Name: Een competent hepatocytenmodel dat de toegang tot het hepatitis B-virus onderzoekt via natrium taurocholaat cotransporterend polypeptide als een therapeutisch doelwit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Leer een methode om anti-hepatitis B-virusverbindingen te screenen die NTCP als therapeutisch doelwit gebruiken. Dit protocol meet bindingsaffiniteit met isotherme titratiecalorimetrie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoeksproject wordt ondersteund door Mahidol University en de Thailand Science Research and Innovation (TSRI) afzonderlijk toegekend aan A. Wongkajornsilp en K. Sa-ngiamsuntorn. Dit werk werd financieel ondersteund door het Office of National Higher Education Science Research and Innovation Policy Council via de Program Management Unit for Competitiveness (subsidienummer C10F630093). A. Wongkajornsilp is een ontvanger van een Chalermprakiat-beurs van de Faculteit der Geneeskunde Siriraj Hospital, Mahidol University. De auteurs willen miss Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science, Mahidol University) bedanken voor haar hulp bij de ITC-techniek.

<ol><li>Levrero, M., Zucman-Rossi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+HBV-induced+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of HBV-induced hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Hepatology. 64 (1), 84-101 (2016).</li>
<li>Kim, K. -H., Kim, N. D., Seong, B. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+development+of+anti-HBV+agents+and+their+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance.</a> Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).</li>
<li>Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+for+hepatitis+B%3A+New+treatment+options+necessitate+reappraisal+of+traditional+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints.</a> Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).</li>
<li>Volz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entry+inhibitor+Myrcludex-B+efficiently+blocks+intrahepatic+virus+spreading+in+humanized+mice+previously+infected+with+hepatitis+B+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus.</a> Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).</li>
<li>Mak, L. -Y., Seto, W. -K., Yuen, M. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+antivirals+in+clinical+development+for+chronic+hepatitis+B+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection.</a> Viruses. 13 (6), 1169(2021).</li>
<li>Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HBV+and+HDV%3A+New+Treatments+on+the+Horizon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">HBV and HDV: New Treatments on the Horizon.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054(2021).</li>
<li>Iwamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+identification+of+hepatitis+B+virus+entry+inhibitors+using+HepG2+cells+overexpressing+a+membrane+transporter+NTCP%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).</li>
<li>Tong, S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+NTCP+as+an+HBV+receptor%3A+the+beginning+of+the+end+or+the+end+of+the+beginning%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning.</a> Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).</li>
<li>Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+HepG2-derived+cells+expressing+cytochrome+P450s+for+assessing+metabolism-associated+drug-induced+liver+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity.</a> Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).</li>
<li>Thongsri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+inhibited+hepatitis+B+viral+entry+through+NTCP+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding.</a> Scientific Reports. 11 (1), 19125(2021).</li>
<li>Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immortalized+hepatocyte-like+cell+line+%28imHC%29+accommodated+complete+viral+lifecycle%2C+viral+persistence+form%2C+cccDNA+and+eventual+spreading+of+a+clinically-isolated+HBV%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV.</a> Viruses. 11 (10), 952(2019).</li>
<li>Watashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin+A+and+its+analogs+inhibit+hepatitis+B+virus+entry+into+cultured+hepatocytes+through+targeting+a+membrane+transporter%2C+sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide+%28NTCP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP).</a> Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).</li>
<li>Kaneko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+tricyclic+polyketide%2C+Vanitaracin+A%2C+specifically+inhibits+the+entry+of+hepatitis+B+and+D+viruses+by+targeting+sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide.</a> Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).</li>
<li>Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+to+evaluate+the+conformation+of+protein+products%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Tools to evaluate the conformation of protein products.</a> Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).</li>
<li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+thermal+shift+assay%3A+a+novel+biophysical+assay+for+in+situ+drug+target+engagement+and+mechanistic+biomarker+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li>
