Un modèle murin hétérotopique pour étudier la transplantation laryngée

Des modèles de transplantation laryngée ont été décrits chez la souris et le rat. Les travaux antérieurs de Senior alter se sont concentrés sur la conception d’une méthode plus efficace utilisant les artères carotides donneuses pour l’anastomose, évitant ainsi la nécessité de disséquer les artères thyroïdiennes supérieures. Dans cette vidéo, nous avons décrit cette procédure chez la souris.

Ce modèle de greffe de larynx de souris permet de mener des études immunologiques facilement et à faible coût. Bien que techniquement plus difficile en raison de la plus petite taille des vaisseaux par rapport à un modèle de rat, cette procédure peut être effectuée en environ trois heures si vous vous familiarisez avec les étapes chirurgicales. Une fois l’animal complètement anesthésié, transférez la souris dans la zone de rasage où 1,5% d’isoflurane avec un litre par minute de flux d’oxygène sera délivré via un masque facial pour le maintien de l’anesthésie.

Confirmez la profondeur de l’anesthésie avec un pincement d’orteil. Rasez la poitrine et le cou de la souris jusqu’à la mâchoire et appliquez une crème dépilatoire. Et après 30 secondes, essuyez la crème et transférez la souris dans la zone chirurgicale.

Immobiliser la souris et préparer la zone chirurgicale trois fois avec de la povidone iodée et de l’alcool, puis draper la souris. Faites une petite incision horizontale juste supérieure à l’encoche suprasternale. À l’aide de ciseaux fins, élever la peau bilatéralement à travers cette incision jusqu’à la mandibule et exciser un segment de peau en forme de trapèze.

Extrayez les glandes salivaires bilatérales en utilisant la cautérisation à la partie supérieure où une petite veine traversant la glande est visualisée. Disséquer les muscles sternocléidomastoïdiens bilatéraux des tissus environnants et les rétracter latéralement. Faites une incision médiane sur les muscles de la sangle et excès-les bilatéralement en prenant soin de ne pas endommager la glande thyroïde sous-jacente et en la laissant sur le complexe œsophagien laryngotrachéal ou LTE.

Après cette étape, les artères carotides bilatérales sont visibles. Disséquer circonférentiellement les artères carotides communes au niveau de la clavicule inférieur et au niveau de la bifurcation carotidienne supérieurement. Le nerf vague et la veine jugulaire interne sont disséqués libres des artères carotides et ne sont pas inclus dans la greffe obtenue.

Disséquer les artères carotides internes et externes assez loin pour pouvoir ligaturer et diviser. À l’aide d’une suture en nylon 10-0, ligaturer les artères carotides internes de deux à trois millimètres supérieures à la bifurcation carotidienne. Litruer les artères carotides externes au moins trois millimètres au-dessus du point de ramification de l’artère thyroïdienne supérieure et ligaturer les artères carotides communes au niveau du sternum.

Couper tous les vaisseaux ligaturés bilatéralement. Gardez les pédicules vasculaires au-dessus du complexe LTE pour éviter les dommages accidentels lors d’une dissection ultérieure. Pour éviter toute fuite de gaz ou perte accidentelle d’anesthésie, assurez-vous que l’animal a expiré avant de faire des coupures des voies respiratoires.

Transectez la trachée sous le cinquième anneau trachéal et portez l’incision à travers l’œsophage jusqu’au fascia prévertébral pour libérer le complexe LTE inférieurement. Libérer la trachée et l’œsophage du fascia prévertébral sous-jacent de l’inférieur au supérieur. Créez une pharyngectomie antérieure juste inférieure à la hyoïde.

Porter l’incision jusqu’au fascia prévertébral pour libérer le complexe LTE de manière supérieure. Divisez toutes les attaches lymphoïdes ou de tissu conjonctif restantes entre le complexe LTE et le tissu environnant. Et enfin, retirez la greffe.

Placez le greffon obtenu dans une boîte de Petri stérile et lavez-le avec une solution saline normale pour éliminer les caillots sanguins. Dilatez les artères carotides bilatérales à l’aide de microdilatateurs d’un millimètre. À l’aide d’une aiguille émoussée de calibre 30, injecter environ deux millilitres de solution saline héparinée dans chaque artère carotide pour rincer le greffon.

On verra du sang et une solution saline s’écouler de l’artère carotide controlatérale et des petites extrémités des vaisseaux libres, ce qui confirme des artères thyroïdiennes supérieures intactes. Le greffon peut être laissé dans une solution saline héparinée et une courte pause peut être prise jusqu’à trois heures avant de la transplanter chez le receveur. Préparez la souris receveuse exactement de la même manière que celle décrite pour le donneur après les étapes d’induction de l’anesthésie, de rasage et de préparation chirurgicale.

