Name: 原発性患者特異的大動脈平滑筋細胞の単離とインビトロでの半定量的リアルタイム収縮測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学ぶ 原発性患者特異的大動脈平滑筋細胞の単離とECISを用いたリアルタイム収縮測定法。この技術は、大動脈瘤患者における筋細胞収縮低下の評価と治療標的の同定に有用です。

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Tara van Merrienboer、Albert van Wijk、Jolanda van der Velden、Jan D. Blankensteijn、Lan Tran、Peter L. Hordijk、PAREL-AAAチーム、およびアムステルダムUMC、Zaans Medisch Centrum、Dijklander病院のすべての血管外科医に、この研究のための材料と支援を提供してくれたことに感謝の意を表したいと思います。

<ol><li>Milewicz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+of+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections%3A+focus+on+smooth+muscle+cell+contractile+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 9, 283-302 (2008).</li>
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<li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRP3+%28nucleotide+oligomerization+domain-like+receptor+family%2C+pyrin+domain+containing+3%29-caspase-1+inflammasome+degrades+contractile+proteins%3A+implications+for+aortic+biomechanical+dysfunction+and+aneurysm+and+dissection+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">NLRP3 (nucleotide oligomerization domain-like receptor family, pyrin domain containing 3)-caspase-1 inflammasome degrades contractile proteins: implications for aortic biomechanical dysfunction and aneurysm and dissection formation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (4), 694-706 (2017).</li>
<li>Bogunovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+smooth+muscle+cell+contractility+as+a+novel+concept+of+abdominal+aortic+aneurysm+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impaired smooth muscle cell contractility as a novel concept of abdominal aortic aneurysm pathophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-14 (2019).</li>
<li>Hurst, V., Goldberg, P. L., Minnear, F. L., Heimark, R. L., Vincent, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearrangement+of+adherens+junctions+by+transforming+growth+factor-%CE%B21%3A+role+of+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rearrangement of adherens junctions by transforming growth factor-β1: role of contraction.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 276 (4), 582-595 (1999).</li>
<li>Hu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+ECIS+and+LAPS+for+establishing+a+cardiomyocyte-based+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B%3A+Chemical%22%5BJournal%5D)">Comparison between ECIS and LAPS for establishing a cardiomyocyte-based biosensor.</a> Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 238-244 (2013).</li>
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<li>Halterman, J. A., Kwon, H. M., Zargham, R., Bortz, P. D. S., Wamhoff, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+factor+of+activated+T+cells+5+regulates+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear factor of activated T cells 5 regulates vascular smooth muscle cell phenotypic modulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (10), 2287-2296 (2011).</li>
<li>Bass, H. M., Beard, R. S., Cha, B. J., Yuan, S. Y., Nelson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombomodulin+induces+a+quiescent+phenotype+and+inhibits+migration+in+vascular+smooth+muscle+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Thrombomodulin induces a quiescent phenotype and inhibits migration in vascular smooth muscle cells in vitro.</a> Annals of Vascular Surgery. 30, 149-156 (2016).</li>
<li>Burger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+and+functional+assessment+of+smooth+muscle+like-cells+with+pathogenic+variants+in+aneurysm+genes+ACTA2%2C+MYH11%2C+SMAD3+and+FBN1%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping and functional assessment of smooth muscle like-cells with pathogenic variants in aneurysm genes ACTA2, MYH11, SMAD3 and FBN1.</a> Human Molecular Genetics. , (2021).</li>
<li>Yeung, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transdifferentiation+of+human+dermal+fibroblasts+to+smooth+muscle-like+cells+to+study+the+effect+of+MYH11+and+ACTA2+mutations+in+aortic+aneurysms%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Transdifferentiation of human dermal fibroblasts to smooth muscle-like cells to study the effect of MYH11 and ACTA2 mutations in aortic aneurysms.</a> Human Mutation. 38 (4), 439-450 (2017).</li>
</ol>

著者は宣言する利益相反を持っていません。

本稿では、インピーダンスと表面占有の変化に基づいて、 SMC収縮をin vitroで測定する方法を提示する。まず、患者固有の初代ヒトSMCおよび皮膚線維芽細胞の単離、培養、および拡大について説明し、続いて収縮測定にそれらを使用する方法を説明する。 
この研究の限界は、外植プロトコルを介して細胞を得ることに関連している。生検から増殖する細胞は、 生体内の元の組織とは異なる特性を有する可能性がある。さらに、ここで提示された外植プロトコルは革新的ではありませんが、この場合、患者固有の大動脈瘤材料から収縮測定までの完全なワークフローを提示するために含まれています。 インビトロで 細胞を培養することは、全身因子の欠如および異なる基質剛性のためにそれらの特性のいくつかにも影響し得る。これは、SMCマーカー発現の変動性を説明する可能性がある。信頼できる線維芽細胞マーカーがないため、線維芽細胞は通常、他の細胞と比較してマーカーの不在に基づいて区別される。したがって、我々は、このプロトコールで単離された線維芽細胞を特徴付けていない。もう1つの制限...