<li>Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycosylation+of+the+Na%2B-taurocholate+cotransporting+polypeptide+%28NTCP%29+determines+its+trafficking+and+stability+and+is+required+for+hepatitis+B+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection.</a> PLoS One. 12 (1), 0170419(2017).</li>
<li>Tsukuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+hepatitis+B+and+D+virus+entry+inhibitors%2C+proanthocyanidin+and+its+analogs%2C+that+directly+act+on+the+viral+large+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins.</a> Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).</li>
<li>Klumpp, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+a+hepatitis+B+virus+replication+inhibitor+bound+to+the+viral+core+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).</li>
<li>Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+the+inhibition+of+NTCP+by+myrcludex+B%5BTitle%5D)+AND+%22JHEP+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B.</a> JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).</li>
<li>Saso, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+to+identify+hepatitis+B+virus+entry+inhibitors+by+AlphaScreen+technology+targeting+the+envelope-receptor+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).</li>
<li>Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+for+characterization+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins.</a> Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+virtual+screening+protocol+for+in+silico+identification+of+potential+thyroid+disrupting+chemicals+targeting+transthyretin%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin.</a> Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).</li>
<li>Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796(2011).</li>
<li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+protein-ligand+interactions%3A+mechanisms%2C+models%2C+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144(2016).</li>
<li>Sureau, C., Salisse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conformational+heparan+sulfate+binding+site+essential+to+infectivity+overlaps+with+the+conserved+hepatitis+B+virus+A-determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant.</a> Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).</li>
<li>Herrscher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+entry+into+HepG2-NTCP+cells+requires+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis.</a> Cellular Microbiology. 22 (8), 13205(2020).</li>
<li>Gripon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+a+human+hepatoma+cell+line+by+hepatitis+B+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).</li>
<li>Mayati, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+polarization+of+human+hepatoma+HepaRG+cells+in+response+to+forskolin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16115(2018).</li>
<li>Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+hepatitis+B+virus+particles+in+Hep+G2+cells+transfected+with+cloned+hepatitis+B+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).</li>
<li>Freyer, M. W., Lewis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry%3A+experimental+design%2C+data+analysis%2C+and+probing+macromolecule%2Fligand+binding+and+kinetic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions.</a> Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).</li>
<li>Srivastava, V. K., Yadav, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSrivastava%2C+VK+%22Data+Processing+Handbook+for+Complex+Biological+Data+Sources%22">Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources</a>. Misra, G. , Academic Press. 125-137 (2019).</li>
<li>Seeger, C., Mason, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium-dependent+taurocholic+cotransporting+polypeptide%3A+a+candidate+receptor+for+human+hepatitis+B+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus.</a> Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).</li>
<li>Seeger, C., Sohn, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+hepatitis+B+virus+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, 216(2014).</li>
<li>Ni, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+and+D+viruses+exploit+sodium+taurocholate+co-transporting+polypeptide+for+species-specific+entry+into+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes.</a> Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).</li>
<li>Chai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+subviral+particles+of+hepatitis+B+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Properties of subviral particles of hepatitis B virus.</a> Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).</li>
<li>Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+interplay+between+uptake+transport+and+CYP3A4+induction+in+micropatterned+cocultured+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes.</a> Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).</li>
<li>Parvez, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-derived+antiviral+drugs+as+novel+hepatitis+B+virus+inhibitors%3A+Cell+culture+and+molecular+docking+study%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Pharmaceutical+Journal%22%5BJournal%5D)">Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study.</a> Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd bij afwezigheid van commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

