absorção in vivo.
1. Isolamento de sEVs de células macrófagos RAW 264.7
<ol><li>Cultura RAW 264,7 células em 75 cm2 frascos em MMEM exosome-despojado médio contendo 10% de soro bovino fetal exososome -despojado (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina (pen-estreptomicina) por 24-48 h.</li>
	<li>Colete 300 mL de média e centrífuga condicionada a 300 × g por 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Colete o supernatante e centrífuga a 2.000 × g por 20 min a 4 °C.</li>
	<li>Transfira o supernatante para tubos de centrífuga, centrífuga por 35 min a 12.000 × g a 4 °C.</li>
	<li>Colete o supernatante e filtre através de um filtro de seringa de 0,22 μm.</li>
	<li>Transfira para tubos ultracentrífugas e centrífuga por 80 min a 110.000 × g a 4 °C.</li>
	<li>Armazene o supernatante (meio exossomo esgotado), resuspense a pelota em 2 mL de salina tamponada com fosfato de 1x (PBS) e centrífuga por 1h a 110.000 × g a 4 °C.</li>
	<li>Resuspenque a pelota em 100 μL de PBS para caracterização adicional usando análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM) ou no tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) para mancha ocidental.</li>
</ol>2. Caracterização de sEVs
<ol><li>Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) NOTA: A distribuição de tamanho e o número/concentração de partículas dos sEVs purificados das células RAW 264.7 foram medidos pela NTA.<ol>
<li>Diluir os sEVs no PBS filtrado para obter 20-60 vesículas por campo de visão para um rastreamento ideal.</li>
		<li>Introduza a amostra diluída em uma célula de fluxo usando uma bomba de seringa com uma taxa de fluxo constante.</li>
		<li>Faça 3-5 vídeos de 30 s cada. Defina a velocidade e o ganho do obturador e concentre manualmente as configurações da câmera para que o número máximo de vesículas seja visível e capaz de ser rastreado e analisado.</li>
		<li>Avance as amostras entre cada gravação para realizar medições de replicação. Otimize as configurações pós-aquisição da NTA e mantenha as configurações constantes entre as amostras.</li>
		<li>Analise cada vídeo usando o software NTA para obter o tamanho médio e concentração das vesículas.</li>
		<li>Realize todas as medições NTA com configurações de sistema idênticas para consistência.</li>
	</ol></li>
	<li>Mancha ocidental<ol>
<li>Quantifique as quantidades totais de proteína em SEVs, lises celulares e mídia exosome-despoqueda usando um kit de ensaio de proteínas seguindo as instruções do fabricante.</li>
		<li>Para a preparação do lisecelular, cultura as células RAW 264,7 em frascos de 75 cm2 até 80-90% confluentes. Despeque as células com 0,25% de trippsina por 10-15 min, neutralize a trippsina com mídia cultural e pelota as células girando a 400 × g por 5 min. Resuspend as células em meio de crescimento fresco.</li>
		<li>Conte as células usando um hemócito e transfira 1 × 106 células para outro tubo. Lave as células com PBS duas vezes usando as mesmas condições de centrifugação acima e adicione 50 μL de tampão de lise (tampão RIPA com coquetel inibidor de protease adicionado) à pelota da célula a partir do giro final.</li>
		<li>Vórtice as células e mantê-las no gelo por 20 minutos. Sujeito a mistura à centrifugação a 10.000 × g por 30 min a 4 °C, colete o sobrenascer (ou seja, o lise) em tubos de microcentrifuus frescos e mantenha-se a −80 °C até usar.</li>
		<li>Concentre 2 mL de mídia exossome-esgotado a 100 μL usando filtros centrífugos de corte de 3 kDa antes de quantificar a quantidade de proteína. Misture os sEVs com tampão de lise em uma proporção de 1:1, vórtice para 30 s e incubar no gelo por 15 minutos para quantificar a quantidade de proteína.</li>
		<li>Misture quantidades iguais de proteína (2 μg) dos sEVs, lysato de células RAW 264,7 e mídia exossome-despojada com redução do buffer amostral.</li>
		<li>Desnaturar as amostras a 95 °C por 5 min, mantê-las no gelo por 5 minutos, e girar por 2 min a 10.000 × g. Carregue as amostras em um gel de proteína tris-glicina de 12% e execute o gel a 125 V por 45 min.</li>
		<li>Transfira a proteína para uma membrana de difluoreto de polivinida (PVDF) a 25 V por 2 h.</li>
		<li>Após a transferência, bloqueie as membranas PVDF com tampão de bloqueio (ver a Tabela de Materiais) por 1h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar a mancha com anticorpos primários em um agitador durante a noite a 4 °C. NOTA: Os anticorpos primários utilizados foram anti-CD81 (1:1.000), anti-alfa-1,3/1,6-mannosyltransferase (ALG-2)-interacting protein X (Alix) (1:1.000), anti-Calnexin (1:1.000) e antigliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) (1:1.000).</li>
