Iniezione di cellule di osteosarcoma intratibiale per generare modelli murini di osteosarcoma ortotopico e metastasi polmonari

Questo protocollo descrive la tecnica per generare modelli murini portatori di osteosarcoma primario e lesioni da metastasi polmonari. Con l'iniezione intratibiale di cellule di osteosarcoma, questo modello imita al meglio le caratteristiche di sviluppo clinico dell'osteosarcoma tumorale. Un numero accurato di cellule di osteosarcoma viene iniettato direttamente nella tibia utilizzando una siringa a microvolume, consentendo tassi di formazione tumorale e volumi tumorali identici.

Il giorno dell'iniezione di cellule di osteosarcoma, lavare le cellule due volte con PBS. Tripsinizzare le cellule con 1,5 millilitri di 0,25% tripsina per tre minuti. Quindi aggiungere sei millilitri di mezzi MEM contenenti siero al 10%.

Raccogliere le cellule in un tubo centrifugo da 15 millilitri. Aspirare 20 microlitri di sospensione cellulare nella camera della piastra di conteggio delle celle e calcolare la concentrazione cellulare utilizzando un contatore automatico di celle. Centrifugare le celle a 800 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente.

Aspirare il surnatante con una pipetta, risospesciare il pellet cellulare in una matrice di membrana basale da 8,5 milligrammi per millilitro e metterli sul ghiaccio. Posizionare il mouse in posizione supina. Tenere la caviglia del mouse usando il pollice e l'indice e disinfettare il sito di iniezione della tibia con un tampone di etanolo al 70%.

Ruotare l'articolazione della caviglia di ciascun topo verso l'esterno per spostare la tibia e il perone e piegare l'articolazione del ginocchio in una posizione adatta fino a quando il plateau della tibia prossimale è visibile attraverso la pelle. Attaccare l'ago a una siringa da un millilitro e puntare la punta dell'ago verso il sito di iniezione, parallelamente all'asse della tibia. Inserire per via percutanea l'ago per praticare un foro attraverso la piattaforma della tibia verso l'estremità distale della tibia.

Caricare la sospensione cellulare di osteosarcoma precedentemente posta sul ghiaccio in una siringa a microvolume e sostituire la siringa da un millilitro nella tibia con la siringa microvolume caricata con cellule di osteosarcoma. Iniettare lentamente circa 10 microlitri di sospensione cellulare di osteosarcoma nella tibia di ciascun topo atimico senza applicare molta pressione. Quindi rimuovere la siringa a microvolume dal sito di iniezione e premere il sito con il batuffolo di cotone per circa 30 secondi.

Riposizionare il mouse in una gabbia pulita e osservarne il recupero per 10 minuti. Questa figura raffigura il modello murino con osteosarcoma ortotopico sviluppato dall'iniezione intratibiale di cellule di osteosarcoma e la sua forma isolata. Un graduale aumento del volume del tumore si osserva ogni settimana.

Le immagini a raggi X ottenute dalla prima alla sesta settimana dopo l'iniezione di cellule di osteosarcoma marcate con luciferasi hanno mostrato un graduale aumento di volume. Inoltre, l'immagine ottenuta dopo l'iniezione nella tibia del topo ha mostrato una crescita ortotopica dell'osteosarcoma in vivo. Le metastasi polmonari causate dall'iniezione intratibiale delle cellule dell'osteosarcoma sono state monitorate con successo in vivo utilizzando un sistema di imaging dal vivo a bioluminescenza.

L'osservazione sotto uno stereomicroscopio ha rivelato colonie metastatiche nei tessuti polmonari isolati. La colorazione HE sui tessuti polmonari incorporati in paraffina ha mostrato lesioni metastatiche. L'ago deve essere inserito per via percutanea nella capsula articolare attraverso il legamento rotuleo per praticare un foro attraverso la piattaforma della tibia verso la tibia digitale ruotando la siringa.