Name: Een explantatiesysteem voor time-lapse beeldvormingsstudies van olfactorische circuitassemblage in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Leer een explantatiemethode voor time-lapse beeldvorming van olfactorische circuitassemblage in Drosophila. Dit protocol toont dissectie, cultuur en levende beeldvorming op enkel-axon niveau voor inzicht in neurale ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken N. Özel en R. Hiesinger voor hun advies over de explantcultuur; M. Wagner voor technische hulp van de twee-fotonenmicroscopie; D.J. Luginbuhl voor het genereren van transgene vliegen; D. Friedmann voor suggesties van Fiji software analyse; Y. Ge voor hulp bij vliegwerk; C. McLaughlin en K.K.L. Wong voor commentaar op het manuscript. L.L. is een onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute. Dit werk werd ondersteund door national institutes of health grants 1K99DC01883001 (aan T.L.) en R01-DC005982 (aan L.L.).

1. Bereiding van reagentia
OPMERKING: Alle stappen in dit protocol worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (20-25 °C), tenzij anders uitgelegd.
<ol><li>Om de kweekschaal klaar te maken voor het immobiliseren van de explant tijdens timelapse-beeldvorming, legt u 0,5 cm dikke Sylgard (meng twee vloeibare componenten grondig in 10: 1-verhouding vóór gebruik) op het bodemoppervlak van een petrischaal van 60 mm x 15 mm en laat u deze 48 uur uitharden bij kamertemperatuur (figuur 2A, in de volgende tekst Sylgard-plaat genoemd).</li>
	<li>Om micropennen voor te bereiden voor het immobiliseren van explant op deze plaat, gebruikt u een tang om meerdere micropennen op een tape te plakken met de scherpe uiteinden aan één kant uitgelijnd (figuur 2B). Gebruik een schaar om ~2 mm van de scherpe uiteinden van de micropennen te knippen (figuur 2B'). Gebruik een tang om de gesneden micropennen vast te houden en steek in de Sylgard-laag van een vooraf gemaakte Sylgard-plaat (figuur 2C). Twee micropennen worden gebruikt om één explant te immobiliseren.</li>
	<li>Gebruik een borstel om witte poppen te verzamelen, die binnen 1 uur puparium vormen, van hsFLP, pebbled-GAL4 / +; UAS-FRT100-stop-FRT 100-mCD8-GFP 8 genotype en breng ze over naar nieuwe injectieflacons. Hitteschok in een waterbad van 37 °C gedurende 40 minuten om schaarse ORN-klonen van willekeurige typen te induceren. Plaats de injectieflacons na een hitteschok gedurende 30 uur op 25 °C, wat resulteert in poppen die na pupariumvorming (APF) op 30 uur oud zijn.</li>
	<li>Om het kweekmedium voor explanting voor te bereiden, voegt u 5 ml Penicilline-Streptomycine (10.000 E / ml) toe aan 500 ml Drosophila Medium van Schneider. Filtreer het medium en maak 45 ml aliquots in conische buizen van 50 ml. Het medium kan 1-2 maanden bij 4 °C worden bewaard.</li>
	<li>Neem op de dag van beeldvorming één buis van 45 ml Drosophila-medium van Schneider en voeg 5 ml foetaal runderserum (10% v /v), 125 μl 4 mg / ml humane insulinevoorraadoplossing (10 μg / ml eindconcentratie), 50 μl 1 mg / ml 20-hydroxyecdysonvoorraadoplossing opgelost in ethanol (1 μg / ml eindconcentratie). Meng goed en breng 15 ml volledig medium over in een nieuwe conische buis van 50 ml. De rest van het volledige medium kan een week lang bij 4 °C worden bewaard. Foetaal runderserum, humane insulinestockoplossing en 20-hydroxyecdyson-stamoplossing worden gealiquoteerd en bewaard bij -20 °C.</li>
	<li>Oxygeneer het 15 ml volledige medium door zuurstofbellen uit een zuurstofcilinder onder het vloeistofoppervlak door een steriele pipetpunt van 5 ml te pompen met een snelheid van één bel / s gedurende 20-30 minuten. Gebruik een paraffinefilm om de opening van de buis tijdens dit proces te bedekken.</li>
	<li>Steriliseer het oppervlak van de dissectieput en de Sylgard-plaat (met micropennen op de Sylgard-laag, bereid in stappen A1 en A2) met 70% ethanol. Laat ze drogen voor gebruik.</li>
</ol>2. Ontleding van de uitplant
<ol><li>Gebruik een borstel om 30 h APF (30 h na pupariumvorming) poppen over te brengen naar een papieren zakdoekje en droog het buitenoppervlak van de poppen gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Leg een stuk dubbelzijdige tape op een glasplaat. Bevestig de gedroogde poppen voorzichtig op het kleverige oppervlak van de tape met de dorsale kant naar boven gericht. Druk voorzichtig met een borstel op de poppen om de ventrale kant van de poppen goed aan de tape te laten hechten (figuur 3A). Beschadig de pop niet.</li>
