Name: Propagazione di cellule e organi dentali e respiratori in microgravità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Scopri la coltura 3D di cellule ameloblast-like in microgravità per studiare la biologia dello smalto dentale. Questo metodo innovativo mantiene la morfologia polarizzata e l'espressione proteica specifica.

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Gli studi sono stati generosamente sostenuti da sovvenzioni del National Institute of Dental and Craniofacial Research (UG3-DE028869 e R01-DE027930).

È stata ottenuta tutta l'approvazione istituzionale necessaria per garantire che lo studio fosse conforme alle linee guida istituzionali per la cura degli animali TAMU.
1. Assemblaggio e sterilizzazione del bioreattore
<ol><li>Sterilizzare quattro recipienti ad alto rapporto d'aspetto (HARV) per il bioreattore in autoclave sul ciclo dello strumento in plastica per 20 minuti a 121 °C come raccomandato dal produttore.</li>
	<li>Dopo la sterilizzazione, assemblare i vasi in una cappa di coltura cellulare stringendo le viti fornite con il bioreattore dopo di che i vasi sono pronti per l'uso.</li>
</ol>2. Scaffold utilizzati per l'esperimento di co-coltura di bioreattori
<ol><li>Incubare gli scaffold insieme alle cellule per fornire supporto per l'attaccamento cellulare necessario per un'ulteriore crescita.</li>
	<li>Scegli tra scaffold a base di PGA, scaffold di idrossiapatite, fogli di grafene, dischi di gelatina e scaffold a base di collagene per studi di co-coltura.</li>
</ol>3. Dissezione dell'ansa cervicale (CL) e preparazione di singole cellule
<ol><li>Sacrificare topi per decapitazione a seguito di arresto respiratorio per overdose di CO2 . NOTA: Tutti gli studi sugli animali sono conformi alle linee guida istituzionali TAMU per la cura degli animali.</li>
	<li>Sezionare le anse cervicali di topi postnatali (DPN) di 6 giorni seguendo una versione modificata di un protocollo23 precedentemente pubblicato. NOTA: Nel nostro studio, è inclusa la porzione distale dell'ansa cervicale non mostrata nel protocollo precedentemente pubblicato (Figura 3).<ol><li>Lavare il tessuto sezionato con PBS sterile freddo prima della digestione con collagenasi dispasi a 37 °C per 30 minuti.</li>
	</ol></li>
	<li>Passare la soluzione attraverso un filtro a cellule sterili da 70 μm e centrifugare ulteriormente a 800 x g per 10 minuti.</li>
	<li>Scartare il surnatante. Centrifugare il pellet e lavare due volte con PBS freddo a 800 x g. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Contare le cellule usando un emocitometro e aggiungere 1 X 105 cellule per nave.</li>
</ol>4. Coltura cellulare della polpa dentale ed espansione della linea cellulare
<ol><li>Cellule di polpa dentale su piastra in una piastra di coltura tissutale da 100 mm al passaggio 4 ad una concentrazione di 1 x 105.</li>
	<li>Preparare i terreni per la coltura costituiti da DMEM ad alto contenuto di glucosio, integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di antibiotici / antimicotici (P / S).</li>
	<li>Quando le celle raggiungono l'85-90% di confluenza, aspirare il mezzo e lavare le piastre due volte con PBS preriscaldato.</li>
	<li>Dopo il lavaggio con PBS, aggiungere una soluzione di tripsina-EDTA preriscaldata allo 0,25% alla piastra e incubare le piastre contenenti cellulosa dentale a 37 °C per 3 minuti.</li>
	<li>Confermare il distacco della cellula mediante ispezione visiva utilizzando un microscopio.</li>
	<li>Raccogliere il mezzo insieme alle cellule dalla piastra di coltura e trasferirli tramite una pipetta da 25 mL a un tubo conico sterile da 50 ml.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 800 x g per 8 minuti ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in mezzi freschi e contare utilizzando un emocitometro.</li>
	<li>Per la co-coltura con cellule dell'ansa cervicale, seminare le cellule della polpa dentale nel bioreattore ad una concentrazione di 1 x 104 per vaso.</li>
</ol>5. Co-coltura di cellule dell'ansa cervicale/polpa dentale su un'impalcatura all'interno del bioreattore RCCS
<ol><li>Aggiungere entrambi i tipi di cellule, l'ansa cervicale e la polpa dentale al terreno di coltura contenente terreni SFM di cheratinociti con fattori di crescita integrati, proteine della matrice extracellulare e scaffold . NOTA: I fattori di crescita vengono aggiunti ad una concentrazione di 0,03 μg/mL di proteina morfogenetica ossea 2 (BMP 2), 0,03 μg/mL di proteina morfogenetica ossea 4 (BMP-4), 10 ng/mL di fattore di crescita dei fibroblasti umani ricombinanti (hFGF) e 15 ng/mL di fattore di crescita epidermico (hEGF), mentre i componenti della ECM includevano 200 μg/mL Matrigel, 5 μg/mL di laminina e 5 μg/mL di fibronectina.</li>
	<li>Scaffold rivestiti con una miscela di 500 μL di gel di collagene arricchita con 1 mg di peptide LRAP (peptide di amelogenina ricco di leucina), 1 mg di matrice di smalto liofilizzata allo stadio iniziale preparata da denti suini24, 5 μg/mL di laminina e 5 μg/ml di fibronectina. NOTA: questo ha funzionato meglio per i nostri esperimenti.</li>