		<li>Lave as manchas 3 x 15 min com soro fisiológico 1x Tris-tampão, 0,1% Tween 20 (TBST), e incubar à temperatura ambiente com anti-rato de cabra IgG-rabanete peroxidase (HRP)- ou anti-coelho anti-coelho IgG-HRP-conjugado anticorpos secundários (1:10.000) para 1 h no shaker.</li>
		<li>Lave as manchas 3 x 15 min com 1x TBST e detecte as proteínas usando um substrato HRP.</li>
		<li>Analise as manchas por quimiominascência aprimorada usando um imager de mancha ocidental.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)<ol>
<li>Corrigir sEVs resusususá-los em 2% de paraformaldeído (PFA) em tampão fosfato de 0,1 M (PB); vórtice para 2 x 15 s.</li>
		<li>Coloque uma gota de 10 μL de suspensão sEV em parafilm limpo. Flutue a grade formvar revestida de carbono na queda com seu lado revestido de frente para a suspensão. Deixe as membranas absorverem por 20 minutos em um ambiente seco.</li>
		<li>Coloque as grades (lado da membrana para baixo) em uma gota de PB para lavar por 3 x 2 min.</li>
		<li>Transfira as grades para 50 μL de 1% de glutaraldeído por 5 min.</li>
		<li>Lave as grades com 100 μL de água destilada por 8 x 2 min.</li>
		<li>Contraste a amostra colocando as grades em uma queda de 1% de acetato de uranyl por 2 min.</li>
		<li>Incorpore a amostra com 50 μL de acetato de urilo de 0,2% com solução de metilcelulose de 2% por 10 minutos em uma antena de gelo coberta de parafilm.</li>
		<li>Use laços de aço inoxidável para segurar as grades e remover o excesso de fluido com papel filtro.</li>
		<li>Seque a rede por 10 minutos enquanto ainda estiver no loop.</li>
		<li>Observe sob um microscópio eletrônico de transmissão a 80 kV.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Rotulagem de sEVs
<ol><li>Diluir 20 μg de sEVs em 1 mL de tampão diluído ou o mesmo volume de PBS em 1 mL de tampão diluído para controle de corante.</li>
	<li>Diluir 3 μL de corante PKH67 ou PKH26 em 1 mL de tampão diluído e misturar por pipetação.</li>
	<li>Adicione corante PKH diluído aos sEVs diluídos e misture por pipetação. Incubar por 5 minutos no escuro à temperatura ambiente. Para um controle de corante, misture o corante diluído com o PBS diluído da etapa 3.1.</li>
	<li>Adicione 2 mL de 1% de gérso bovino (BSA) no PBS ao tubo com o corante e a mistura sEV e ao tubo de controle de corante para absorver o excesso de corante.</li>
	<li>Centrifugar por 1h a 110.000 × g a 4 °C. Descarte o supernasce, resuspenque a pelota em 2 mL de PBS e centrífuga por 1h a 110.000 × g a 4 °C. Repita a lavagem com PBS e resuspenque os sEVs rotulados ou o controle de corante em um volume igual de PBS.</li>
	<li>Quantifique a quantidade total de proteína pelo método Bradford.</li>
</ol>4. Captação de sEVs por células Neuro-2a
<ol><li>Coloque tampas de 18 mm em uma placa de 12 poços e placa 10 × 104 células Neuro-2a em cada poço em um total de 1 mL de meio DMEM completo contendo 10% de FBS e 1% de estreptococos de caneta.</li>
	<li>Mude o meio para o dMEM exossome-esgotado quando a confluência celular é de 80-90%. Adicione 1, 5 ou 10 μg de SEVs rotulados em cada poço por 1, 4 e 24 h para captação dependente de dose e tempo, ou adicione um volume igual de controle de corante.</li>
</ol>5. Culturas astrócticas primárias
<ol><li>Anestesiar 4 filhotes pós-natais 4 dias após o nascimento induzindo hipotermia.</li>
	<li>Colete os cérebros em uma placa de Petri de 60 mm contendo solução de sal balanceado (HBSS) de gelo da Hank's Balanced com 10 mM 4-(2-hidroxitil)-1-piperazineethanethanesulfônico (HEPES).</li>
	<li>Dissecar os dois lobos cortical e remover as meninges. Pique os tecidos com uma lâmina esterilizada.</li>
	<li>Transfira os tecidos para um tubo cônico de 15 mL contendo papan/desoxyribonuclease I tampão de dissociação e incubar por 20 min a 37 °C. Redemoinho a cada 5 minutos. NOTA: Para 4 cortices de camundongos, 9 mL de 7,5 U/mL papain no HBSS é ativado a 37 °C por pelo menos 30 min, filtrado através de um filtro de seringa de 0,22 μm e misturado com desoxiribonuclease I a uma concentração final de 0,1 mg/mL.</li>
	<li>Aspire o supernasal e adicione 5 mL de DMEM completo para inativar a atividade enzimátil. Treque cuidadosamente para dissociar os tecidos com uma pipeta sorológica de vidro de 5 mL e uma pipeta Pasteur polida em chamas.</li>
	<li>Passe a suspensão celular através de um coador de células de 40 μm e centrifugar as células a 250 × g por 5 min a 4 °C. Aspire as células médias e semeadas em 10 mL de DMEM completo em um frasco de 75 cm2. Substitua o meio supernatante por 15 mL de DMEM médio fresco 4h após o revestimento.</li>
	<li>Após 14 dias in vitro,transfira o frasco para um agitador orbital para desprender a microglia e os oligodendrócitos a 320 rpm por 6h.</li>