	<li>Gebruik een tang om de bruine popbehuizing te verwijderen die de dorsale kant van het hoofd bedekt (figuur 3A, B). Steek een scherpe punt van de tang tussen de bruine pop en de pop vanaf de zijkant en breek de bruine popbuis voorzichtig door een lijn naar het achterste uiteinde van de pop (figuur 3B,C). Open de bruine poppoule. Gebruik een tang om de pop voorzichtig vast te houden en breng over naar de dissectie goed met 1 ml zuurstofrijk vol medium. Dompel drijvende pop onder op het medium oppervlak om het naar de bodem van de put te laten zinken (figuur 3D). OPMERKING: Steek de tangpunt niet te diep in de bruine pop om te voorkomen dat de pop met de tang gewond raakt.</li>
	<li>Om de antenne-hersenen explant van de pop te ontleden, gebruikt u een tang om de pop voorzichtig met één hand vast te houden en gebruikt u een paar microscisors om met de andere hand een klein gaatje van de achterste kant van de pop te snijden (figuur 3E). Dit kleine gaatje laat de hoge druk in de pop los.</li>
	<li>Snijd de ventrale middellijn van de pop door van het gat tot aan de nek (de smalle structuur die het hoofd en de thorax verbindt) met de microscisors (figuur 3F). Snijd vervolgens door de omtrek van de nek om het hoofd los te maken van het lichaam van de pop (figuur 3G). Verwijder het lichaam en plaats het in een andere put. OPMERKING: Snijd de nek niet rechtstreeks van de dorsale / ventrale kant van de pop, die de hersenen kan knijpen.</li>
	<li>Snijd de transparante cuticula die de dorsale kant van de hersenen bedekt (figuur 3H). Dit zal het vetlichaam bovenop de hersenen blootleggen. Houd een nagelriem aan waaraan het netvlies en de antennes hechten. Herhaal dezelfde procedure naar de ventrale kant van de hersenen. OPMERKING: Steek het mes van de schaar niet te diep onder de nagelriem, omdat dit zal leiden tot het doorsnijden van de antennezenuwen die de antennes en de hersenen verbinden (figuur 3H').</li>
	<li>Gebruik een P10-pipet om het vetlichaam dat de hersenen en antennes bedekt voorzichtig uit te wassen door het medium naar de open gebieden aan de dorsale en ventrale zijden van het hoofd te pipetteren (figuur 3I). OPMERKING: Wees heel voorzichtig bij het pipetteren van het medium, omdat de hersenen gemakkelijk van de nagelriem kunnen worden losgemaakt. Zorg ervoor dat al het vetlichaam tijdens deze stap wordt verwijderd. De gestileerde ontwikkeling van ORN-axonen werd waargenomen wanneer het vetlichaam niet goed werd gereinigd, waarschijnlijk als gevolg van slechte zuurstoftoegang vanuit het medium.</li>
	<li>Om de interactie van bilaterale ORN-axonen of ORN-axonen met PN-dendriet-targeting te bestuderen, snijdt u een of twee antennezenuwen met de microscisors tijdens deze fase8 (figuur 3J). Plaats voorzichtig de messen van de schaar tussen de nagelriem en de hersenen en snijd geïnteresseerde antennezenuwen af.</li>
	<li>Om de ontlede explant over te brengen naar de Sylgard-plaat, plaatst u een druppel zuurstofrijk vol medium (~ 200 μL) op het Sylgard-oppervlak. Bedek het binnenoppervlak van een 200 μL brede tippipetpunt met het vetlichaam uit de ontlede stam (stap 1.6) door het vetlichaam meerdere keren te pipetteren, zodat de explantaten de pipetpunt niet kunnen plakken tijdens het overbrengen. Gebruik vervolgens deze pipetpunt met brede punt om de explant van de dissectieput over te brengen naar de medium druppel op de kweekplaat (figuur 3K).</li>
	<li>Gebruik een tang om de explant vast te pinnen op de Sylgard-laag in de twee optische lobben (figuur 3L). Plaats de Sylgard-plaat voorzichtig op het beeldvormingsstation en immobiliseer de plaat met tapes. Voeg langzaam 10 ml zuurstofrijk volledig medium toe aan de Sylgard-plaat met behulp van de P1000-pipet. OPMERKING: Verstoor de explant niet wanneer u het medium aan de Sylgard-plaat toevoegt.</li>
</ol>3. Op twee fotonenmicroscopie gebaseerde live beeldvorming
<ol><li>Om time-lapse beeldvorming uit te voeren, gebruikt u een microscoop met twee fotonen, een Ti: Sapphire-laser, een 20x wateronderdompelingsobjectief (1,0 NA) en een beeldvormingssoftware. Gebruik de excitatiegolflengte bij 920 nm voor het afbeelden van GFP-eiwitten. Pas de pixelverblijftijd aan op 10 μs.</li>
	<li>Pas de positie van het beeldvormingsstation aan zodat de explantaten ongeveer onder het doel liggen. Gebruik 70% ethanol om de lens te steriliseren voordat u een beeld afbeeldt. Verlaag langzaam het doel onder het medium dicht bij de explants. Controleer of er een bubbel op de lens van het objectief zit.<ol>