平滑筋細胞(SMC)は、大動脈内側層、大動脈の最も厚い層における優勢な細胞型である。壁内では、それらは放射状に配向しており、他の機能の中でも特に、血管収縮および血管拡張に関与する1。このSMC収縮機構は、細胞外マトリックス2との機能的リンクを介して大動脈における力の伝達に関与している。平滑筋ミオシン重鎖(MYH11)および平滑筋アクチン(ACTA2)などのSMC収縮装置のタンパク質をコードする遺伝子の変異は、家族性胸部大動脈瘤の症例に関連しており、大動脈の構造的および機能的完全性の維持におけるSMC収縮の関連性を強調している1,2.さらに、TGFβシグナル伝達経路の変異は大動脈瘤とも関連しており、大動脈瘤の病態生理におけるそれらの効果も皮膚線維芽細胞3において研究することができる。
インビトロでのSMC収縮のハイスループット測定は困難です。SMCの収縮性はヒトのインビボでは測定できないため、ヒト細胞に対するインビトロアッセイは実現可能な代替手段を提示します。さらに、動物モデルにおける腹部大動脈瘤(AAA)の発生は、例えばエラスターゼ灌流によって化学的に誘導されるか、または特定の変異によって引き起こされる。したがって、動物データは、喫煙、年齢、および/またはアテローム性動脈硬化症などの多因子的原因を主に有するヒトにおけるAAA発症とは比較にならない。インビトロSMC収縮性は、これまで主に牽引力顕微鏡4、5、Fura−2蛍光細胞内カルシウムフラックス6の定量、およびコラーゲンしわアッセイ7によって測定されてきた。牽引力顕微鏡は、単一細胞によって生成される力に関する非常に貴重な数値的洞察を提供しますが、複雑な数学的データ処理と一度に1つの細胞の分析のためにハイスループットスクリーニングには適していません。Fura-2色素およびコラーゲンしわアッセイは、収縮の表面的な決定を可能にし、正確な数値出力を与えないため、患者固有の差異を区別するのにはり適していません。腹部大動脈瘤患者の大動脈由来の細胞におけるSMC収縮障害は、インビトロでSMC収縮を測定するための新規な方法を最適化することによって初めて実証された8。これは、電気セル基板インピーダンスセンシング(ECIS)法を再利用することによって行われました。ECISは、創傷治癒および遊走アッセイ12、13、14におけるSMC増殖および挙動などの付着性細胞挙動および収縮9、10、11の定量化のためのリアルタイム、中程度スループットアッセイである。正確な方法については、プロトコルのセクションで説明します。この最適化された方法で、ECISは、それらの類似したサイズおよび形態による線維芽細胞収縮を研究するためにも使用することができる。
この論文の目的は、ECIS8を使用してインビトロでSMC収縮を測定し、対照SMCと患者SMCとの間の収縮を比較する方法の段階的な説明を提供することである。まず、コントロールおよび患者の大動脈生検からの初代SMCの単離および培養について説明し、これは収縮測定に使用することができる。第2に、収縮の測定および分析について、SMCマーカー発現の検証とともに、説明する。さらに、本稿では、患者特異的皮膚線維芽細胞の単離方法についても、同様の手法を用いて収縮を測定することができる。これらの細胞は、大動脈瘤または他の心血管病理に焦点を当てた患者特異的研究15、または動脈瘤手術前の収縮測定を可能にする分化転換プロトコールを用いた予後研究16に使用することができる。