HBV-infectie wordt geïnitieerd via binding met lage affiniteit aan heparansulfaatproteoglycanen (HSPG's) op hepatocyten25, gevolgd door de binding aan NTCP met daaropvolgende internalisatie via endocytose26. Aangezien NTCP een cruciale receptor is voor HBV-entry, kan targeting hbv-entry klinisch worden vertaald om de novo infectie, moeder-op-kindtransmissie (MTCT) en recidief na levertransplantatie te verminderen. Het onderbreken van virale invoer zou een haalbare ...

Hepatitis B-virus (HBV) infectie wordt wereldwijd beschouwd als een levensbedreigende ziekte. Chronische HBV-infectie is beladen met een risico op levercirrose en hepatocellulair carcinoom1. De huidige anti-HBV-behandeling richt zich vooral op post-virale entry met behulp van nucleos(t)ide analogen (NAs) en interferon-alfa (IFN-α)2,3. De ontdekking van een HBV-entryremmer, Myrcludex B, heeft een nieuw doelwit voor anti-HBV-middelen geïdentificeerd4. De combinatie van entryremmers en NA's bij chronische HBV heeft de virale lading aanzienlijk verminderd in vergelijking met die gericht op virale replicatie alleen 5,6. Het klassieke hepatocytenmodel voor de screening van HBV-entryremmers wordt echter beperkt door lage virale receptorniveaus (natrium taurocholaat cotransporting polypeptide, NTCP). De overexpressie van hNTCP in hepatoomcellen (d.w.z. HepG2 en Huh7) verbetert de HBV-infectiviteit 7,8. Niettemin drukken deze cellijnen lage niveaus van fase I- en II-enzymen uit die geneesmiddelen metaboliseren en vertonen ze genetische instabiliteit9. Hepatocytenmodellen die kunnen helpen bij het richten op verschillende mechanismen van kandidaat-anti-HBV-verbindingen zoals previrale invoer, NTCP-binding en virale entry, zouden de identificatie en ontwikkeling van effectieve combinatieregimes versnellen. De studie voor anti-HBV-activiteit van curcumine heeft de remming van virale entry opgehelderd als een nieuw mechanisme naast onderbreking van de post-virale binnenkomst. Dit protocol beschrijft een gastheermodel voor de screening van anti-HBV-ingangsmoleculen10.
Het doel van deze methode is om kandidaat-anti-HBV-verbindingen te onderzoeken voor virale entry-remming, met name het blokkeren van NTCP-binding en transport. Omdat NTCP-expressie een kritieke factor is voor HBV-invoer en -infectie, hebben we het hepatocytenrijpingsprotocol geoptimaliseerd om NTCP-niveaus11 te maximaliseren. Bovendien kan dit protocol het remmende effect op HBV-entry differentiëren als remming van HBV-aanhechting versus remming van internalisatie. De taurocholzuur (TCA) opnametest werd ook aangepast met behulp van een ELISA-gebaseerde methode in plaats van een radio-isotoop om NTCP-transport12,13 weer te geven. De receptor- en ligandinteractie werd bevestigd door hun 3D-structuren14,15. De remming van de NTCP-functie kan worden geëvalueerd door TCA-opnameactiviteit16 te meten. Deze techniek leverde echter geen direct bewijs van NTCP-binding aan de kandidaat-remmers. Daarom kan de binding worden onderzocht met behulp van verschillende technieken, zoals oppervlakteplasmonresonantie17, ELISA, fluorescentie-gebaseerde thermische verschuivingstest (FTSA) 18, FRET19, AlphaScreen en verschillende andere methoden20. Onder deze technieken is ITC een doelstandaard in bindingsanalyse omdat het warmteabsorptie of -emissie in bijna elke reactie kan observeren21. De bindingsaffiniteit (KD) van NTCP en kandidaat-verbindingen werd direct geëvalueerd met behulp van ITC; deze affiniteitswaarden waren nauwkeuriger dan die verkregen met behulp van het in silico voorspellingsmodel22.
Dit protocol heeft betrekking op technieken in hepatocytenrijping, HBV-infectie en screening op HBV-entryremmer. In het kort werd een hepatocytenmodel ontwikkeld op basis van imHC- en HepaRG-cellijnen. De gekweekte cellen werden binnen 2 weken gedifferentieerd tot volwassen hepatocyten. De upregulatie van NTCP-niveaus werd gedetecteerd met behulp van real-time PCR, western blot en flowcytometrie11. Hepatitis B-virion (HBVcc) werd geproduceerd en verzameld uit HepG2.2.15. De gedifferentieerde imHC of HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) werd profylactisch behandeld met de anti-HBV-kandidaten 2 uur voorafgaand aan de inenting met HBV-virion. De verwachte uitkomst van het experiment was de identificatie van de middelen die cellulaire HBV en infectiviteit verminderen. Anti-NTCP-activiteit werd geëvalueerd met behulp van de TCA-opnametest. NTCP-activiteit kan worden onderdrukt door de agenten die specifiek NTCP hebben gebonden. De ITC-techniek werd gebruikt om de haalbaarheid te onderzoeken van interactieve binding die remmers en hun doeleiwitten kon voorspellen, waarbij de bindingsaffiniteit (KD) van het ligand voor de receptor werd bepaald via niet-covalente interacties van het biomoleculaire complex23,24. KD ≥ 1 × 103 mM staat bijvoorbeeld voor een zwakke binding, KD ≥ 1 × 106 μM voor matige binding en KD ≤ 1 × 109 nM voor een sterke binding. De ΔG is direct gecorreleerd met bindingsinteracties. In het bijzonder is een reactie met negatieve ΔG een exergonische reactie, wat aangeeft dat binding een spontaan proces is. Een reactie met een negatieve ΔH geeft aan dat de bindingsprocessen afhankelijk zijn van waterstofbinding en Van der Waalskrachten. Zowel TCA-opname- als ITC-gegevens kunnen worden gebruikt om te screenen op anti-HBV-entry agents. De uitkomsten van deze protocollen kunnen een basis vormen voor niet alleen anti-HBV-screening, maar ook voor de interactie met NTCP zoals beoordeeld door bindingsaffiniteit en transportfunctie. Dit artikel beschrijft de voorbereiding en karakterisering van gastheercellen, experimenteel ontwerp en evaluatie van de anti-HBV-ingang samen met de NTCP-bindingsaffiniteit.