<li>Til dan het objectief boven het medium en herhaal dit totdat de bubbel weg is. Zoek de explants met behulp van het oculair en centreer één explant in het veld.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Om een explanting te garanderen met een paar ORN's die schaars zijn gelabeld voor timelapse-beeldvorming, ontleedt u elke keer ~ 10 explants en lijnt u uit op de y-as op de kweekplaat. Scherm alle explantaties door het objectief langs de y-as te bewegen en kies een explant waarbij enkele enkele ORN-axonen net de antennekwab hebben bereikt voor beeldvorming (figuur 4A).<ol>
<li>Herken de antennekwab aan zijn ovale vorm en de ORN-axonen die eromheen beginnen te cirkelen. Stel een gebied van ~150 μm x 150 μm in het xy-vlak in (3x zoom met het 20x objectief). Schat de grens van de twee antennelobben en centreer ze in het beeldvormingsgebied.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecteer een eerste beeldgebied langs de z-as door het onderste gedeelte en het bovenste gedeelte van het scannen te definiëren. Stel het beeldgebied in langs de z-as. Stel het diepste gedeelte in met ORN axonsignalen als de eerste beeldvormingssessie en de sessie 100 μm hierboven (meer oppervlakkige kant) als de laatste beeldvormingssessie (figuur 4B). OPMERKING: Dit laat sommige secties aan de bovenkant (oppervlakkige kant) van de ORN-axonen en voorkomt verschuiving van ORN-axonen naar boven buiten het beeldvormingsgebied als gevolg van de groei van de hersenen tijdens de kweek.<ol>
<li>Beeld met intervallen van 2 μm. Stel automatische beeldscanning in op de frequentie van elke 20 minuten met behulp van beeldbewerkingssoftware.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verschuif het beeldvormingsgebied 20 μm omhoog langs de z-as na de eerste 4 uur-beeldvorming en nog eens 20 μm omhoog langs de z-as na 16 uur beeldvorming. Dit kan worden bereikt door een script en verschillende z-stacks in de imaging-software in te stellen.</li>
	<li>Kweek de explant gedurende een extra periode na beeldvorming (tot 24 uur ex vivo) vóór fixatie en kleuring met N-cadherine, een neuropilmarker, om de genetische identiteit van elke afzonderlijke ORN te onthullen door de glomerulus waarop het zich richt.</li>
</ol>4. Beeldverwerking
<ol><li>Om z-stackafbeeldingen uit sectiereeksen te verwerken die op elk tijdstip zijn genomen met behulp van de Fiji-software, opent u de afbeeldingssectieserie, klikt u op Afbeelding | Stapels | Z-project [/].</li>
	<li>Om laterale drift van het monster tijdens het kweken te corrigeren, installeert u TurboReg Plugin in Fiji.<ol>
<li>Open een z-stapelafbeeldingsreeks en een enkele z-stapelafbeelding uit de reeks. Plug-ins | openen Registratie | TurboReg.</li>
		<li>Selecteer de reeks z-stackafbeeldingen in Bron en de enkele z-stackafbeelding in Doel| Vertaling. Klik op de batchknop om alle afbeeldingen uit de geopende z stack-afbeeldingsreeks te registreren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Om het nut van afbeeldingsvoorbeelden te maximaliseren, scheidt u schaars gelabelde enkele axonen in de buurt van elkaar van de z-stapelafbeeldingen na 3D-afbeeldingssecties.<ol>
<li>Om enkele ORN-axonen uit een paar axonen in dezelfde afbeelding te extraheren, opent u de afbeeldingssectiereeks, klikt u op Plug-ins | Segmentatie | Segmentatie-editor [/]. Selecteer het penseelgereedschap en maskeer geïnteresseerd ORN axon in het werkvenster van de segmentatie-editor met de knoppen "+" of "-" selecteren in elke afbeeldingssectie.</li>
		<li>Klik op proces| Beeldcalculator [/]. Selecteer "Afbeelding X" in Afbeelding 1, "Vermenigvuldigen" in Werking, "Afbeelding X. labels" in Afbeelding 2, [/]. Dit genereert een nieuw afbeeldingsreeksbestand met alleen het geïnteresseerde axon. Voer stap 4.1 uit om de z-stackafbeelding te verwerken. Herhaal deze stap voor alle tijdspunten om een tijdreeksafbeeldingsbestand te genereren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Als u verschillende axonen uit dezelfde afbeelding pseudokleur wilt maken, voert u eerst stap 4.3 uit om het tijdreeksafbeeldingsbestand van elk axon afzonderlijk te genereren. Open de tijdreeksafbeeldingsbestanden voor verschillende afzonderlijke axonen uit dezelfde onbewerkte gegevensafbeelding. Klik op Afbeelding | Kleur | Kanalen samenvoegen. Selecteer verschillende tijdreeksafbeeldingsbestanden in verschillende kleurkanalen en klik op OK.</li>
</ol>