	<li>Dopo il rivestimento dello scaffold, aggiungere entrambe le celle e lo scaffold al bioreattore e riempire il bioreattore con 10 mL di terreno per serbatoio.</li>
	<li>Chiudere il tappo della porta di riempimento del contenitore del bioreattore dopo l'aggiunta di media, celle e impalcature.</li>
	<li>Collegare le valvole sterili alle porte della siringa all'inizio dell'esperimento e tenerle in posizione con un coperchio fino alla fine dell'esperimento.</li>
	<li>Una volta che il recipiente è pieno al 90% e i tappi delle porte di riempimento sono chiusi e serrati, aprire le valvole sterili.</li>
	<li>Utilizzare due siringhe sterili (3 ml) ogni volta che è necessario un cambio di supporto. Riempire una siringa con mezzo fresco mentre l'altra siringa viene lasciata vuota.</li>
	<li>Aprire entrambe le valvole della siringa e manovrare delicatamente le bolle verso la porta vuota della siringa.</li>
	<li>Una volta che il mezzo fresco della siringa piena viene accuratamente iniettato nel recipiente, rimuovere le bolle attraverso la porta vuota della siringa. NOTA: Questa procedura viene eseguita fino a quando tutte le microbolle vengono rimosse dai vasi.</li>
	<li>Chiudere le porte delle siringhe con i tappi e gettare le siringhe in un contenitore per rifiuti taglienti.</li>
	<li>Collegare ciascun recipiente alla base del rotatore e posizionare la base del rotatore in un'incubatrice con una temperatura di CO2 al 5% e 37 °C.</li>
	<li>Accendere l'alimentazione e impostare la velocità di rotazione su 10,1 giri/min. NOTA: regolare la velocità per assicurarsi che i ponteggi siano in sospensione senza toccare la parete del serbatoio.</li>
	<li>Per il cambio dei media, posizionare i vasi in posizione verticale per garantire che le cellule si depositino sul fondo. Aprire le porte delle siringhe e collegare le siringhe sterili alle porte.</li>
	<li>Seguire la stessa procedura aspirando il 75% del terreno impoverito di nutrizione e iniettando terreno fresco attraverso l'altra porta.</li>
</ol>6. Preparazione di organi polmonari e coltura basata su bioreattori
NOTA: E15 cuccioli di topo selvatico sono stati utilizzati per la preparazione di organi polmonari.
<ol><li>Sezionare il tessuto polmonare dopo l'eutanasia di un topo femmina gravido con asfissia da CO2 .<ol><li>Una volta confermata la morte a seguito di asfissia da lussazione cervicale, utilizzare un bisturi per esporre la cavità toracica. Successivamente, rimuovere i cuccioli dall'utero e eutanasia per decapitazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Dopo l'eutanasia, preparare la cavità toracica aprendola con un bisturi per localizzare i polmoni. Lavare piccoli segmenti di tessuto polmonare con PBS sterile e posizionarlo su una membrana pre-sterilizzata per 2 ore con terreno di coltura di organi in un'incubatrice contenente il 5% di CO2 e 37 °C di temperatura.</li>
	<li>Una volta che i tessuti polmonari si attaccano alla membrana in una piastra di coltura di organi 2D, trasferire i campioni al contenitore del bioreattore.</li>
	<li>Preparare i media alla cultura. NOTA: Il mezzo di controllo DMEM ad alto contenuto di glucosio contiene il 10% di siero bovino fetale (FBS), l'1% di soluzione antibiotica (P / S) (penicillina, 100 U / mL, streptomicina, 50 μg / mL) e 100 μg / mL di acido ascorbico (AA) e per l'induzione di condizioni infiammatorie, il mezzo di controllo è integrato con 5 ng / mL di proteina IL-6.</li>
	<li>Effettuare l'esperimento di coltura polmonare per 10 giorni con un cambio di terreno ogni 48 ore nel bioreattore come descritto sopra.</li>
</ol>7. Scaffold rivestito con coltura cellulare del legamento parodontale umano (hPDL)
<ol><li>Colture di cellule legamentose parodontali umane. NOTA: Le cellule sono isolate e coltivate nel nostro laboratorio secondo il protocollo precedentemente pubblicato25.</li>
	<li>Rivestire i dischi di scaffold di collagene con 30 μL di PBS per il gruppo di controllo e il neuropeptide galanina (GAL) ad una concentrazione di 10-8 durante la notte.</li>
	<li>Seminare cellule PDL umane sul controllo e impalcatura rivestita di GAL per 2 ore a 37 °C in una piastra di coltura e trasferire gli scaffold seminati dalle cellule in un contenitore di bioreattore come menzionato sopra.</li>
	<li>Coltura degli scaffold seminati dalla cellula per 14 giorni nel bioreattore prima di raccogliere gli scaffold per l'analisi.</li>
</ol>8. Pulizia e manutenzione del bioreattore
<ol><li>Dopo che gli scaffold / le cellule sono stati raccolti dal bioreattore, rimuovere le porte della siringa dal serbatoio. NOTA: Le viti attorno ai recipienti vengono tolte e il recipiente viene lavato delicatamente con acqua saponata.</li>
	<li>Risciacquare i vasi con acqua pulita e stringere ancora una volta le viti.</li>
	<li>Conservare i recipienti dopo l'autoclave fino al successivo utilizzo.</li>
</ol>