<table><tbody><tr><td>Cellijnen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HepaRG Cellen, Cryopreserved</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HPRGC10</td><td></td></tr><tr><td>Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cellijn</td><td>Merck</td><td>SCC249</td><td></td></tr><tr><td>Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde Fosfaatbufferoplossing</td><td>FUJIFLIM Wako chemical</td><td>163-20145</td><td></td></tr><tr><td>BD Perm/Wash buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>554723</td><td>Perm/Wash buffer</td></tr><tr><td>Cyclosporine A</td><td>abcam</td><td>59865-13-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>8 mM</td></tr><tr><td>G 418 disulfaat zout</td><td>Merck</td><td>108321-42-2</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail&nbsp; EDTA-vrij (100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78425</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>illustraTM RNAspin Mini RNA isolatiekits</td><td>GE Healthcare</td><td>25-0500-71</td><td></td></tr><tr><td>illustra RNAspin Mini RNA isolatiekit</td><td>GE Healthcare</td><td>25-0500-71</td><td></td></tr><tr><td>ImProm-II Reverse Transcriptie Systeem</td><td>Promega</td><td>A3800</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST qPCR Kit</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4600</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X Concentrator</td><td>Takara bio</td><td>PT4421-2</td><td>concentrator</td></tr><tr><td>Luminata crescendo Western HRP substraat</td><td>Merck</td><td>WBLUR0100</td><td></td></tr><tr><td>Master Mix (2x) Universeel</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4600</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin DNA extractiekit</td><td>macherey-nagel</td><td>1806/003</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Merck</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleenglycol 8000</td><td>Merck</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant NTCP</td><td>Cloud-Clone</td><td>RPE421Hu02</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis Buffer (10x)</td><td>Merck</td><td>20-188</td><td></td></tr><tr><td>TCA</td><td>Sigma</td><td>345909-26-4</td><td></td></tr><tr><td>TCA Elisa kit</td><td>Mybiosource</td><td>MB2033685</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Verdunnen tot 0,125%</td></tr><tr><td>Antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp; Anti-NTCP1 antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab131084</td><td>1:100 verdunning</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp; Anti-GAPDH antilichaam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM4300</td><td>1:200.000 verdunning</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp; HRP-geconjugeerd geitenanti-konijn antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab205718</td><td>1:10.000 verdunning</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp; HRP geitenanti-muis secundair antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab97023</td><td>1:10.000 verdunning</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp; Geitenanti-Konijn IgG secundair Antilichaam, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td>1:500 verdunning</td></tr><tr><td>Reagens samenstelling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1&deg; Antilichaam verdunningsbuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 1x TBST</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 3% BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906-100G</td><td>Werkconcentratie: 3%</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Natriumazide</td><td>Sigma</td><td>199931</td><td>Werkconcentratie: 0,05%</td></tr><tr><td>Hepatocyt Groeimedium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; DME/F12</td><td>Gibco</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 10% FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 1% Pen/Strep</td><td>HyClon</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 1% GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Levercel rijpingsmedium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Williams&rsquo; E medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4125-1L</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 10% FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 1% Pen/Strep</td><td>HyClon</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 1% GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 5 &micro;g/mL&nbsp; Insuline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>91077C-100MG</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 50 &micro;M hydrocortison</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888-1g</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 2% DMSO</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3672-250ml</td><td></td></tr><tr><td>IF Blokkeer oplossing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 1x PBS</td><td>Gibco</td><td>21300-058</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 3% BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906-100G</td><td>Werkconcentratie: 3%</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 0,2% Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Werkconcentratie: 0,2%</td></tr><tr><td>RIPA Lysis Buffer Oplossing</td><td>Merck</td><td>20-188</td><td>Eindconcentratie: 1X</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Thermo Scientific</td><td>78425

een competent hepatocytenmodel dat de toegang tot het hepatitis b-virus onderzoekt via natrium taurocholaat cotransporterend polypeptide als een therapeutisch doelwit

