Immunology and Infection
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Melanogaster drosophila Protocolo de injeção de larvas
Chapters
Summary October 19th, 2021
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As moscas adultas de Drosophila melanogaster têm sido amplamente utilizadas como organismos modelo para investigar os mecanismos moleculares subjacentes às respostas imunes inatas antimicrobianas e estratégias de infecção microbiana. Para promover o estágio da larva D. melanogaster como um sistema modelo adicional ou alternativo, uma técnica de injeção larval é descrita.
Transcript
Este protocolo aborda as dificuldades e desafios com a larva de microinjeção, descrevendo um método preciso que permitirá o uso da larva de melanogaster Drosophila como modelo para vários estudos imunológicos e moleculares. Esta é uma técnica de injeção simples que apresenta um método eficiente, econômico e rápido para fornecer repetidamente uma variedade de substâncias de forma uniforme, o que permite resultados consistentes e confiáveis. Comece selecionando o terceiro estágio instar larvas e lavando-as com a solução de Ringer em uma pequena placa de Petri.
Coloque um papel filtro em uma placa de Petri e umedeça-o com 5 ml de solução ringer. Em seguida, coloque as larvas no papel do filtro. Prepare os capilares usando tubos capilares de vidro de 3,5"em um puxador de micropipette.
Abra o capilar de vidro com a ajuda de fórceps de ponto médio serrilhados retos. Encha o capilar aberto com óleo mineral usando uma seringa descartável de plástico. Em seguida, ejete o óleo para fora do tubo capilar com um injetor nanoliter.
Encha o capilar com a preparação bacteriana desejada para injeção. Transfira as larvas anestesiadas para um papel filtro umedecido com a solução de Ringer. Usando fórceps, aplique pressão firme no lado dorsal da extremidade posterior das larvas, onde os espirros traqueais são aparentes.
Em seguida, insira a agulha horizontalmente, na extremidade posterior das larvas, e injete os estoques bacterianos. Remova as fórceps para evitar derramamento de hemoglifo ou intestino. Em seguida, retire a agulha previamente inserida em larvas.
Infecte 20 larvas para cada condição experimental. Usando um pincel, transfira suavemente as larvas injetadas para um papel filtro úmido separado. Adicione a solução do Ringer conforme necessário para evitar a dessacação.
Incubar a placa de Petri em uma incubadora a 25 C.Drosophila melanogaster larvas infectadas com Fotorhabdus asymbiotica exibiu uma taxa de sobrevivência de 57% durante 24 horas após a injeção, enquanto larva injetada com Escherichia coli mostrou uma taxa de sobrevivência de 85% ao mesmo tempo. A importância deste método é que a agulha é mantida aproximadamente paralela à larva. A pressão aplicada para segurar a larva é muito pequena, o que reduz a possibilidade de vazamento hemoglifo, ferimento fatal ou entrega inadequada da substância desejada.
Esta técnica pode ser aperfeiçoada com prática.
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