<table><tbody><tr><td>96ウェルアレイ</td><td>応用生物物理学</td><td>96W10idf PET</td><td>アレイ ECISセットアップの収縮を測定するために使用</td></tr><tr><td>Custodiol</td><td>Dr. Franz H&ouml;hler Chemie GmbH</td><td>RVG 12801</td><td>手術室から研究室に組織を移すために使用される溶液</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td><td>ド Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>イオノマイシンを希釈するために使用される溶液</td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td>細胞培養培地への添加</td></tr><tr><td>ハムのF-10栄養ミックス</td><td>Gibco</td><td>11550043</td><td>皮膚線維芽細胞</td></tr><tr><td>の培養に使用される培地ヒト血管平滑筋細胞 基礎培地 (旧称 ''Medium 231'')</td><td>Gibco</td><td>M231500</td><td>平滑筋細胞の培養に使用される培地</td></tr><tr><td>Invitrogen countess II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td>自動セルカウンター</td></tr><tr><td>ストレプトマイセス・コングロバタス由来のイオノマイシンカルシウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634-1MG</td><td>収縮刺激に使用される化合物</td></tr><tr><td>NaCl 0.9%</td><td>フレゼニウス・カビ</td><td>B230561</td><td>手術室から研究所への組織移し替えに使用される溶液</td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td>15140122</td><td>細胞培養培地に使用される抗生物質</td></tr><tr><td>ホスパテ緩衝生理食塩水</td><td>ギブコ</td><td>10010023</td><td>細胞の洗浄に使用</td></tr><tr><td>クイックRNAミニプレップキット</td><td>ザイモリサーチ</td><td>R1055</td><td>RNA単離</td></tr><tr><td>に使用されるキット平滑筋成長サプリメント(SMGS)</td><td>Gibco</td><td>S00725</td><td>平滑筋細胞培養培地に添加されるサプリメント</td></tr><tr><td>SuperScript VILO cDNA合成キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11754250</td><td>キット cDNA合成に使用</td></tr><tr><td>SYBRグリーンPCRマスターミックス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4309155</td><td>qPCR用試薬</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>トリプシン化に使用細胞</td></tr><tr><td>Ztheta</td><td>Applied Biophysics</td><td>ZTheta</td><td>ECIS装置で収縮測定に使用</td></tr></tbody></table>

原発性患者特異的大動脈平滑筋細胞の単離とインビトロでの半定量的リアルタイム収縮測定

Isolation of Primary Patient-specific Aortic Smooth Muscle Cells and Semiquantitative Real-time Contraction Measurements In Vitro

平滑筋細胞(SMC)は、大動脈媒体における優勢な細胞型である。それらの収縮機構は、大動脈における力の伝達に重要であり、血管収縮および血管拡張を調節する。SMC収縮装置タンパク質をコードする遺伝子の変異は、胸部大動脈瘤などの大動脈疾患と関連している。SMC収縮を インビトロ で測定することは、特にハイスループット方式で困難であり、これは患者材料をスクリーニングするために不可欠である。現在利用可能な方法は、この目的には適していません。本稿では、電気セル基板インピーダンスセンシング(ECIS)に基づく新しい方法を提示する。まず、大動脈瘤の研究のために、大動脈生検および患者特異的ヒト原発性皮膚線維芽細胞から患者特異的ヒト原発性SMCを単離するための外植プロトコルが記載されている。次に、これらの細胞の収縮応答を測定するための新しい収縮方法の詳細な説明が与えられ、その後の分析および異なるグループを比較するための提案を含む。この方法は、翻訳(心臓血管)研究および患者および薬物スクリーニング研究の文脈における接着細胞の収縮を研究するために使用することができる。

この方法の再現性をテストするために、この方法は最初に制御SMCのみを使用して検証されました。実験間測定再現性を決定するために、全ての含まれた対照細胞株および患者細胞株の2つの独立した測定値をBland-Altmanプロットとしてプロットした(図3B)。プロットは、この方法が1つの外れ値細胞株を除いて、信頼区間外の変動性を示さないことを実証した。さらに、これらの結果は、同じ実験内で播種し、同時に刺激された2つのウェルが実質的に同じ収縮応答曲線を示すことを実証した(図4C)。示された応答が収縮であり、イオノマイシン刺激による浸透圧ストレスではないかどうかを検証するために、刺激後に培地を交換し、細胞の挙動を記録した。これは、刺激された細胞が再び電極上に広がり始めたことを示している(図4D)。
この新規方法の最初の適用として、健康な非拡張大動脈(n = 6)および腹部大動脈瘤(AAA)患者(n = 21; <st...

本稿では、初代患者特異的なヒト大動脈平滑筋細胞および皮膚線維芽細胞を単離および培養するための外植培養ベースの方法について説明する。さらに、細胞収縮の測定およびその後の分析のための新規な方法が提示され、これはこれらの細胞における患者特異的な差異を研究するために使用することができる。

Smooth muscle cells (SMCs) are the predominant cell type in the aortic media. Their contractile machinery is important for the transmission of force in ...