<ol><li>Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+molecules+of+neuronal+wiring%3A+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727(2011).</li>
<li>Vosshall, L. B., Stocker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+smell+and+taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of smell and taste in Drosophila.</a> Annual Review Neuroscience. 30, 505-533 (2007).</li>
<li>Hong, W., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+wiring+specificity+in+the+fly+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system.</a> Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).</li>
<li>Bentley, D., Caudy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioneer+axons+lose+directed+growth+after+selective+killing+of+guidepost+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pioneer axons lose directed growth after selective killing of guidepost cells.</a> Nature. 304 (5921), 62-65 (1983).</li>
<li>Godement, P., Wang, L. C., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+axon+divergence+in+the+optic+chiasm%3A+dynamics+of+growth+cone+behavior+at+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Retinal axon divergence in the optic chiasm: dynamics of growth cone behavior at the midline.</a> Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7024-7039 (1994).</li>
<li>Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+axons+with+and+without+their+somata%2C+growing+to+and+arborizing+in+the+tectum+of+Xenopus+embryos%3A+a+time-lapse+video+study+of+single+fibres+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo.</a> Development. 101 (1), 123-133 (1987).</li>
<li>Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> Elife. 4, 10721(2015).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bases+of+olfactory+circuit+assembly+revealed+by+systematic+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular bases of olfactory circuit assembly revealed by systematic time-lapse imaging.</a> Cell. 184, 5107-5121 (2021).</li>
<li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+light-sheet+microscopy%3A+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998(2014).</li>
<li>Liu, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+the+cell+in+its+native+state%3A+Imaging+subcellular+dynamics+in+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms.</a> Science. 360 (6386), (2018).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+adaptive+optical+recovery+of+optimal+resolution+over+large+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes.</a> Nature Methods. 11 (6), 625-628 (2014).</li>
<li>Kohl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+tissue+staining+with+chemical+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Ultrafast tissue staining with chemical tags.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111 (36), 3805-3814 (2014).</li>
<li>Sutcliffe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-Generation+Drosophila+Chemical+Tags%3A+Sensitivity%2C+Versatility%2C+and+Speed%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Second-Generation Drosophila Chemical Tags: Sensitivity, Versatility, and Speed.</a> Genetics. 205 (4), 1399-1408 (2017).</li>
<li>Grimm, J. B., Brown, T. A., English, B. P., Lionnet, T., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Janelia+Fluor+HaloTag+and+SNAP-Tag+Ligands+and+Their+Use+in+Cellular+Imaging+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Janelia Fluor HaloTag and SNAP-Tag Ligands and Their Use in Cellular Imaging Experiments.</a> Methods Molecular Biology. 1663, 179-188 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De Drosophila antenne-hersen explant behoudt normale targeting van het reukcircuit. We merkten wel dat de ontwikkeling ex vivo 2 keer langzamer gaat dan in vivo. Opgemerkt wordt dat het explant-systeem geen maxillaire palp behoudt, die zes soorten ORN's herbergt. Om ervoor te zorgen dat de normale ontwikkeling ex vivo wordt samengevat, moet het uitrekken van de antennezenuwen worden vermeden tijdens explantdissectie. Tijdens ex vivo kweek veroorzaakt bacteriegroei meestal een ...