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<li>Del Moral, P. M., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explant+culture+of+mouse+embryonic+whole+lung%2C+isolated+epithelium%2C+or+mesenchyme+under+chemically+defined+conditions+as+a+system+to+evaluate+the+molecular+mechanism+of+branching+morphogenesis+and+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Explant culture of mouse embryonic whole lung, isolated epithelium, or mesenchyme under chemically defined conditions as a system to evaluate the molecular mechanism of branching morphogenesis and cellular differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 71-79 (2010).</li>
<li>Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+epithelial+cell+lines+in+coculture+with+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells%3A+development+of+an+alveolo-capillary+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro.</a> Laboratory Investigation. 84 (6), 736-752 (2004).</li>
<li>Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+coculture+models+for+studying+infectious+diseases%3A+benefits+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnolog%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnolog. 2011, 852419(2011).</li>
<li>Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+co-culture+of+epithelial+cells+and+smooth+muscle+cells+on+aligned+nanofibrous+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+and+Engineering%3A+C%22%5BJournal%5D)">In vitro co-culture of epithelial cells and smooth muscle cells on aligned nanofibrous scaffolds.</a> Materials Science and Engineering: C. 81, 191-205 (2017).</li>
<li>Navran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+low+shear+modeled+microgravity+to+3-D+cell+biology+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Annual+Review%22%5BJournal%5D)">The application of low shear modeled microgravity to 3-D cell biology and tissue engineering.</a> Biotechnology Annual Review. 14, 275-296 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

I passaggi critici del protocollo per la crescita delle cellule in microgravità includono il bioreattore, lo scaffold, le cellule utilizzate per la coltura 3D e il rivestimento dello scaffold come mezzo per indurre la differenziazione cellulare. Il tipo di bioreattore utilizzato nei nostri studi comprende il bioreattore RCCS-4, una recente modifica dell'originale dispositivo di coltura cilindrica rotante del sistema di coltura cellulare rotante (RCCS) sviluppato dalla NASA per far crescere cellule in microgravità simulat...