	<li>Trypsinize os astrócitos restantes usando 5 mL da enzima de dissociação celular(Tabela de Materiais) por 10 min a 37 °C. Adicione 5 mL de DMEM completo para inativar a ação enzimática e pelotar as células a 250 × g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Resuspenda as células em DMEM completo. Semente 5 × 104 células em 12 mm #1,5 tampas em uma placa de 24 poços.</li>
</ol>6. Captação de sEVs por astrócitos
<ol><li>Quando os astrócitos atingirem 80-90% de confluência, mude o meio para o dMEM exososome-desporoso.</li>
	<li>Adicione 1 μg de SEVs não rotulados e rotulados, um volume igual de controle de corante ou PBS às células. Use as células para coloração 1h e 24 h após o tratamento sEV.</li>
</ol>7. Imunofluorescência
<ol><li>Enxágüe as células com PBS 3x e fixe-as com 4% de PFA em PB por 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave as células fixas 3 x 5 min com PB e permeabiliza-as usando 0,1% Triton X-100 em PB por 10-15 min e lave com PB 3 x 5 min.</li>
	<li>Bloqueie as células com soro de cabra 5% normal (NGS) na PB por 1h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar as células com anticorpos primários: proteína associada a microtúbulos 2 (MAP2A, 1:500) para células Neuro-2a ou proteína ácida fibrilar glial (GFAP, 1:500) para astrócitos primários em 5% NGS/PB fresco durante a noite a 4 °C com agitação suave.</li>
	<li>Lave 3 x 10 min com PB e adicione anticorpos secundários conjugados com fluoróforo (Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594; ou Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488) em 5% NGS e incubar por 2 h à temperatura ambiente em um roqueiro.</li>
	<li>Lave 3 x 10 min com PB e incubar com 1 μg/mL de mancha nuclear 4',6-diamidino-2-fenilômalo (DAPI) por 10 minutos à temperatura ambiente. Lave as células novamente 3x com PB.</li>
	<li>Monte as tampas em slides #1 usando um meio de montagem antifade. Deixe-os secar durante a noite no escuro, e armazene os slides de vidro preparados a 4 °C até a imagem em um microscópio confocal.</li>
</ol>8. Captação in vivo de sEVs
<ol><li>Realizar injeção intrathecal de 5 μg de sEVs não rotulados ou rotulados resuspended em 10 μL de PBS, ou igual volume (10 μL) de controle de corante (como preparado na seção 3) em camundongos C57BL/6.</li>
	<li>Após 6 e 18 h pós-injeção de sEVs, anestinar profundamente os camundongos por injeção intraperitoneal de 100 mg/kg de peso corporal de cetamina e 10 mg/kg de peso corporal de xilazina.</li>
	<li>Realizar perfusão intracárdia de camundongos com soro fisiológico de 0,9% para fora do sangue, seguido por 4% de PFA/PB recém-feito no gelo.</li>
	<li>Dissecar a medula espinhal e fixar em 4% PFA/PB a 4 °C por 24 h. Crioprotetor os tecidos em 30% de sacarose na PB a 4 °C por 24 h ou até que os tecidos afundem. Armazene os tecidos a 4 °C até a imunohistoquímica.</li>
</ol>9. Imunohistoquímica
<ol><li>Incorpore medula espinhal L4-L5 no composto O.C.T. Congele em gelo seco até solidificar completamente.</li>
	<li>Se sectionia os tecidos a 30 μm (transversalmente para a medula espinhal) usando um criostat e colete as seções em uma placa de 24 poços contendo PB. Lave as seções 3 x 5 min com Triton 0,3% em PB.</li>
	<li>Bloqueie locais de ligação não específicos com 5% de NGS em 0,3% Triton/PB por 2 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Anticorpos primários diluídos: Anti-MAP2A (1:500), GFAP (1:1.000), Iba1 para microglia (1:2.000) com 5% de NGS em 0,3% Triton/PB, e incubar as seções durante a noite a 4 °C em um shaker.</li>
	<li>Lave as seções 3 x 5 min com 0,3% Triton/PB, e adicione anticorpos secundários (Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488, 1:500, ou Goat Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488, 1:500) em 5% NGS/PB por 2h em temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave 3 x 5 min com PB e incuba as seções em 1 μg/mL de DAPI por 10 minutos à temperatura ambiente. Lave as seções 3 x 5 min com PB.</li>
	<li>Monte as seções em um slide adesivo limpo(Tabela de Materiais)com uma escova de tinta fina sob um microscópio leve.</li>
	<li>Molhe a tampa com meio de montagem. Cura durante a noite no escuro à temperatura ambiente.</li>
	<li>Imagem sob um microscópio confocal com os respectivos lasers.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Neste protocolo, mostramos a rotulagem de sEVs com corantes PKH e a visualização de sua absorção na medula espinhal. Os corantes fluorescentes lipofílicos PKH são amplamente utilizados para rotulagem de células por citometria de fluxo e microscopia fluorescente3,5,6,12,24,25. Devido à sua meia-vida relativamente longa e baixa...