Neuronen zijn precies met elkaar verbonden om circuits te vormen die essentieel zijn voor de goede werking van de hersenen. Al meer dan 100 jaar proberen neurowetenschappers met extreme precisie te begrijpen hoe neurieten zich uitstrekken naar hun tussen- en einddoelen. Als gevolg hiervan hebben ze belangrijke genen geïdentificeerd die coderen voor aanwijzingen voor het ontwikkelen van neuronale processen1. Het Drosophila olfactorische systeem biedt een uitstekend model om dit proces te onderzoeken, aangezien olfactorische receptorneuronen (ORN's, de primaire sensorische neuronen) projecteren op 50 identificeerbare glomeruli met stereotiepe grootte, vorm en relatieve positie, waar ze synaptische verbindingen vormen met dendrieten van 50 soorten tweede-orde projectieneuronen (PR's), die elk dendrieten naar een van de 50 glomeruli2 sturen (figuur 1A ). Daarom is het relatief eenvoudig om gemuteerde fenotypen te identificeren bij synaptische (glomerulaire) resolutie in het reuksysteem van de vlieg. Dit leidde tot ontdekkingen van belangrijke genen die de assemblage van olfactorische circuitsreguleren 3.
De assemblage van het reukcircuit van de vlieg is afhankelijk van temporeel en ruimtelijk gecoördineerde ontwikkelingsprocessen3. ORN's en PN's krijgen verschillende celbestemmingen, die het programma opzetten voor hun bedradingsspecifieke kenmerken. Vervolgens prepatriëren PN-dendrieten de antennekwab (figuur 1B). De axonen van ORN's omcirkelen vervolgens de ipsilaterale antennekwab en kruisen de middellijn van de hersenen om de contralaterale antennekwab te bereiken. Vervolgens dringen ORN-axonen zowel ipsi- als contralaterale antennelobben binnen en vormen synapsen met dendrieten van hun partner-PR's in specifieke glomeruli. Dit grove model voor olfactorische circuitassemblage werd voorgesteld op basis van de karakterisering van vaste monsters uit tussenliggende tijdspunten tijdens de ontwikkeling. De slechte temporele resolutie en het onvermogen om dezelfde neuronale processen te volgen tijdens de ontwikkeling van vast weefsel beperken het mechanistische begrip van het circuitassemblageproces.
Het is technisch een uitdaging om ORN- en PN-processen in vivo te leven, omdat het bedradingsproces plaatsvindt in de eerste helft van het popstadium wanneer de antennekwab wordt omringd door ondoorzichtig vetlichaam in de pop. Het is daarom onmogelijk om het zich ontwikkelende reukcircuit van intacte poppen direct in beeld te brengen. Ontleedde weefsels die ex vivo zijn gekweekt, kunnen weefselopaciteit omzeilen en zijn met succes gebruikt om de neurale ontwikkeling tebestuderen 4,5,6. De uitdaging van het gebruik van een vergelijkbare ex vivo explantcultuurstrategie om neuronale bedrading in het popbrein te bestuderen, is of het de precieze neurontargeting in een cultuurconditie samenvat. Op basis van een eerder gerapporteerde ex vivo kweekconditie voor het fly eye-brain complex7, is onlangs een explant ontwikkeld die het hele popbrein, antennes en de verbindende antennezenuwen intact bevat, die nauwkeurige targeting van het reukcircuit behoudt en kan worden onderworpen aan op twee fotonenmicroscopie gebaseerde live beeldvorming tot 24 uur met de frequentie van elke 20 min8 . Hier wordt een gedetailleerd protocol van de explantcultuur en beeldvorming beschreven. Het explantingsysteem biedt een krachtige methode om de assemblage van olfactorische circuits en mogelijk andere circuits in de centrale hersenen te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>20-hydroxyecdysone</td><td>Sigma</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ti:Sapphire laser</td><td>Coherent</td><td>Coherent MRU X1</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Humaan insuline</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12585014</td><td></td></tr><tr><td>Beeldvormingssoftware</td><td>Prairie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Zuurstofcilinder</td><td>Praxair</td><td>OX M-E</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&rsquo;s Drosophila Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21720024</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0162601</td><td></td></tr><tr><td>Twee-foton microscopie</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>water immersie objectief (20X)</td><td>Zeiss</td><td>421452-9800-000</td><td></td></tr></tbody></table>

