Biology
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Effektiv oral RNA-interferens (RNAi) administrering till vuxna anopheles gambiae myggor
Chapters
Summary March 1st, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Den orala administreringen av dsRNA som produceras av bakterier, en leveransmetod för RNA-interferens (RNAi) som rutinmässigt används i Caenorhabditis elegans, tillämpades framgångsrikt här på vuxna myggor. Vår metod möjliggör robusta omvända genetikstudier och transmissionsblockerande vektorstudier utan användning av injektion.
Transcript
RNA-interferens är ett av de viktigaste verktygen som används för omvänd genetik i myggor och oral leverans gör att vi kan inducera och upprätthålla gentystning hos vuxna myggor utan behov av mikroinjektion. Den orala leveransen av dubbelsträngat RNA till vuxna myggor är en billig och mångsidig RNA-interferensmetod som avsevärt minskar arbete och tid och ansträngning för att studera genfunktionen. Denna metod kan användas för att studera inte bara andra målgener i Anopheles gambiae, utan också i en annan anopheles av intresse som Anopheles albinamus.
Till att börja med, odla en kultur från en enda bakteriekoloni av Escherichia coli-stammen HT115 (DE3) innehållande det dubbelsträngade RNA som uttrycker plasmid i fem milliliter lb innehållande ampicillin och tetracyklin på en plattformsskakare i 12 timmar vid 37 grader Celsius och 180 varv / min. Efter 12 timmar, ta 0,5 ml av den över natten odlade bakteriekulturen och gör en en i 1000 utspädning i 2X jäst trypton media innehållande ampicillin och tetracyklin. För att inducera den dubbelsträngade RNA-produktionen, tillsätt IPDG vid den slutliga koncentrationen av 40 mikromolar.
Inkubera sedan kulturen i två timmar under skakande förhållanden som visats. Vid slutet av inkubationen när den optiska densiteten av kulturen når 0,4 vid 600 nanometer, pelletera bakteriecellerna genom centrifiering vid 4000 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius och tvätta sedan cellerna i en volym PBS. Efter att ha snurrat cellerna en gång till, resuspendera cellerna i PBS och inkubera vid 70 grader Celsius i en timme.
Efter värmedödande bakterierna, gör alikvoter på 400 mikroliter volym och förvara dem vid 20 grader Celsius tills vidare användning. Blanda en 400 mikroliter alikvot av tina värmedödade bakterier som uttrycker dubbelsträngat RNA med 1,6 ml 12% sockerlösning innehållande 0,2% metylparaben. Blötlägg en liten bomullstuss i denna lösning och placera den i en bur som innehåller fem dagar gamla myggor och se till att myggorna matar på denna lösning.
Byt bomullstussen som blötläggs i dubbelsträngad RNA-sockerlösning varannan dag i åtta på varandra följande dagar, så att buret bibehålls under konstanta förhållanden. För att bedöva myggorna med kyla, placera behållaren på is tills myggor slutar röra sig och placera sedan myggorna på en kall yta för att isolera kvinnor för dissektion. Efter sprutning av myggorna med etanol, placera dem på en glasyta med PBS.
Säkra mygghuvudet med ett par tångar och dra i bröstkorgen mycket långsamt så att spottkörtlarna kan släppas ut i PBS. När spottkörtlarna har dissekerats från 10 myggor, dra körtlarna för RNA-extraktion. Efter avslutad RNA-extraktion, suspendera RNA-pelleten i 30 mikroliter RNA-fritt vatten.
Mät absorbansen och beräkna RNA-koncentrationen enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Använd ett kommersiellt omvänd transkriptionssats, syntetisera cDNA från ett mikrogram RNA. Späd cDNA 10 gånger och ställ in RTPCR-reaktionerna i tre exemplar för mål- och hushållsgener enligt tillverkarens rekommendationer.
Förstärk CDNA med standard PCR-förhållanden i realtid. För att utvärdera förmågan att blodmata, placera grupper av 15 kvinnliga myggor behandlade med mål och kontrollerat dubbelsträngat RNA i små burar och svälta dem i fyra timmar. Ge defibrillerat billigt blod till myggorna med hjälp av ett cirkulerande vattenbad som är inställt på 37 grader Celsius, glas myggmatare och peryfillmembran.
Observera, räkna och registrera antalet sonderingsförsök att framgångsrikt förvärva en blodmåltid från de första fem kvinnorna för att bli helt engorged i varje grupp. Efter att ha isolerat färsk vävnad och PBS har visat tidigare, fixa den i iskall aceton i 90 sekunder. Skölj sedan vävnaden flera gånger i PBS och inkubera med primära antikroppar över natten vid fyra grader Celsius med antiserum utspätt i PBS.
Vid slutet av inkubationen, tvätta vävnaden flera gånger med PBS. Tillsätt fluorescerande sekundära antikroppar utspädda i PBS och inkubera i mörkret vid rumstemperatur i två timmar. Tillsätt eventuell motfläck 30 minuter före slutet av den två timmars inkubationen.
Tvätta vävnaden tre gånger med PBS efter två timmar, montera sedan vävnaderna i 100% glycerol på en vanlig mikroskopglidning med en millimeter tjock täckglidning och förvara vid 20 grader Celsius tills avbildning. Mikroarayuttrycksdata visade uttrycket av alla valda riktade gener i vuxna spottkörtlar och nivåerna av AAPP och salvia var särskilt höga. Det dubbelsträngade RNA reducerade effektivt överflödet av gaffelhuvudtranskriptioner i spottkörteln.
Gaffelhuvudet dubbelsträngade RNA-matade myggor uppvisade fem gånger fler utfodringsförsök än kontrollgruppen eller FEG dubbelkön dubbelsträngad RNA-matade myggor för att vara helt engorged med blod. Nivåerna av salvia och CrebA-färgning reducerades markant i alla spottkörtellober efter RNA-interferens i gaffelhuvudet jämfört med myrkontroll-RNA-interferens. Vid övervägande av mycket rikliga salivkomponentproteiner reducerades nivåerna av AAPP i alla tre spottkörtelloberna efter RNA-interferens i gaffelhuvudet jämfört med kontroll-RNA-interferensbehandling.
Å andra sidan observerades inga förändringar i nivåerna av mucin. Dessa data tyder på att gaffelhuvudet bidrar annorlunda till uttrycket av olika salivproteingener. Minskad Rab11-fluorescens observerades i distala laterala lober efter RNA-interferensbehandling med gaffelhuvudet, men ökad Rab11-signal i de mediala och proximala laterala loberna förekom också.
Ingen märkbar skillnad observerades i Nilröd signal efter RNA-interferens i gaffelhuvudet jämfört med kontroll-RNA-interferensbehandlingen. någon sekreterarmaskinreaktion på ett komplext sätt som skiljer sig mellan spottkörtellober. Denna teknik kan göra det möjligt för forskare att tysta gener för vilka uttryck kan reduceras genom en enda injektion av dubbelsträngat RNA och att utforska oral leverans av dubbelsträngs-RNA för att använda RNAi som en potentiell vektorkontrollmetod.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