A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target

Hepatitis B-virus (HBV) infectie is beschouwd als een cruciale risicofactor voor hepatocellulair carcinoom. De huidige behandeling kan alleen de virale lading verminderen, maar niet resulteren in volledige remissie. Een efficiënt hepatocytenmodel voor HBV-infectie zou een levensechte virale levenscyclus bieden die cruciaal zou zijn voor de screening van therapeutische middelen. De meeste beschikbare anti-HBV-middelen richten zich op levenscyclusstadia na virale binnenkomst, maar niet vóór virale binnenkomst. Dit protocol beschrijft de generatie van een competent hepatocytenmodel dat in staat is om te screenen op therapeutische middelen gericht op pre-virale entry en post viral entry lifecycle stadia. Dit omvat de targeting van natrium taurocholaat cotransporting polypeptide (NTCP) binding, cccDNA-vorming, transcriptie en virale assemblage op basis van imHC of HepaRG als gastheercellen. Hier gebruikte de HBV-entry-inhibitietest curcumine om HBV-bindings- en transportfuncties via NTCP te remmen. De remmers werden geëvalueerd op bindingsaffiniteit (KD) met NTCP met behulp van isotherme titratiecalorimetrie (ITC) - een universeel hulpmiddel voor HBV-geneesmiddelenscreening op basis van thermodynamische parameters.

Hepatische rijpingskenmerken werden waargenomen, waaronder binucleated cellen en polygonaalvormige morfologie (figuur 1), vooral in het gedifferentieerde stadium van imHC (figuur 1A). Een grote toename van NTCP-expressie werd gemeten in d-HepaRG en d-imHC bij respectievelijk 7-voudig en 40-voudig (figuur 1B). De sterk geglycosyleerde vorm van NTCP, waarvan wordt gepostuleerd dat deze vatbaar is voor HBV-entry, werd meer gedetecteerd...

We presenteren een protocol om anti-hepatitis B-virus (HBV) verbindingen te screenen gericht op pre- en post-virale entry lifecycle stadia, met behulp van isothermische titratie calorimetrie om bindingsaffiniteit (KD) te meten met gastheer natrium taurocholaat cotransporting polypeptide. Antivirale werkzaamheid werd bepaald door de onderdrukking van virale levenscyclusmarkers (cccDNA-vorming, transcriptie en virale assemblage).

Een competent hepatocytenmodel dat de toegang tot het hepatitis B-virus onderzoekt via natrium taurocholaat cotransporterend polypeptide als een therapeutisch doelwit

Hepatitis B virus (HBV) infection has been considered a crucial risk factor for hepatocellular carcinoma. Current treatment can only lessen the viral load ...