この方法により、研究者は複数の患者細胞株の細胞収縮を同時に研究することができます。それは私たちがより速してより効率的に病気を研究することを可能にします。この技術により、細胞の収縮をリアルタイムで定量化することができます。1時間以内に、数十個の細胞の収縮値を得ることができます。我々は、大動脈瘤を有する患者の群において筋肉細胞収縮が減少することを初めて実証した。これは、新しいバイオマーカーまたは医学的治療の標的となり得る。まず、2組の手術用鉗子とメスを70%エタノールに浸し、その後乾かして滅菌します。次いで、組織解剖が行われるペトリ皿に2ミリリットルのSMC培地をピペットする。次に2.5ミリリットルのSMC培地を2つのT−25フラスコにピペットする。少量の媒体が表面全体を覆うようにフラスコを旋回させる。生検を目視検査し、内膜側と外膜側のぬるぬるした結合組織の存在により3つの大動脈層を特定し、層を区別する。SMCを媒体から単離するには、最初に内膜プラークを有する組織を上にして他の2つの層を除去し、次に鉗子で組織から引き離すことによって固体プラークを除去し、ピンク色の均一な内側層が見えるまで第2の鉗子で組織を押し下げる。次に、組織を反転させ、外来層を引き抜いて同じ手順を繰り返し、この層がメディアから容易に剥離しないので、必要な回数だけ多くの試行ですべての可視部分を除去するようにしてください。メディア層が分離されたら、メディアを鉗子で押し下げ、メスを使用して組織を一方向に切断して、損傷を最小限に抑えるためにきれいな一方向カットを行うことで、組織を立方体に切断します。鉗子を使用して、これらの組織片の10〜20個をT−25フラックの上四分の一に置く。前述のように2対の外科用鉗子およびメスを滅菌した後、組織解剖が行われるペトリ皿に2ミリリットルの線維芽細胞培地をピペットする。次に、2.5ミリリットルの線維芽細胞培地を2つのT−25フラスコにピペットし、少量の培地が全面を覆うようにフラスコを旋回させた。表皮を認識可能な皮膚表面、時には目に見える毛で識別するための生検を視覚的に検査し、反対側に黄色くてぬるぬるした皮下脂肪を探します。表皮と皮下脂肪の間の層は真皮であり、生存可能な線維芽細胞の供給源である。真皮から線維芽細胞を単離するには、真皮側に組織を配置して他の2つの層を除去し、3つの層すべてを見えるようにする。その後、鉗子で組織を押さえ、組織を傷つけることなく表皮全体を1つのきれいな線で切り取ります。今度は組織をひっくり返し、皮下脂肪との境界に平行な真皮内を切断することによって同じ手順を繰り返す。真皮が単離されたら、組織を立方体に切断し、組織を鉗子で押し下げ、メスを使用して組織を一方向に切断する。次いで、鉗子を用いてこれらの組織片の10〜20個をT−25フラスコの上四分の一に置く。自動セルカウンターを使用して細胞をカウントし、ゼラーティングされたECISプレートに200マイクロリットルのSMC培地に1ウェルあたり30,000細胞の播種密度でSMCを3連で播種します。SMCの入ったプレートを細胞培養インキュベーター内のECISの96ウェルホルダーに入れます。ECIS Applied BioPhysics ソフトウェアをダブルクリックしてプログラムを開き、[セットアップ] ボタンを押します。すべての電極が、左下のパネルの「ウェル構成」というラベルの付いたホルダーに接触しているかどうかを確認します。電極が正しく接続されていない場合は、測定を開始する前にホルダー内のプレートを調整してください。次に、同じパネルで「配列タイプ」(Array type) をクリックしてプレートタイプを選択します。次に、2マイクロリットルおよび150マイクロリットルの容量に設定した2つのピペットを準備する。刺激を開始する前に、ソフトウェアでマークを押してコメントを入れてください。細胞を刺激するには、蓋を外してインキュベーター内の滅菌面に置きます。次に、2マイクロリットルのイオノマイシン作動溶液をできるだけ早く各ウェルにピすることによってSMC収縮を誘導する。すべての細胞が刺激されたら、2番目のピペットを使用してウェル内の培地を混合します。実験間測定の再現性を決定するために、すべての包含された対照細胞株および患者細胞株の2つの独立した測定値をBland-Altmanプロットとしてプロットし、この方法が1つの外れ値細胞株を除いて信頼区間外の変動性を示さなかったことを実証した。同じ実験で播種し、同時に刺激した2つのウェルは、実質的に同じ契約応答曲線を示した。示された応答がイオノマイシン刺激による収縮ではなく浸透圧ストレスであるかどうかを検証するために、刺激後に培地を交換し、細胞の挙動を記録し、刺激された細胞が再び電極上に広がり始めたことを示した。健康な非拡張大動脈由来のSMCにおける収縮応答は、腹部大動脈瘤患者からの52%の中央値応答と比較して、61%の中央値応答を示した。対照群の平均収縮応答を用いて、正常値よりも低い収縮値を有する4人の患者を同定した。ウェスタンブロット分析およびその後の定量化により、細胞がSMCマーカーを発現することを確認した。SMCの増殖能を決定するために、Ki67についてqPCRを実施した。Ki67発現は全ての細胞で検出可能であったが、収縮性出力と相関しなかった。収縮のために細胞を刺激するときは、同時にりにも多くの井戸をピしないようにし、できるだけ速くピしようとしました。この手順には、いくつかの練習が必要な場合があります。この方法を用いて、我々は患者の収縮に基づいて患者を分割し、正常な収縮を低下させるために、これらの患者および喫煙などの臨床的特徴との関連を調査することができた。

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