Pequenas vesículas extracelulares (sEVs) são vesículas nanosized, derivadas de membrana com uma faixa de tamanho de 50-150 nm. Eles se originam de corpos multi-vesiculares (MVBs) e são liberados das células após a fusão dos MVBs com a membrana plasmática. os sEVs contêm miRNAs, mRNAs, proteínas e lipídios bioativos, e essas moléculas são transferidas entre células na forma de comunicação célula-celular. os sEVs podem ser internalizados por células receptoras por uma variedade de vias endocíticas, e esta captura de sEVs por células receptoras é mediada pelo reconhecimento de moléculas superficiais em EVs e nas células-alvo1.
os sEVs ganharam interesse devido à sua capacidade de desencadear mudanças moleculares e fenotípicas nas células aceitadoras, sua utilidade como agente terapêutico e seu potencial como portadores de moléculas de carga ou agentes farmacológicos. Devido ao seu pequeno tamanho, a imagem e o rastreamento de SEVs podem ser desafiadores, especialmente para estudos in vivo e configurações clínicas. Portanto, muitos métodos foram desenvolvidos para rotular e imagem sEVs para auxiliar sua biodistribução e rastreamento in vitro e in vivo2.
A técnica mais comum para estudar a biodistribução sEV e as interações celulares-alvo envolve rotulá-las com moléculas de corante fluorescente3,4,5,6,7. Os EVs foram inicialmente rotulados com corantes de membrana celular que eram comumente usados para células de imagem. Esses corantes fluorescentes geralmente mancham a bicamadas lipídica ou proteínas de interesse em sEVs. Vários corantes lipofílicos apresentam um forte sinal fluorescente quando incorporados ao citosol, incluindo DiR (1,1'-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine iodide), DiL (1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3'-tetramethyl indocarbocyanine perclorato), e DiD (1, 1'-dioctadecyl-3, 3,3′, 3′-tetrametiletotototo 4-clorobenzenesulfonato sal)8,9,10,11.
Outros corantes lipofílicos, como PKH67 e PKH26, têm um grupo de cabeça polar altamente fluorescente e uma longa cauda de hidrocarboneto alifático que facilmente se intercala em qualquer estrutura lipídica e leva à retenção de corantes a longo prazo e fluorescência estável12. Os corantes PKH também podem rotular EVs, o que permite o estudo de propriedades EV in vivo13. Muitos outros corantes têm sido usados para observar exosomos usando microscopia de fluorescência e citometria de fluxo, incluindo corantes de rotulagem lipídica14 e corantes permeáveis de células, como carboxyfluorescein diacetate éster succinimidyl (CFDA-SE)15,16 e acetoximilo de calceina (AM) ester17.
Estudos de crosstalk mediado pelo SEV entre diferentes células do CNS forneceram insights importantes sobre a patogênese das doenças neuroinflamatórias e neurodegenerativas18. Por exemplo, sEVs de neurônios podem espalhar peptídeos beta-amilóides e proteínas tau fosforiladas e ajudar na patogênese da doença de Alzheimer19. Além disso, os EVs derivados de eritrócitos contêm grandes quantidades de alfa-sinucleína e podem atravessar a barreira hemenceroencefálica e contribuir para a patologia de Parkinson20. A capacidade dos SEVs de atravessar barreiras fisiológicas21 e transferir suas biomoléculas para células-alvo torna-as ferramentas convenientes para fornecer medicamentos terapêuticos ao CNS22.
O visualização da absorção do SEV por inúmeras células CNS na medula espinhal permitirá tanto estudos mecanicistas quanto a avaliação dos benefícios terapêuticos de SEVs exogenoumente administrados de várias fontes celulares. Este artigo descreve a metodologia de rotular sEVs derivados de macrófagos e imaginar sua absorção in vitro e in vivo na medula espinhal lombar por neurônios, microglia e astrócitos para confirmar qualitativamente a entrega do SEV por visualização.

