Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
مقايسات نقل طاقة الرنين Förster التي تم حلها بمرور الوقت لقياس بروتينات STAT المفسفرة الداخلية في الخلايا البشرية
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
يتم وصف بروتوكولات الفحص الخلوي القائم على خلايا نقل طاقة Förster التي تم حلها عبر الزمن من أجل التحديد الكمي البسيط والمحدد والحساس والقوي لمحول الإشارة المفسفرة الداخلي ومنشط النسخ (STAT) 1/3/4/5/6 البروتينات في محللات الخلايا بتنسيق 384 بئرا.
Transcript
توفر الفحوصات المستندة إلى TR-FRET أدوات جديدة فعالة من حيث التكلفة للفحص والتوصيف الدوائي للمعدلات المحددة والانتقائية لمسارات إشارات JAK / STAT. هذه التقنية أسهل بكثير وسريعة وقابلة للتكرار وقوية من الطرق التقليدية مثل اللطخة الغربية و ELISA. لا توجد خطوات غسيل مطلوبة ويتم إضافة الكواشف في خطوة واحدة.
يمكن تطبيق منصة المقايسة المناعية هذه بسهولة على بروتينات إشارات الخلايا الأخرى بشرط توفر أجسام مضادة محددة. لتصميم مقايسات قابلة للتكرار ، يجب عليك استخدام ممارسات زراعة الخلايا الجيدة ووضع إجراءات تشغيل قياسية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب عليك تحسين زراعة الخلايا وظروف العلاج بعناية.
ستوضح الإجراء جينيفيف شاتيل ، وهي عالمة من مختبرنا. للبدء ، استزرع خلايا HeLa و A431 في حاضنة رطبة 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون باستخدام DMEM مع استكمال 10٪ FBS. عندما تصل الخلايا إلى 70 إلى 80٪ من الالتقاء ، قم بالتربسين بها وإما مرورها أو استخدامها للمقايسات.
لإجراء الفحص ، قم بتوزيع 50 ميكرولتر من الخلايا بالكثافة المحسنة مسبقا في صفيحة معالجة بزراعة الأنسجة من 96 بئرا في وسط الثقافة المناسب ، ثم احتضنها بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، قم بإعداد سلسلة تخفيف متوسطة مزدوجة وأربعة أضعاف لمركبات الاختبار عن طريق تخفيف المركب بشكل متسلسل في وسط خال من المصل عبر 12 بئرا من صفيحة البولي بروبيلين 96 بئرا. لتحفيز الخلايا ، أضف 50 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل الذي يحتوي على جهاز المحاكاة بتركيز 2X واحتضن الخلايا للوقت الأمثل مسبقا إما في درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة.
لتثبيط الخلايا ، أضف 25 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل الذي يحتوي على المثبط بتركيز 4X واحتضن الخلايا للوقت الأمثل مسبقا إما في درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة ، ثم أضف 25 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل الذي يحتوي على المحفز بتركيز 4X واحتضنه للوقت الأمثل مسبقا. بعد ذلك ، لتحليل الخلايا ، قم بإعداد المخزن المؤقت للتحلل المكمل 1X وإضافة كوكتيل مثبط الفوسفاتيز إليه. بعد إزالة والتخلص بعناية من وسط زراعة الخلايا ، أضف على الفور 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل المكمل 1X المحضر واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت الاهتزاز مع إثارة معتدلة.
للكشف عن TR-FRET ، قم بإعداد مزيج الكشف عن الأجسام المضادة 4X في المخزن المؤقت للكشف عن 1X ، ثم قم بإعداد حلول الأجسام المضادة EUAB1 و FRAB2 ، بالإضافة إلى حلول الأجسام المضادة EUAB3 و FRAB4 في المخزن المؤقت للكشف عن 1X. وأخيرا، امزج EUAB1 المخفف مسبقا مع FRAB2 المخفف مسبقا للكشف عن بروتين الفوسفو و EUAB3 المخفف مسبقا و FRAB4 المخفف مسبقا للكشف عن البروتين الكلي. ثم قم بماصة 15 ميكرولتر من الخلية المحللة بعناية من لوحة الثقافة المكونة من 96 بئرا إلى بئر من صفيحة صغيرة بيضاء منخفضة الحجم بحجم 384 بئرا.