Injectez à la souris receveuse un analgésique à libération prolongée par voie sous-cutanée 30 minutes avant le début de la chirurgie. À l’aide d’un scalpel, faites une incision médiane du cou s’étendant de la mâchoire au-dessus au sternum inférieur. Élevez la peau du côté gauche et rétractez-la latéralement.

Irriter la glande salivaire gauche en cautérisant les vaisseaux supérieurs comme décrit précédemment. Irriter le tissu adipeux et lymphoïde en divisant tous les vaisseaux visibles avec une cautérisation à basse température. Veiller à ne pas endommager la veine jugulaire externe sous-jacente.

Disséquer la veine jugulaire externe circonférentiellement. Utilisez au moins cinq millimètres de longueur libre du vaisseau pour l’anastomose. Disséquez le muscle sternomastoid et rétractez-le latéralement.

Disséquer circonférentiellement l’artère carotide commune de la clavicule inférieure jusqu’à la bifurcation carotidienne supérieurement. Passez le matériau de fond sous la veine jugulaire externe et appliquez les pinces vasculaires B-3 à double approximation. Placez une suture en nylon 10-0 à travers la paroi antérieure de la veine jugulaire externe à l’emplacement de la monotomie souhaitée et utilisez la suture pour tirer l’intention antérieure du vaisseau.

Couper juste en profondeur à la suture avec des micro-ciseaux pour faciliter la création de la veinotomie à fente unique de taille appropriée et pour s’assurer que la coupe traverse complètement la paroi veineuse. À l’aide d’une aiguille émoussée de calibre 30, rincer l’intérieur de la veine avec une solution saline héparinisée. Placez le complexe LTE du donneur entre l’artère carotide gauche du receveur et la veine jugulaire externe gauche.

Aligner l’extrémité libre de l’artère carotide gauche du donneur vers la veine jugulaire externe gauche du receveur et biseauter l’extrémité à l’aide de ciseaux tranchants. À l’aide de quatre sutures interrompues en nylon 10-0, anastomose l’artère carotide gauche du donneur et la veine jugulaire externe gauche du receveur de bout en bout. Glissez le matériau de fond sous l’artère carotide commune réceptrice et appliquez les pinces de vaisseau A-3 à double approximation.

Créez une artériotomie de la même manière que la veinotomie. Anastomose l’artère carotide droite du donneur à l’artère carotide gauche du receveur d’un bout à l’autre. L’utilisation de six sutures interrompues avec du nylon 10-0 est idéale pour l’anastomose artérielle.

Retirez les pinces du côté veineux. En cas de saignement, appliquez une légère pression avec des pointes de coton. Retirez les pinces sur l’artère et appliquez immédiatement une légère pression avec des pointes en coton.

Quelques saignements sont attendus à l’étape qui s’arrête généralement après une minute avec une légère pression. Vérifiez l’intégrité du flux sanguin dans l’artère de la veine. Avec un flux artériel intact, la pulsation de l’artère carotide donneuse est généralement observée et la glande thyroïde donneuse passera de sa couleur transparente rougie à sa couleur rougeâtre d’origine.

Une coloration rouge des petits vaisseaux du complexe LTE peut également être observée. Fermez l’incision cutanée avec la suture monofilament 5-0 en courant. Appliquez un adhésif cutané sur l’incision.

Injectez un millilitre de solution saline chaude par voie sous-cutanée pour tenir compte de la perte de liquide pendant la chirurgie. Arrêtez l’anesthésie et transférez la souris dans une cage de récupération. Observez la souris sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle soit complètement réveillée pour éviter l’hypothermie.

Le succès chirurgical peut être évalué immédiatement après le retrait des pinces vasculaires. La figure A est représentative d’une chirurgie réussie car le flux sanguin peut être visualisé dans les artères carotides du larynx du donneur et les glandes thyroïdes sont devenues rouges. La figure B est représentative d’une chirurgie infructueuse parce que le flux sanguin ne peut pas être visualisé dans les artères carotides du larynx du donneur et que les glandes thyroïdes sont restées pâles.

Après 15 jours en l’absence d’immunosuppression, la plupart des receveurs n’ont pas de flux sanguin vers la greffe. La perméabilité de l’artère peut être évaluée macroscopiquement en disséquant le complexe laryngotrachéal libre du tissu receveur environnant et en visualisant l’anastomose de bout en bout. Merci. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez comprendre comment transplanter hétérotopiquement un complexe trachéo-œsophagien laryngé d’une souris à une autre en environ trois heures.

Ce modèle réalisable et relativement peu coûteux offre un potentiel important dans l’étude du rôle du système immunitaire dans le rejet du complexe laryngotrachéal, offrant ainsi le potentiel de nouvelles thérapies dans la transplantation d’organes.