<table><tbody><tr><td>Filtros centrífugos Amicon Ultra 0.5 mL</td><td>Anticorpo Anti-Alix MilliporeSigma</td><td>Z677094</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>ab186429</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-Calnexina</td><td>Abcam</td><td>Ab10286</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anti-CD81 Santa</td><td>Cruz Biotechnology</td><td>sc-166029</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH Anticorpo Monoclonal (14C10)</td><td>Sinalização Celular Technology</td><td>2118</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAB360</td><td>1:500 para IF; 1:1000 para IHC</td></tr><tr><td>Anti-Iba1 Antibody</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Anti-MAP2A</td><td>Antibody Sigma-Aldrich</td><td>MAB378</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer, 40 &mu; m</td><td>VWR</td><td>15-1040-1</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>3118-0050</td><td>12,000 x g</td></tr><tr><td>Lamínula, 12-mm, #1.5</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>72230-01</td><td></td></tr><tr><td>Lamínula, 18-mm, #1.5</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>72222-01</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>1 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Ensaio de Proteína DC</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonuclease I (DNAse I)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D4513-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Burro Anti-Coelho IgG H& L (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab16284</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>Burro Anti-Coelho IgG H& L, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio Duplo Fosco, #1</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>DPBS sem Cálcio e Magnésio</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino Depletado por Exossomo</td><td>Gibco</td><td>A27208-01</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>FluorChem M sistema de imagem</td><td>ProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV3000 Microscópio Confocal</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabra Anti-Rato IgG H& L (HRP)</td> <td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>cabra anti-rato IgG H & L, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-21125</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>VWR</td><td>02-0121</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>HRP Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34094</td><td></td></tr><tr><td>Buffer de bloqueio de interceptação, TBS</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-60001</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli SDS Tampão de Amostra</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ61337AC</td><td></td></tr><tr><td>Micro Vidro de Cobertura, #1</td><td>VWR</td><td>48404-454</td><td></td></tr><tr><td>Microm HM550</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300 system</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NTA 3.2 software</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linha celular Neuro-2a</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr>Laboratório de vetor<td>de soro de cabra normal</td><td>S-1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O.C.T Composto</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>NC9597281</td><td></td></tr><tr>Ciências de <td>Microscopia Eletrônica</td><td>de Paraformaldeído</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26-1KT</td><td></td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de protease Coquetel</td><td>Thermo Scientific</td><td>1862209</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de transferência de PVDF</td><td>MDI</td><td>SVFX8302XXXX101</td><td></td></tr><tr><td>RAW 267.4 Linha celular</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>AMRESCO</td><td>0241-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Gold Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>15-188-48</td><td>lâminas adesivas</td></tr><tr><td>T-75 Frascos</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai 12 Microscópio Eletrônico de Transmissão Digital</td><td>FEI Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Grids</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>FSF300-</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine Protein Gel, 12%</td> <td>Invitrogen</td><td>XP00120BOX</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine SDS Running Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>LC26755</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine Transfer Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605028</td><td>enzima</td></tr> <tr>de dissociação celular<td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327371000</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, 0,25%</td> <td>Corning</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td> Tubos de Ultracentrífuga <td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>110.000 x g</td></tr></tbody></table>