Dit protocol is ontworpen om te verifiëren of een kandidaat-anti HBV-verbinding de virale toegang remt, vooral door NTCP-binding te blokkeren. Deze techniek is bedoeld om te onderzoeken of HBV-invoer of een eerste stap van infectie kan worden onderbroken door een kandidaat-verbinding. De procedure wordt gedemonstreerd door Piyanoot Thongsri, een PSP-student uit mijn laboratorium.Om te beginnen met de meting van het natrium taurocholaat co-transporterende polypeptide, of NTCP, incubeer de volwassen hepatocyten met acht mill of meer ethyleendiaminetetra-azijnzuur of EDTA gedurende 15 minuten. Verzamel celpellets en fixeer de hepatocyten door gedurende 15 minuten 300 microliter 3,7% paraformaldehyde in PBS toe te voegen. Breng vervolgens de celsuspensie over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter om ze gedurende 10 minuten bij 300 G en 25 graden Celsius te centrifugeren.Was de cellen tweemaal met 700 microliter PBS met 1% foetaal runderserum of FBS in de centrifuge gedurende 10 minuten zoals eerder beschreven. Vervolgens permeabiliseer de cellen met 300 microliter van 0,05% Triton X 100 in PBS bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Geef na de centrifugatie drie wasbeurten van elk één minuut met behulp van 700 microliter PBS met 1% FBS.Incubeer de cellen gedurende 30 minuten op vier graden Celsius met het primaire antilichaam tegen NTCP in een verhouding van één tot 100, gevolgd door drie wasbeurten met permanentwasbuffer en centrifugatie. Kleur de cellen met een secundair antilichaam geconjugeerd aan Alexa Fluor 488 gedurende 30 minuten op vier graden Celsius en herhaal drie wasbeurten van permanentwasbuffer gedurende elk één minuut. Na centrifugeren bij 300 G, resuspenseren de celpellet met 200 microliter PBS met 1% FBS.Selecteer in de software de meetparameters voor flowcytometrische analyse, waaronder FSC, SSC, FITC of PE. Stel automatische compensatieaanpassing in en neem de compensatiebesturingselementen op zoals uitgelegd in het manuscript. Voer vervolgens het niet-gekleurde monster uit met een gemiddeld vloeibaar debiet van 60 microliter per minuut. Pas de voorwaartse verstrooiings- en zijverstrooiingsdrempel aan totdat ze de interessante celpopulatie bedekken.Markeer het poortgebied in dit gebied en pas alle compensatiecontroles toe. Stel de fotovermenigvuldigingsbuis of PMT-fluorescentie in met behulp van de niet-gekleurde regeling en pas de PMT-spanning van FITC of PE in het negatieve kwadrant aan. Voer het positief gekleurde monster uit en pas FITC of PE aan in de positieve kwadrantschaal.Voer de niet-gekleurde, FITC-gekleurde of PE-besturingselementen uit, bereken de compensatie en pas deze toe op de monsterinstellingen. Voer vervolgens het hepatocytenmonster uit om het NTCP-niveau te meten. Begin vervolgens met het analyseren van de gekleurde hepatocyten door serieel te selecteren op BD FACSuite-vensters, de besturingsbuis en vervolgens het tabblad gegevensbronnen.Wacht tot de onbewerkte gegevens worden weergegeven. Klik vervolgens op het werkbladtabblad aan de rechterkant op de ellipspoortknop, selecteer de celpopulatie en SSC en de FSC-dot plot met behulp van de muiscursor. Wacht vervolgens tot de cirkel P1 verschijnt.Klik op de intervalpoortknop en markeer het gebied in het met fluoresceïneisothiocyanaat bevlekte histogram. Vanaf de hoogste fluorescentie-intensiteitswaarde aan de rechterkant. De lijn P2 verschijnt op het scherm.Klik op de experimentbuis en merk op dat de gegevens op het werkbladtabblad veranderen. Klik op de knop Statistieken en vervolgens op de lege ruimte en het werkblad. Observeer vervolgens de statistische waarden van de natrium taurocholaat co-transporterende polypeptide populatie.Aspirateer het medium uit de 100% confluente MHC-putplaten en voeg vier micromolaire ciclosporine A toe, verdund met William's E Medium gedurende twee uur. Aspirateer vervolgens de kandidaat-hepatitis B-virusinvoerremmer om deze te vervangen door één milliliter Williams E Medium met 4% polyethyleenglycol. Incubeer vervolgens het kweekmedium met hepatitis B-virusdeeltjes bij een veelvoud aan infectie van 100 per put gedurende 18 uur bij 37 graden Celsius.Gooi vervolgens het supernatant weg bij twee milliliter koude PBS en draai voorzichtig om het oude medium met ongebonden hepatitis B-virus af te spoelen. Na het kweken van de cellen met twee milliliter van complete William's E Medium gedurende zeven dagen, was de cellen met PBS en fixeer ze met 3,7% paraform aldehyde en PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Incubeer de geïnfecteerde cellen sequentieel met IF-blokkerende oplossing gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur in het primaire antilichaam bij één tot 200 verdunning in de blokkerende oplossing 's nachts bij vier graden Celsius.Geef vervolgens drie wasbeurten van elk één minuut met behulp van een wasoplossing