La gravità influenza tutti gli aspetti della vita sulla Terra, compresa la biologia delle singole cellule e la loro funzione all'interno degli organismi. Le cellule percepiscono la gravità attraverso i meccanorecettori e rispondono ai cambiamenti di gravità riconfigurando le architetture citoscheletriche e alterando la divisione cellulare 1,2,3. Altri effetti della microgravità includono la pressione idrostatica nelle vescicole piene di liquido, la sedimentazione degli organelli e la convezione guidata dalla galleggiabilità del flusso e del calore4. Gli studi sull'effetto della perdita di gravità sulle cellule e sugli organi umani sono stati originariamente condotti per simulare l'ambiente senza peso dello spazio sugli astronauti durante le missioni di volo spaziale5. Tuttavia, negli ultimi anni, queste tecnologie di bioreattori 3D originariamente sviluppate dalla NASA per simulare la microgravità stanno diventando sempre più rilevanti come nuovi approcci per la coltura di popolazioni cellulari che altrimenti non sarebbero suscettibili di sistemi di coltura 2D.
I bioreattori 3D simulano la microgravità facendo crescere cellule in sospensione e creando così un costante effetto di "caduta libera". Altri vantaggi dei bioreattori rotanti includono la mancanza di esposizione all'aria riscontrata nei sistemi di coltura degli organi, una riduzione dello stress di taglio e della turbolenza e una continua esposizione a un cambiamento dell'apporto di sostanze nutritive. Queste condizioni dinamiche fornite da un bioreattore Rotary Cell Culture System (RCCS) favoriscono la co-localizzazione spaziale e l'assemblaggio tridimensionale di singole cellule in aggregati 6,7.
Studi precedenti hanno dimostrato i vantaggi di un bioreattore rotativo per la rigenerazione ossea8, la coltura di germi dentali9 e per la coltura di cellule follicolari dentali umane10. C'è stato anche un rapporto che suggerisce che RCCS migliora la proliferazione delle cellule EOE e la differenziazione in ameloblasti11. Tuttavia, le cellule differenziate sono state considerate ameloblasti sulla base dell'immunofluorescenza dell'ameloblastina e/o dell'espressione di amelogenina da sola11 senza considerare la loro morfologia allungata o la forma cellulare polarizzata.
Oltre al bioreattore RWV (rotating wall vessels) sviluppato dalla NASA, altre tecnologie per generare aggregati 3D dalle cellule includono la levitazione magnetica, la macchina di posizionamento casuale (RPM) e il clinostato12. Per ottenere la levitazione magnetica, le cellule marcate con nanoparticelle magnetiche vengono levitate utilizzando una forza magnetica esterna, con conseguente formazione di strutture 3D prive di impalcature che sono state utilizzate per la biofabbricazione di strutture adipocitarie13,14,15. Un altro approccio per simulare la microgravità è la generazione di forze G multidirezionali controllando la rotazione simultanea su due assi con conseguente cancellazione del vettore di gravità cumulativo al centro di un dispositivo chiamato clinostat16. Quando le cellule staminali del midollo osseo sono state coltivate in un clinostat, la formazione di nuovo osso è stata inibita attraverso la soppressione della differenziazione degli osteoblasti, illustrando uno degli effetti dedifferenzianti della microgravità16.
I sistemi in vitro per facilitare la coltura fedele degli ameloblasti fornirebbero un importante passo avanti verso l'ingegneria dei tessuti dello smalto dei denti17. Sfortunatamente, fino ad oggi, la cultura degli ameloblasti è stata un'impresa impegnativa18,19. Finora, sono state descritte cinque diverse linee cellulari simili agli ameloblasti, tra cui la linea cellulare di ameloblasti di topo (ALC), la linea cellulare epiteliale dentale del ratto (HAT-7), la linea cellulare LS8 del topo20, la linea cellulare PABSo-E suina 21 e la linea cellulare SF2-24 del ratto22. Tuttavia, la maggior parte di queste cellule ha perso la loro caratteristica forma cellulare polarizzata nella coltura 2D.
Nel presente studio ci siamo rivolti a un sistema di bioreattore di coltura cellulare rotante (RCCS) per facilitare la crescita di cellule simili agli ameloblasti da epiteli dell'ansa cervicale co-coltivati con progenitori mesenchimali e per superare le sfide dei sistemi di coltura 2D, tra cui il ridotto flusso di nutrienti e i cambiamenti citoscheletrici dovuti alla gravità. Inoltre, l'RCCS ha fornito nuove strade per lo studio delle interazioni cellula/scaffold relative all'ingegneria del tessuto parodontale e per esaminare gli effetti dei mediatori infiammatori sui tessuti alveolari polmonari in vitro. Insieme, i risultati di questi studi evidenziano i benefici dei sistemi di coltura rotativa basati sulla microgravità per la propagazione di epiteli differenziati e per la valutazione degli effetti ambientali sulle cellule coltivate in vitro, comprese le interazioni cellula/scaffold e la risposta tissutale alle condizioni infiammatorie.