absorção de vesículos extracelulares fluorescentes em vitro e na medula espinhal

Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord

Pequenas vesículas extracelulares (sEVs) são vesículas de 50-150 nm secretadas por todas as células e presentes em fluidos corporais. os sEVs transferem biomoléculas como RNA, proteínas e lipídios de doadores para células aceitadoras, tornando-os os principais mediadores de sinalização entre as células. No sistema nervoso central (SNC), os SEVs podem mediar a sinalização intercelular, incluindo interações neuroimunes. As funções sEV podem ser estudadas rastreando a absorção de sEVs rotulados em células receptoras tanto in vitro quanto in vivo. Este artigo descreve a rotulagem de sEVs da mídia condicionada de células macrófagos RAW 264.7 usando um corante de membrana PKH. Mostra a absorção de diferentes concentrações de SEVs rotulados em vários pontos de tempo por células Neuro-2a e astrócitos primários in vitro. Também é mostrada a absorção de sEVs entregues intrathecally em neurônios da medula espinhal do camundongo, astrócitos e microglia visualizados por microscopia confocal. Os resultados representativos demonstram variação dependente do tempo na absorção de SEVs por diferentes células, o que pode ajudar a confirmar a entrega bem-sucedida de SEVs na medula espinhal.

Após o isolamento dos SEVs da mídia RAW 264.7 condicionada via centrifugação, a NTA foi utilizada para determinar a concentração e distribuição de tamanho dos sEVs purificados. O tamanho médio médio dos SEVs DERIVADOS RAW 264,7 foi de 140 nm, e o tamanho da partícula máxima foi de 121,8 nm, confirmando que a maioria das partículas detectáveis na medição de dispersão de luz caiu dentro da faixa de tamanho de exossomos ou sEVs a 50-150 nm(Figura 1A). Conforme sugerido nas informações mínimas p...

Descrevemos um protocolo para rotular pequenas vesículas extracelulares derivadas do macrófago com corantes PKH e observar sua absorção in vitro e na medula espinhal após a entrega intratecal.

Absorção de Vesículos Extracelulares Fluorescentes Em Vitro e na Medula Espinhal

Small extracellular vesicles (sEVs) are 50-150 nm vesicles secreted by all cells and present in bodily fluids. sEVs transfer biomolecules such as RNA, ...