een explantatiesysteem voor time-lapse beeldvormingsstudies van olfactorische circuitassemblage in drosophila

An Explant System for Time-Lapse Imaging Studies of Olfactory Circuit Assembly in Drosophila

Neuronen zijn precies met elkaar verbonden om circuits te vormen die essentieel zijn voor de juiste functie van de hersenen. Het Drosophila olfactorische systeem biedt een uitstekend model om dit proces te onderzoeken, aangezien 50 soorten olfactorische receptorneuronen (ORN's) van de antennes en maxillaire palpen hun axonen projecteren op 50 identificeerbare glomeruli in de antennekwab en synaptische verbindingen vormen met dendrieten van 50 soorten tweede-orde projectieneuronen (PR's). Eerdere studies richtten zich vooral op het identificeren van belangrijke moleculen die de precieze targeting in het olfactorische circuit reguleren met behulp van vaste weefsels. Hier wordt een antenne-hersenexplantatiesysteem beschreven dat belangrijke ontwikkelingsmijlpalen van olfactorische circuitassemblage in cultuur samenvat. Door de externe cuticula te ontleden en ondoorzichtige vetlichamen te reinigen die het zich ontwikkelende popbrein bedekken, kunnen hoogwaardige beelden van afzonderlijke neuronen uit levende hersenen worden verzameld met behulp van twee-fotonenmicroscopie. Dit maakt time-lapse beeldvorming mogelijk van enkele ORN axon targeting uit levend weefsel. Deze aanpak zal helpen bij het onthullen van belangrijke celbiologische contexten en functies van eerder geïdentificeerde belangrijke genen en het identificeren van mechanismen die ten grondslag liggen aan het dynamische proces van circuitassemblage.

ORN-axonen komen tussen 18 h en 36 h APF bij de antennele lob. Ze navigeren dan door de antennekwab, steken de middellijn over en innerveren de glomeruli. Video 1 is een representatieve video die het hele proces toont voor verschillende individueel identificeerbare axonen, genomen met de frequentie van elke 20 minuten gedurende 24 uur. Voordat de registratie met TurboReg wordt gebruikt, vertonen de axonen enige laterale drifting naarmate de hersenen zich ontwikkelen (eerste helft van de video). Na regist...

Dit protocol beschrijft de dissectieprocedure, kweekconditie en live beeldvorming van een antenne-hersenexplantatiesysteem voor de studie van de olfactorische circuitassemblage.

Een explantatiesysteem voor time-lapse beeldvormingsstudies van olfactorische circuitassemblage in Drosophila

~Neurons are precisely interconnected to form circuits essential for the proper function of the brain. The Drosophila olfactory system provides an ...