<table><tbody><tr><td>Antibiotico-antimicotico</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>BGJb Fitton-Jackson Mezzi di modifica</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td>12591</td><td></td></tr><tr><td>BIOST Ponteggio PGA</td><td>Synthecon</td><td>Custom</td><td>Disponibile presso l'azienda tramite un ordine personalizzato</td></tr><tr><td>BMP-2</td><td>R& D Systems</td><td>355-BM</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R& D Systems</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6429-500mL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>Fibricol</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5133-20mL</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Corning</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Galanin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G-0278</td><td></td></tr><tr><td>Disco di gelatina</td><td>Advanced Fogli di</td> grafene Biomatrix <td>CytoForm 500</td><td></td></tr> Advanced <tr><td></td><td>Biomatrix</td><td>CytoForm 300</td><td></td></tr><tr><td>hEGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>hFGF</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td>AA1-155</td><td></td></tr><tr><td>Disco di idrossiapatite</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>CytoForm 200</td><td></td></tr><tr><td>Il-6 proteina</td><td>PeproTech</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>Cheratinociti SFM media (1X)</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td>17005042</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Corning</td><td>354259</td><td></td></tr><tr><td>LRAP peptide</td><td>Peptide 2.0 Sequenza</td><td>personalizzata: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Millipore Membrana in nitrocellulosa</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td></td>AABP04700</tr><tr><td>RCCS Bioreattore</td><td>Synthecon</td><td>RCCS 4HD</td><td></td></tr><tr><td>SpongeCol</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5135-25EA</td><td></td></tr><tr><td>Valvola di sicurezza rubinetto unidirezionale con luer lock maschio girevole</td><td>Smiths Medical</td><td>MX5-61L</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe con ago 3cc</td><td>McKESSON</td><td>16-SN3C211</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA (0,25%)</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td></td><td></td>25200056</tr></tbody></table>

propagazione di cellule e organi dentali e respiratori in microgravità

Propagation of Dental and Respiratory Cells and Organs in Microgravity

La gravità è uno dei determinanti chiave della funzione delle cellule umane, della proliferazione, dell'architettura citoscheletrica e dell'orientamento. I sistemi di bioreattori rotanti (RCCS) imitano la perdita di gravità che si verifica nello spazio e forniscono invece un ambiente di microgravità attraverso la rotazione continua di cellule o tessuti in coltura. Questi RCCS assicurano un apporto ininterrotto di nutrienti, fattori di crescita e trascrizione e ossigeno e affrontano alcune delle carenze delle forze gravitazionali in piatti immobili di coltura cellulare o di organi 2D (bidimensionali). Nel presente studio abbiamo utilizzato RCCS per co-coltivare cellule dell'ansa cervicale e cellule della polpa dentale per diventare ameloblasti, per caratterizzare le interazioni progenitore/scaffold parodontale e per determinare l'effetto dell'infiammazione sugli alveoli polmonari. Gli ambienti RCCS hanno facilitato la crescita di cellule simili agli ameloblasti, promosso la proliferazione dei progenitori parodontali in risposta ai rivestimenti dell'impalcatura e hanno permesso una valutazione degli effetti dei cambiamenti infiammatori sugli alveoli polmonari coltivati. Questo manoscritto riassume le condizioni ambientali, i materiali e le fasi lungo il percorso ed evidenzia aspetti critici e dettagli sperimentali. In conclusione, gli RCCS sono strumenti innovativi per padroneggiare la coltura e la crescita 3D (tridimensionale) di cellule in vitro e per consentire lo studio di sistemi cellulari o interazioni non suscettibili di classici ambienti di coltura 2D.

La camera interna del bioreattore fornisce un ambiente in cui le cellule possono proliferare e differenziarsi, attaccarsi a un'impalcatura o riunirsi per formare tessuti come assemblaggi. Ogni vaso HARV contiene fino a 10 ml di terreno e facilita una circolazione costante di sostanze nutritive in modo che ogni cellula abbia un'eccellente possibilità di sopravvivere. La figura 1A illustra il fissaggio delle porte della siringa alla piastra anteriore del recipiente in cui sono fissate le valvo...