Visualizar a absorção de pequenas vesículas extracelulares, também conhecidas como sEVs, por diferentes células da medula espinhal, pode confirmar uma entrega bem sucedida de sEVs. Isso permite tanto estudos mecanicistas quanto terapêuticos de SEVs administrados intratecally de várias fontes em modelos de roden. Este protocolo pode ser usado para visualizar a absorção de sEVs por células em uma medula espinhal leve, e pode ajudar a avaliar o papel dos SEVs e suas moléculas de carga em distúrbios da coluna vertebral, dor e inflamação.Este procedimento será demonstrado por mim, juntamente com Xuan Luo a nd Zhucheng Lin, os dois estudantes de pós-graduação no laboratório da Dra. Comece colocando deslizamentos de cobertura de 18 milímetros na placa de 12 poços, em seguida, plaque células neuro-2a em cada poço com um total de 1 mililitro de DMEM completo contendo 10% FBS e estreptococos de 1% de caneta. Quando a fluência de contagem de células atingiu 80 a 90% mude o meio exososome médio para DMEM esgotado em cada poço adicione um, 5 ou 10 microgramas de sEVs rotulados.Por 1, 4 e 24 horas. Para a dose e o tempo dependente de absorção para o resto dos poços em um volume igual de controle

uptake-fluorescent-labeled-small-extracellular-vesicles-vitro-spinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós descrevemos uma técnica simples e de baixo custo para a introdução de elevada concentração de corantes fluorescentes e de cálcio sensíveis em neurónios ou qualquer tracto neuronal, utilizando uma pipeta de sucção de polietileno.

Carregando retrógrado de Nervos, folhetos, e raízes nervosas com corantes fluorescentes

Neste vídeo, demonstramos um ensaio para visualizar e quantificar a captação celular de vesículas extracelulares ou EVs. Este ensaio utiliza imagens fluorescentes 3D usando um microscópio confocal e permite distinguir EVs internalizados daqueles aderidos à superfície celular.

Ensaio de captação de vesículas extracelulares: um método para visualizar e quantificar a captação celular de vesículas extracelulares usando a técnica de imagem de fluorescência 3D

Este vídeo demonstra como as vesículas neuronais são marcadas com proteínas fluorescentes específicas para visualizar seu movimento. Primeiro, um plasmídeo que codifica uma proteína fluorescente é incubado com um agente de transfecção e, em seguida, introduzido em uma cultura de neurônios. Posteriormente, imagens dos neurônios são adquiridas e analisadas para rastrear o movimento das vesículas.

Visualização da Motilidade da Vesícula em Neurônios Usando Imagem de Fluorescência

Uma nova ex vivo preparação para a imagem latente o mouse medula espinhal. Este protocolo permite a dois fotões imagiologia de interacções celulares vivos ao longo da medula espinal.

Dois fótons de imagem da Cellular Dynamics na Medula Espinhal Rato

Endocitose da vesícula sináptica é detectada pela microscopia de luz de pHluorin fundido com proteínas de vesículas sinápticas e por microscopia eletrônica de absorção da vesícula.

Medindo a endocitose da vesícula sináptica nos neurônios Hippocampal culturas

Neste trabalho, descrevemos os protocolos para investigar o papel das vesículas extracelulares (EVs), lançado pelo Plasmodium falciparum infectado hemácias. Em particular, enfocamos as interações de EVs com células endoteliais.

Avaliação da função de vesículas extracelulares durante a infecção da malária

Aqui, apresentamos um protocolo para rotular vesículas extracelulares derivadas de plaquetas para monitorar sua migração e absorção em explanações de cartilagem usadas como modelo de osteoartrite.

Rotulagem de vesículas extracelulares para monitoramento de migração e absorção em Explants de cartilagem

Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

Vesículos extracelulares (EVs) contribuem para a biologia celular e comunicações intercelulares. Há necessidade de ensaios práticos para visualizar e quantificar a absorção de EVs pelas células. O protocolo atual propõe o ensaio de absorção de EV utilizando imagens de fluorescência tridimensional através de microscopia confocal, após o isolamento do EV por um dispositivo microfluido baseado em nanofilição.

Ensaio de absorção de vesícula extracelular via análise de imagens de microscópio confocal

Este vídeo demonstra um método para dissecar e cultura de neurônios comissurais E13 rato medula espinhal dorsal. Dissociada neurônios comissurais são úteis para estudar os mecanismos celulares e moleculares do crescimento do axônio e orientação.

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Aprenda a marcar vesículas extracelulares pequenas com corantes PKH e rastrear sua absorção in vitro e na medula espinhal. Este protocolo auxilia no estudo de dor e inflamação.

Absorção de Vesículos Extracelulares Fluorescentes Em Vitro e na Medula Espinhal

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