Dit protocol presenteert een methode om live beeld te geven, olfactorische circuitassemblage op enkel axonniveau uit een zich ontwikkelend brein. dissectie om het weefsel te reinigen dat de zich ontwikkelende hersenen bedekt, kunnen we beelden van hoge kwaliteit van de interne hersenen verzamelen. Deze methode levert waardevolle inzichten op in de celbiologische basis van circuitontwikkeling.Het kan gemakkelijk worden aangepast om ook de ontwikkeling van andere circuits te bestuderen. Het duurt enige tijd voordat een persoon stabiele handcontrole uitvoert bij microdissectie. Meer oefening zal nuttig zijn.Bereid om te beginnen de kweekschaal voor op het mobiliseren van de explant tijdens time-lapse-beeldvorming door 0,5 centimeter dikke Sylgard op het bodemoppervlak van een petrischaal te leggen en deze 48 uur bij kamertemperatuur te laten uitharden. Om micropennen voor te bereiden voor het immobiliseren van de explant op deze plaat met behulp van een tang, plakt u meerdere micropennen op een tape met de scherpe uiteinden aan één kant uitgelijnd en knipt u twee millimeter scherpe uiteinden met een schaar. Steek vervolgens met behulp van de tang de gesneden micropennen in de Sylgard-laag van een vooraf gemaakte Sylgard-plaat.Verzamel met behulp van een borstel witte poppen, die binnen een uur puparium vormen en breng ze over naar een nieuwe injectieflacon. Incubeer de poppen in het waterbad getemperd op 37 graden Celsius gedurende 40 minuten om schaarse ORN-klonen van willekeurige typen te induceren. Plaats de injectieflacon na een hitteschok gedurende 30 uur op 25 graden Celsius, wat resulteert in poppen die 30 uur na de vorming van het poparium oud zijn.Bereid vervolgens het kweekmedium voor op explant zoals beschreven in het teksthandschrift en bewaar het bij vier graden Celsius. Voeg op de dag van beeldvorming foetaal runderserum, humane insulinestockoplossing en 20 hydroxyecdyson-stamoplossing oplossen in ethanol toe aan een injectieflacon van 50 milliliter met 45 milliliter Drosophila-medium van Schneider. Meng goed en breng 15 milliliter van het volledige medium over in een nieuwe conische buis van 50 milliliter en bewaar de rest van het volledige medium een week lang bij vier graden Celsius.Bedek vervolgens de buisopening met volledig medium met paraffinefilm en oxygeneer het medium door zuurstofbellen onder het vloeistofoppervlak te pompen door een steriele pipetpunt van vijf milliliter met een snelheid van één bel per seconde gedurende 20 tot 30 minuten. Steriliseer vervolgens het oppervlak van de dissectieput en bereide sylgardplaat vooraf met 70% ethanol en laat ze drogen voor gebruik. Gebruik een borstel om 30 uur APF-pop over te brengen op een tissuepapier om het buitenoppervlak van de pop gedurende vijf minuten te drogen.Na het aanbrengen van dubbelzijdige tape op een glazen dia, bevestigt u de gedroogde pop voorzichtig aan het kleverige oppervlak van de tape met de dorsale kant naar boven gericht. Druk de pop voorzichtig aan met een borstel om de ventrale kant goed aan de tape te bevestigen zonder de pop te beschadigen. Steek een scherpe punt van de tang tussen de bruine pop en de pop vanaf de zijkant en breek voorzichtig de bruine pop door een lijn naar het achterste uiteinde van de pop.Zodra de bruine popbehuizing is geopend, houdt u met behulp van de tang de pop voorzichtig vast en brengt u deze over naar de dissectieput met één milliliter zuurstofrijk vol medium. Dompel de pop onder in het medium om hem naar de bodem van de put te laten zinken. Om de antennehersenexplant van de pop te ontleden, houdt u de pop voorzichtig vast met een tang met één hand en met behulp van een paar microscisors, maakt u een klein gaatje van de achterste kant van de pop, dat hoge druk in de pop loslaat.Vanaf het gat snijdt u door de ventrale middellijn tot aan de nek en snijdt u vervolgens door de omtrek van de nek om het hoofd los te maken van het lichaam van de pop en plaatst u het lichaam in een andere put. Snijd vervolgens de transparante cuticula die de dorsale kant van de hersenen bedekt om het vetlichaam bovenop de hersenen bloot te leggen, zorg ervoor dat de nagelriem waaraan het netvlies en de antenne zich hechten behouden en snijd op dezelfde manier de cuticula van de ventrale kant van de hersenen. Pipetteer het medium naar de open gebieden aan de dorsale en ventrale zijden van het hoofd met behulp van een P10-pipet om het vetlichaam dat de hersenen en antenne bedekt voorzichtig uit te spoelen.Om de interactie van bilaterale ORN-axonen of ORN-axonen met PN-dendriet-targeting te bestuderen, snijdt u de antennezenuw tijdens het stadium door de messen van de microscisors zorgvuldig tussen de cuticula en de hersenen te plaatsen en de geïnteresseerde antennezenuw te verbreken. Voor het overbrengen van de ontlede explant naar de Sylgard-plaat, plaatst u ongeveer 200 microliter druppel van het zuurstofrijke volledige medium op het Sylgard-oppervlak. Pipetteer het vetlichaam afgeleid van de ontleedde stam meerdere keren door een pipetpunt van 200 microliter om het binnenoppervlak te coaten om te voorkomen dat de explantaten aan de pipetpunt blijven plakken tijdens de overdracht van de dissectieput naar de mediumdruppel op de Sylgard-plaat.Gebruik de tang om de explant op de Sylgard-laag in de twee optische lobben te pinnen, plaats vervolgens voorzichtig de Sylgard-plaat op het beeldvormingsstation, immobiliseer de plaat met tapes en voeg langzaam 10 milliliter van het zuurstofrijke volledige medium toe aan de Sylgard-plaat met behulp van een P1000-pipet. De ORN-axonen komen tussen 18 uur en 36 uur APF bij de antennelob en navigeren vervolgens door de antennelob, passeren de middellijn en innoveren de glomeruli. Vóór de registratie vertoonden de axonen enige laterale drifting naarmate de hersenen zich ontwikkelden, en na registratie werd het driften gecorrigeerd.De glomerulaire identiteiten van de geëxtraheerde ORN-axonen werden onthuld door immunostaining van een neuropilmarker en cadherine. Door te vergelijken met de interne kwabkaart kon de identiteit van elke glomerulus worden bepaald. Tijdens ex vivo kweek veroorzaakt bacteriegroei meestal een vertraagde ontwikkeling van het reukcircuit.Daarom is het belangrijk om de culturele schaal en pinnen grondig te steriliseren voordat de beeldvorming wordt afgebeeld en de beeldvormingsruimte schoon en geïsoleerd te houden. Voor het bereiken van een hogere ruimtelijke temporele resolutie kan dit explantsysteem in beeld worden gebracht met behulp van een meer geavanceerde microscoop, de adaptieve optica roosterlichtmicroscoop. Hoewel hier als voorbeeld een fabriekscircuitontwikkeling werd getoond, kan dit systeem mogelijk worden uitgebreid naar studies van andere circuits en ontwikkelingsprocessen in het zich ontwikkelende centrale brein.

an-explant-system-for-time-lapse-imaging-studies-olfactory-circuit

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Mesoscopische fluorescentie tomografie opereert buiten de grenzen van de penetratie-weefsel snijden fluorescentie microscopie. De techniek is gebaseerd op multi-projectie verlichting en een foton transport beschrijving. Tonen we aan in-vivo het hele lichaam 3D-visualisatie van de morfogenese van GFP-expressie vleugel imaginaire schijven...