بعد ذلك ، أضف 15 ميكرولترا من محللات التحكم الإيجابية و 15 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل 1X كعنصر تحكم سلبي لفصل آبار الفحص. إلى الآبار التي تحتوي على 15 ميكرولتر من الليزات ، أضف خمسة ميكرولترات من مزيج الكشف عن الأجسام المضادة 4X المقابل للكشف عن بروتين الفوسفو أو البروتين الكلي. بعد تغطية اللوحة بسدادة لوحة ، احتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة بين عشية وضحاها اعتمادا على مجموعة الفحص.
بعد اكتمال الحضانة ، قم بإزالة مانع تسرب اللوحة اللاصقة وقراءة اللوحة على قارئ microplate متوافق مع TR-FRET. يتم تمثيل نتائج فحوصات TR-FRET للكشف عن الفوسفو-STAT1 وتحديده كميا مع إجمالي STAT1 و phospho-STAT4 في خلايا U266B1 جنبا إلى جنب مع phospho-STAT5 مع إجمالي STAT5 في خلايا A431 باستخدام منحنيات استجابة التركيز. وبالمثل ، يتم تمثيل اختبارات TR-FRET للكشف عن الفوسفو STAT3 وإجمالي STAT3 و phospho-STAT6 وإجمالي STAT6 وتحديده كميا باستخدام منحنيات استجابة التركيز.
وعموما، أظهرت جميع الفحوص إشارات TR-FRET قوية، ونطاقات ديناميكية واسعة، وتباين معامل منخفض بين الآبار، ونسب إشارة إلى خلفية مقبولة. وأظهرت معالجة الخلايا بمنشطات JAK والإنترفيرون ألفا-2B وIL-4 وEGF الزيادة المتوقعة المعتمدة على التركيز في فسفرة STAT في بقايا التيروزين المحددة، في حين ظلت البروتينات الكلية STAT المقابلة مستقرة. كل من مثبط JAK و erlotinib يثبطان مستويات الفوسفو ستات المقابلة بطريقة تعتمد على التركيز.
وكانت نتائج التحفيز الفوسفو-STAT4 بواسطة الإنترفيرون ألفا-2B في خط خلية معلقة أو التحفيز الفوسفو-STAT6 بواسطة IL-4 في خط خلية التصاق باستخدام بروتوكول الصفيحة الواحدة متسقة مع تلك التي تم الحصول عليها باستخدام بروتوكول الصفيحتين، مما يدل على القدرة الناجحة على التكيف مع بروتوكول نقل صفيحتين إلى بروتوكول بئر الكل في واحد من صفيحة واحدة. تظهر نتائج دراسة التباين داخل اللوحة لفحص الفوسفو-STAT1 باستخدام خط خلية معلقة وفحص الفوسفو-STAT3 باستخدام خط خلية الالتصاق متانة هذه الفحوصات الفوسفو-ستات لتطبيقات HTS. من الضروري استكمال المخزن المؤقت للتحلل بكوكتيل مثبط الفوسفاتيز لمنع إزالة الفسفرة من البروتينات المفسفرة من الفوسفاتيز النشط الموجود في مستخلص الخلية بأكملها.
Tags
الكيمياء الحيوية ، العدد 175 ، إشارات JAK / STAT ، بروتينات STAT ، الفسفرة ، الفحوصات المتجانسة ، TR-FRET ، المقايسة المناعية ، الفحص القائم على الخلايا ، Kinases ، إشارات الخلية ، الفحص عالي الإنتاجية ، إشارات السيتوكينRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