voordat u de cellen met het secundaire antilichaam in één tot 500 verdunning gedurende één uur bij kamertemperatuur incubeert. Monteer het monster na drie keer wassen met een antivervagingsmontagemedium met DAPI en bedek het met een glazen afdekslip. Met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met DAPI- en PE-filters detecteert het fluorescentiesignaal met een 20 x objectieve lens om de anti HBV-entry-activiteit van de kandidaat-verbindingen te bepalen.Bereid voor de celbindingstest de cellen voor zoals eerder aangetoond en incubeer ze met hepatitis B-virusdeeltjes bij vier graden Celsius gedurende twee uur. Nadat u het medium hebt weggegooid, spoelt u de cellen af met twee milliliter koude PBS met een zachte werveling. Oogst vervolgens de geïnfecteerde cellen met behulp van een celschraper en verstoor de cellen met lysisbuffer.Breng het cellysaat over naar een verzamelbuis om het totale DNA te extraheren met polymerasekettingreactie met behulp van de temperatuuromstandigheden die in het manuscript worden beschreven. Na het bereiden van de cellen zoals eerder aangetoond, incubeer de hepatocyten met de natrium taurocholzuuroplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, aspirateer de oplossing en was de cellen driemaal met koude HEPES. Voeg vervolgens 300 tot 500 microliter koude HEPES toe om de cellen met celschrapers op ijs te oogsten.Homogeniseer de cellen door ultrasoon geluid bij 20 kilohertz gedurende 20 seconden en incubeer gedurende vijf minuten op ijs. Verzamel na centrifugatie bij 10.000 G het supernatant en evalueer de intracellulaire taurocholzuurconcentratie met behulp van een taurocholzuur ELISA-testkit. Om de cellen en spuit in de isothermische titratiecalorimetrie of het ITC-instrument te wassen, start u de ITC-software.Selecteer onder het tabblad Experiment uitvoeren de microkalkmethode voor 19 injectiepunten ITCM en klik op Openen. Wanneer een nieuw venster wordt geopend, klikt u op het tabblad Reinigen en selecteert u in het venster reinigingsmethode de wasknop voor de celreinigingsmethode en de spoelknop voor de spuitreinigingsmethode. Klik op Volgende en volg de instructies op het scherm.Nadat u het voorbeeld in de ITC hebt geladen, klikt u op de laadknop onder het tabblad Experiment uitvoeren. Klik vervolgens op Volgende en volg de video-instructies totdat deze laadstap is voltooid. Vul met behulp van een spuit de referentiecel met een oplossingsbuffer in de monstercel met 15 micromolaire NTCP in de buffer.Verwijder de overtollige oplossing en vul de spuit met een 150 Micromolaire Curcumin Ligand-oplossing, waardoor luchtbellen worden vermeden. Voer het voorbeeld uit door op de knop Uitvoeren onder het tabblad Experiment uitvoeren te klikken. De experimentele informatie en instellingen worden aan de linkerkant weergegeven.Voer de ligandeiwitconcentraties en temperatuurgegevens in. Klik op start om het injectieproces uit te voeren. Wacht 1,4 uur totdat de eiwitligandinteractie is voltooid.Zodra de injectie is voltooid, selecteert u de gemarkeerde analyseknop om de onbewerkte gegevens te analyseren met behulp van de analysesoftware. Klik vervolgens op overzicht om de onbewerkte gegevens weer te geven en kies het aanpassingsmodel als één set bindingsplaatsen. Leverrijpingskenmerken werden waargenomen, waaronder binucleated cellen en polygonaal gevormde morfologie, vooral in het gedifferentieerde stadium van MHC.Een grote toename van NTCP-expressie werd waargenomen in gedifferentieerde HepaRG en gedifferentieerde MHC. De sterk geglycosyleerde vorm van NTCP werd meer gedetecteerd in gedifferentieerde MHC dan in gedifferentieerde HepaRG. De NTCP-niveaus waren hoger in gedifferentieerde MHC-cellen dan in de ongedifferentieerde cellen.Virusimmunofluorescentiekleuring evalueerde de anti HBV-entry-activiteiten op dag zeven na infectie en het niveau van virusbinding op de celoppervlakreceptor werd geëvalueerd door real-time polymerasekettingreactie. Taurocholzuuropnameanalyse suggereerde dat de punitieve remmende activiteit van kandidaat-verbindingen de hepatitis B-virusbinding via NTCP verminderde. De colorimetrische verandering werd gedetecteerd met continue injecties in de monstercel.Een standaard niet-lineaire kleinste kwadratenregressie werd uitgezet op basis van één bindingsplaats die goed bij de gegevens paste. De ononderbroken lijn gaf aan dat de beste fit was voor de experimentele waarden voor SBB-binding als a en dat cellen en hepatitis B-virale deeltjes worden geïncubeerd bij vier graden Celsius. Taurocholzuur update kan worden geëvalueerd met behulp van de radioactieve techniek.Het niveau van radioactief taurocholzuur kan worden gekwantificeerd met behulp van een vloeistofsimulatieteller. Deze techniek is eenvoudig en snel te screenen op virale invoer in onderzoeksactiviteit van elk antiviraal regime dat infectie of herinfectie zou helpen voorkomen.