Mesoscopische Fluorescentie Tomografie voor In-vivo Imaging van de ontwikkelingslanden Drosophila</em

Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor verdoving en beeldvorming van...

In vivo beeldvorming van Intact Drosophila larven aan Subcellulaire resolutie

This video demonstrates the dissection and mounting of brain explants from Drosophila larvae. The central nervous system (CNS), attached to eye disks, is extracted from the larvae and then mounted on a glass slide in a physiological saline solution.

Dissection and Mounting of Fruit Fly Larval Brain Explants

Source: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the use of confocal microscopy to visualize dendritic dynamics in live mouse retinal explants. It outlines the steps for stabilizing the retina under a confocal microscope, performing epifluorescence imaging to visualize starburst amacrine interneurons, and capturing...

Time-Lapse Confocal Imaging of Neuronal Dendritic Dynamics in Mouse Retinal Explants

Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.

Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuroblasts

Dit protocol presenteert een efficiënte methode voor het beeldvormen van het levende Drosophila pupale oogneuro-epitheel. Deze methode compenseert voor weefselbeweging en ongelijke topologie, verbetert de visualisatie van celgrenzen door het gebruik van meerdere GFP-gelabelde junctie-eiwitten en maakt gebruik van een eenvoudig te monteren beeldvormingsopstelling.

Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye

Het doel van dit protocol is om de ex vivo Drosophila larvale hersenen cultuur, geoptimaliseerd voor het controleren van de circadiane moleculaire ritmes met langdurige fluorescentie time-lapse beeldvorming. De toepassing van deze methode op farmacologische testen wordt ook besproken.

Eencellige resolutie fluorescentie leven beeldvorming van Drosophila circadiane klokken in larvale hersenen cultuur

Dit protocol is ontworpen voor de beeldvorming en analyse van de dynamiek van celoriëntatie en weefselgroei in de Drosophila abdominale epithelia terwijl de fruitvlieg een metamorfose ondergaat. De hier beschreven methodologie kan worden toegepast op de studie van verschillende ontwikkelingsstadia, weefsels en subcellulaire structuren in Drosophila of andere modelorganismen.

Beeldvorming en analyse van weefseloriëntatie en groeidynamiek in de ontwikkeling van Drosophila Epithelia tijdens pupale stadia

Hier beschrijven we de methode die we hebben gebruikt voorbeeld zeer beweeglijke dendritische filopodia in een live voorbereiding van de hersenen Drosophila larvale, en het protocol dat we hebben ontwikkeld om time-lapse 3D-beeldverwerkings sets voor kwantitatieve beoordelingen van dendriet te kwantificeren dynamiek in het ontwikkelen van neuronen.

Time-lapse Live beeldvorming en kwantificering van snelle dendritische tak dynamiek bij de ontwikkeling van Drosophila neuronen

Hier presenteren we een protocol waarmee pre-en/of postsynaptisch calcium kan worden gevisualiseerd in de context van Drosophila leren en geheugen. In vivo calcium beeldvorming met behulp van Synaptisch gelokaliseerde calcium sensoren wordt gecombineerd met een klassieke olfactorische conditionerings paradigma zodanig dat de Synaptische plasticiteit onderliggende dit type associatief leren kan worden bepaald.

In vivo optische calcium beeldvorming van leren-geïnduceerde synaptische plasticiteit in Drosophila melanogaster

We presenteren calciumbeeldvormingsprotocollen voor een Drosophila-larvale olfactorische neuron, met behulp van een topische weefsellijm voor immobilisatie. Deze methode verbetert de stabiliteit en maakt betrouwbare in- en ex-vivo-experimenten mogelijk. Aangepaste R-scripts analyseren calciumsignalen en bieden een efficiënt platform voor gedetailleerd neurofysiologisch onderzoek.

In-vivo en ex-vivo calciumbeeldvorming van een reukcircuitneuron in de larve van de Drosophila melanogaster met een derde instar

Leer een explantatiemethode voor time-lapse beeldvorming van olfactorische circuitassemblage in Drosophila. Dit protocol toont dissectie, cultuur en levende beeldvorming op enkel-axon niveau voor inzicht in neurale ontwikkeling.

Een explantatiesysteem voor time-lapse beeldvormingsstudies van olfactorische circuitassemblage in Drosophila

Meer video's verkennen