Genetics
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Rapido isolamento dei nematodi selvatici di Baermann Funnel
Chapters
Summary January 31st, 2022
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Questo protocollo delinea un metodo per estrarre in modo efficiente nematodi vivi da substrati naturali sul campo.
Transcript
I nematodi Caenorhabditis sono animali reali, che vivono in natura. La raccolta di nematodi selvatici, ci permette di studiare geni e genomi nel loro contesto naturale rivelando funzioni, che possono essere oscurate dalle condizioni artificiali del laboratorio. Questa tecnica, estrae i vermi, da substrati organici ricchi di batteri nel campo, e crea colture pulite su piastre di Petri, catturando un'istantanea di ogni popolazione, al momento della raccolta.
Queste popolazioni sono adatte all'ecologia, alla genetica delle popolazioni o alle domande di metagenetica. Le colture di ceppi selvatici sono anche preziose per studi genetici quantitativi. Questa tecnica è semplice e facile da eseguire, anche per un principiante della ricerca sul campo.
Tuttavia, un viaggio di raccolta di successo, richiede una preparazione ponderata dei materiali, prima di viaggiare. Identifica un substrato ricco di batteri nel campo, come frutta in decomposizione, fiori, funghi, steli di piante erbacee, terreno o lettiera di foglie. Posizionare un piccolo volume del substrato, in un sacchetto di plastica etichettato.
Se il materiale in decomposizione è raro nel lato di interesse del campo, posiziona un po 'di frutta come esca. Lascialo dondolare, quindi recuperalo e tutti i vermi che lo hanno colonizzato. Registrare l'ID campione, la latitudine, la longitudine, la data e la descrizione del substrato.
Registrare qualsiasi altra misurazione ambientale locale, rilevante per l'esperimento, come la temperatura ambiente e del substrato, le condizioni del substrato, il tempo di raccolta e la presenza di macro invertebrati associati al substrato. Usa le forbici per tagliare un segmento di tre centimetri, di tubi di gomma da ogni imbuto. Montare il tubo sopra l'estremità di un imbuto di plastica.
Far scorrere un morsetto per tubi sul tubo di gomma e bloccarlo. Per realizzare un supporto a imbuto, tagliare fori circolari, al centro di un vassoio vile di cartone aperto. Capovolgere il cartone, piegare i lati una volta e fissarli insieme.
Questo creerà gambe, che elevano i fori sopra la panca. Assicurarsi che i morsetti per tubi siano in posizione chiusa e posizionare gli imbuti nei fori. Versare acqua sterile in ogni imbuto, riempiendolo di circa tre centimetri sotto il bordo.
Toccare l'imbuto, per rilasciare eventuali bolle d'aria intrappolate nel tubo. Piegare una salvietta senza lanugine a metà, per fare un quadrato, e posizionarla sopra l'imbuto. Quindi, premere il pulire verso il basso, per immergerlo nell'acqua.
Rompere manualmente eventuali pezzi solidi di grandi dimensioni, del substrato naturale. Posizionare delicatamente parte del campione sulla salvietta nell'imbuto. Assicurarsi di non forare la salvietta o lasciare qualsiasi campione sporgente sopra il bordo.
Piegare con cura gli angoli della salvietta, sopra il campione, per evitare che l'acqua fuoriesca, oltre il bordo dell'imbuto. Etichettare l'imbuto con l'ID campione, corrispondente alle note di raccolta dei campi. Scegli eventuali insetti attivi, o altri animali, che possono viaggiare e contaminare i campioni.
Aggiungere più acqua ad ogni imbuto, per immergere l'intero campione. Durante l'incubazione a temperatura ambiente durante la notte, i nematodi attivi si muoveranno attraverso il tessuto e affonderanno sul fondo dell'imbuto. Scrivi l'ID campione di un imbuto, sul fondo di una piastra di verme NGM di sei centimetri, seduto con una macchia di batteri OP50 E.coli.
Rimuovere il coperchio dalla piastra, rimuovere l'imbuto, contenente il campione dal supporto dell'imbuto, e tenerlo in posizione verticale, sopra la piastra a vite senza fine aperta, con una mano. Rilasciare la pressione sul morsetto del tubo con l'altra mano e lasciare che una o due gocce d'acqua cadano dal tubo, sulla piastra di verme accanto al prato batterico. Non appena l'acqua scende dall'imbuto, bloccalo rapidamente di nuovo, per evitare di allagare la piastra NGM.
Per pulire, buttare via il contenuto degli imbuti e lavarli con acqua calda, per il successivo riutilizzo. Osservare i nematodi isolati al microscopio stereo. Oltre ai nematodi, ci saranno occasionalmente piccoli, Oligo kit anellidi, tardigradi, rotiferi e piccoli crostacei.
Per stabilire linee ermafrodite ISO, o linee femminili ISO, trasferire ogni ermafrodita L4 o femmina adulta accoppiata, in una piastra NGM separata di 3,5 centimetri, seduta con OP50. Sterilizzare il prelievo del verme, prima e dopo ogni trasferimento. Infine, avvolgere accuratamente le piastre per i viaggi, con un film di paraffina.
Sull'isola di Barro Colorado Panama, nel 2018, 131 substrati sono stati elaborati con questo metodo. Il 99% dei quali ha prodotto nematodi. Il 34% ha prodotto nematodi Caenorhabditis.
Nella zona di esclusione di Chernobyl in Ucraina, nel 2019, 170 substrati sono stati elaborati con questo metodo. Il 56% dei quali produceva nematodi, nessuno dei quali era Caenorhabditis. Questo metodo funziona perché i nematodi nuotano attraverso la salvietta.
ma il substrato e altri animali rimangono in cima. Molti aspetti di un protocollo possono essere modificati, per utilizzare qualsiasi risorsa disponibile sul campo. I campioni raccolti utilizzando questo metodo, consentono ai ricercatori di affrontare una vasta gamma di domande di biologia della popolazione in colture consolidate per successivi studi di laboratorio.
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