a-competent-hepatocyte-model-examining-hepatitis-b-virus-entry

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Er zijn twee methoden van Heterokaryon vorming van HCV Beperking Factoren Ontdek

The video demonstrates an assay using human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived CD8+ T cells to inhibit hepatitis B virus (HBV) replication in mice. These T cells, engineered with HBV-specific receptors, are transferred into transgenic mice. Replication-competent HBV genome plasmids are then injected directly into the liver, enabling viral DNA uptake. Once viral antigens are expressed and presented by hybrid MHC-I molecules, the engineered T cells recognize and bind to these complexes.

Suppressing Hepatitis B Virus Replication Using Viral Antigen-Specific T Cells

Hier beschrijven we een nieuw ontwikkelde hepatitis B-virus (HBV) reportersysteem de vroege stadia van de levenscyclus HBV controleren. Deze vereenvoudigde in vitro systeem zal helpen bij het screenen van anti-HBV middelen met een high-throughput strategie.

Ontwikkeling van een Hepatitis B Virus reportersysteem de vroege stadia van de replicatiecyclus Monitor

Het doel van dit protocol is bedoeld als een stapsgewijze handleiding om uit te voeren van de experimenten van de 3-D "lever-on-a-chip" infectie met het hepatitis B-virus.

"Lever-on-a-Chip" culturen van primaire hepatocyten en Kupffer cellen voor Hepatitis B-virusinfectie

Dit protocol is bedoeld voor het beschrijven van varkens hepatocyte isolatie en ex vivo gene levering om te genezen van modellen van metabole ziekten via cel autologe transplantatie. Hoewel dit model geniet van unieke voordelen die succesvolle therapie gunst, is de toepassing een relevante Stichting bijkomende ziekten en aanduidingen aan te pakken.

Lentivirale Vector-gemedieerde gentherapie van hepatocyten Ex Vivo voor autologe transplantatie in varkens

Dit protocol beschrijft het gebruik van één keten MHC klasse I complexen te onderzoeken van de moleculaire interacties in menselijke CD8 + T cel activatie: generatie van gemanipuleerde antigeen presentatie van cellen uiten van één keten bouwt, cultuur van menselijke CD8 + T cel kloon en T-cel activatie experimenten.

Gebruik van één keten MHC technologie te onderzoeken van Co-agonisme in menselijke CD8 + T cel activatie

Hier is een protocol voor de effectieve onderdrukking van replicatie van het hepatitis B-virus (HBV) in muizen door gebruik te maken van de adoptieve celoverdracht (ACT) van stamcel afkomstige virale antigeen (AG)-specifieke T-lymfocyten. Deze procedure kan worden aangepast voor mogelijke op ACT gebaseerde immunotherapie van HBV-infectie.

Stamcel afkomstige virale AG-specifieke T-lymfocyten onderdrukken HBV-replicatie bij muizen

Hier presenteren we een methode voor het screenen van anti-hepatitis B-virale middelen die de HBX-DDB1-interactie remmen met behulp van een split plaats-testsysteem. Dit systeem maakt een eenvoudige detectie van eiwit-eiwit interacties mogelijk en is geschikt voor het identificeren van remmers van dergelijke interacties.

Identificeren van remmers van de HBx-DDB1 interactie met behulp van een split Luciferase assay systeem

Hier beschreven is een effectieve methode voor het produceren van hoge virale titer voorraden van hepatitis E-virus (HEV) om efficiënt te infecteren hepatoma cellen. Met de gepresenteerde methode kunnen zowel niet-omhulde, als omhulde virale deeltjes worden geoogst en gebruikt voor het inenten van verschillende cellijnen.

Een cel cultuur model voor de productie van hoge titer hepatitis E virus voorraden

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor hepatitis B-virus (HBV) infectie in nieuwe 293T cellen (293T-NE-3NRs, uitdrukken van menselijke NTCP, HNF4α, RXRα en PPARα) en traditionele levercellen (HepG2-NE, uitdrukken van menselijke NTCP).

Modellering hepatitis B-virusinfectie in niet-leverloze 293T-NE-3NRs-cellen

Leer een methode om anti-hepatitis B-virusverbindingen te screenen die NTCP als therapeutisch doelwit gebruiken. Dit protocol meet bindingsaffiniteit met isotherme titratiecalorimetrie.

Een competent hepatocytenmodel dat de toegang tot het hepatitis B-virus onderzoekt via natrium taurocholaat cotransporterend polypeptide als een therapeutisch doelwit (Video) | JoVE Journal

Een competent hepatocytenmodel dat de toegang tot het hepatitis B-virus onderzoekt via natrium taurocholaat cotransporterend polypeptide als een therapeutisch doelwit

Meer video's verkennen