Questo protocollo presenta un metodo per la coltura e la crescita 3D di cellule simili agli ameloblasti in microgravità per mantenere la loro forma allungata e polarizzata e l'espressione proteica specifica dello smalto. Sono inoltre descritte le condizioni di coltura per la coltura dei costrutti di ingegneria parodontale e degli organi polmonari in microgravità.

Propagazione di cellule e organi dentali e respiratori in microgravità

Gravity is one of the key determinants of human cell function, proliferation, cytoskeletal architecture and orientation. Rotary bioreactor systems (RCCSs) ...

Allungato e polarizzato l'ameloblasto secernente amelogenina in coltura. Questo è anche il primo protocollo per la crescita di cellule ameloblasti in microgravità. La crescita degli ameloblasti in coltura è stata una delle maggiori sfide nel campo dello smalto.E per noi, è usare questo modello di bioreattore, è la prima volta che abbiamo realizzato questo segno distintivo nella ricerca sullo smalto. Questo modello può essere utilizzato per comprendere la biologia delle cellule ameloblastiche. Questo modello sarà dimostrato dal Dr.Mirali Pandya.Inizia posizionando il tessuto raccolto da topi postnatali di sei giorni sotto il microscopio a dissezione e le anse cervicali sezionate. Installare un bioreattore collegando le valvole sterili alle porte della siringa. Aggiungere entrambe le cellule, l'ansa cervicale e la polpa dentale, insieme allo scaffold rivestito al bioreattore e riempire il vaso del bioreattore con 10 millilitri di mezzi SFM di cheratinociti integrati con fattori di crescita e proteine della matrice extracellulare.Chiudere e stringere il tappo della porta di riempimento del contenitore del bioreattore, quindi aprire le valvole sterili. Utilizzare due siringhe sterili d

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Embrionale precoce cultura organo polmonare è un sistema molto utile per studiare le interazioni epitelio-mesenchimali. Procede morfogenesi entrambi epiteliali e mesenchimali in condizioni specifiche che possono essere facilmente manipolati in questo sistema.

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Sviluppo di un multicellulare tridimensionale Organotipica Modello della mucosa intestinale umana coltivate in microgravità

Una tecnica molto promettente per generare tessuto costruisce senza utilizzo di matrice consiste di cellule di coltura in condizioni di microgravità simulata. Utilizzando un sistema rotativo cultura, abbiamo esaminato il follicolo ovarico crescita e la maturazione degli ovociti in termini di sopravvivenza del follicolo, morfologia, crescita e funzione degli ovociti sotto la condizione di microgravità simulata.

In Vitro Crescita dei follicoli preantrali Mouse sotto condizioni di microgravità simulata

La piattaforma di NASA GeneLab fornisce accesso libero ai dati preziosi omics da esperimenti biologici spaceflight. Descriviamo come un esperimento di mouse tipico è condotta nello spazio e come possono essere consultati e analizzati i dati da tali esperimenti.

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Coltura di linfociti in microgravità simulata utilizzando un sistema di coltura cellulare rotante

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Questo protocollo delinea la generazione di organoidi da cellule epiteliali alveolari A549 e fibroblasti polmonari MRC-5 su un impalcatura idrogel a matrice extracellulare, seguita dall'inserimento in gel di collagene 3D e dall'esposizione a sforzi meccanici tramite un bioreattore di allungamento cellulare per indagare la meccanobiologia alveolare.

Generazione di organoidi alveolari A549/MRC-5 incorporati in collagene 3D utilizzando un bioreattore meccanico a stiramento cellulare

Questo protocollo descrive come costruire e gestire una piccola camera di crescita a basso costo in grado di mantenere livelli estremi di anidride carbonica (exCO2) per esperimenti vegetali. La camera consente studi riproducibili della fisiologia dei microverdi in condizioni atmosferiche rilevanti per il volo spaziale, utilizzando un sistema di monitoraggio e controllo basato su computer a scheda singola e un sistema passivo di assorbimento idroponico.

Costruzione e gestione di una camera di crescita elevata di anidride carbonica a basso costo per valutare la fisiologia dei microverdi sotto livelli diCO2 rilevanti per i voli spaziali

Scopri la coltura 3D di cellule ameloblast-like in microgravità per studiare la biologia dello smalto dentale. Questo metodo innovativo mantiene la morfologia polarizzata e l'espressione proteica specifica.

Propagazione di cellule e organi dentali e respiratori in microgravità

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