Name: נטרול יחסי הגומלין בין תאי הרג טבעיים לבין נוירונים של נוסיצפטורים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: חקור את האינטראקציה בין תאי NK לנוירוני נויצפטורים בשיטת תרבית משותפת. שיטה זו מאפשרת לבחון כיצד נוירונים אלו מווסתים את פעילות תאי ה-NK נגד גידולים ואת תפקידם בהסרת נוירונים פגועים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר New Frontiers in Research (NFRFE201901326), המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (162211, 461274, 461275), הקרן הקנדית לחדשנות (37439), תוכנית קתדרה למחקר בקנדה (950-231859), המועצה למחקר במדעי הטבע וההנדסה של קנדה (RGPIN-2019-06824), ו- Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380).

הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מונטריאול (#22053, #22054) אישרו את כל ההליכים לבעלי חיים. ראה טבלה 1 לקבלת רשימה של פתרונות והרכבם וטבלת החומרים לקבלת רשימה של חומרים, ציוד וריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.
1. בידוד תאי NK, תרבית וגירוי
<ol><li>צור נוירון nociceptor שלם (שליטה littermate; TRPV1 wt::D TA fl/wt) ועכברים אבלטים (TRPV1 cre::D TA fl/wt) על ידי חציית עכברי רעלן לוקס-סטופ-לוקס-דיפתריה (DTA fl/fl) עם עכברי TRPV1 cre/wt.</li>
	<li>באמצעות שאיפת CO2, הרדימו עכבר תמים (TRPV1 wt::D TAfl/wt).</li>
	<li>אסוף את הטחול בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכיל 500 μL של תמיסת מלח סטרילית עם אגירת פוספט (PBS).</li>
	<li>הומוגניזציה של הטחול באמצעות מזיק.</li>
	<li>לדלל את התאים עם 1 מ"ל של PBS סטרילי.</li>
	<li>מסננים את התערובת דרך מסננת תאים בקוטר 50 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל.</li>
	<li>טען את עוצמת הקול (10 מ"ל) עם PBS סטרילי.</li>
	<li>לאסוף 10 μL ולספור את התאים באמצעות hemocytometer.</li>
	<li>צנטריפוגה של התאים (500 × גרם, 5 דקות) ולהסיר את supernatant.</li>
	<li>השהה את התאים בריכוז של 108 תאים למ"ל בתוספת RPMI 1640 בינונית.</li>
	<li>עקוב אחר הוראות היצרן לטיהור מגנטי של תאי NK בטחול באמצעות ערכת בידוד תאי NK של עכבר. אשר את טוהר תאי NK באמצעות ציטומטריה של זרימה11.</li>
	<li>לאסוף 10 μL ולספור את התאים באמצעות hemocytometer.</li>
	<li>צנטריפוגה של התאים (500 × גרם, 5 דקות) ולהסיר את supernatant.</li>
	<li>יש להשעות את תאי ה-NK בתרבית RPMI 1640 בתוספת (המכילה IL-2 ו-IL-15).</li>
	<li>תרבית 2 × 106 תאי NK / מ"ל בצלחת תחתית U 96 היטב במשך 48 שעות.</li>
</ol>2. בידוד ותרבית נוירונים DRG
<ol><li>ב-24 שעות לפני סיום גירוי תאי ה-NK (שלב 1.15), צפו צלחת של 96 באר עם 100 μL/באר של למינין (1 ng/mL) ודגרו במשך 45 דקות (37 °C).</li>
	<li>לאחר הדגירה, הסר את התמיסה ואפשר לבארות להתייבש באוויר בארון בטיחות ביולוגית.</li>
	<li>באמצעות שאיפת CO2, להרדים נוירון nociceptor שלם (בקרת פסולת; TRPV1 wt::D TA fl/wt) או עכברים אבלטים (TRPV1cre::D TAfl/wt). הערה: שאיפת CO2 עדיפה על פריקת צוואר הרחם מכיוון שהיא מונעת הפרעה לעצבי עמוד השדרה המחוברים ל- DRG.</li>
	<li>הצמידו את העכבר על הלוח במצב נוטה, הרימו את העור וחתכו את העור לאורך העמוד הגבי. עיין ב- Perner et al. לסרטון מפורט12.</li>
	<li>חותכים את המפרק המותני ומפרידים את העצה מעמוד השדרה המותני באמצעות מספריים.</li>
	<li>הפרד את עמוד השדרה על ידי חיתוך השרירים והצלעות משני צידי עמוד השדרה בכיוון הגולגולת עד להגעה לבסיס הגולגולת.</li>
	<li>באמצעות מספריים, לחתוך את עמוד השדרה במפרק atlanto-occipital.</li>
	<li>הסר שריר ורקמת שומן מעמוד השדרה.</li>
	<li>הצמד ופתח את עמוד השדרה כדי להסיר את חוט השדרה ולקבל גישה ל- DRG. חפשו את ה-DRG בפורמינה הבין-חולייתית המחוברת לחוט השדרה דרך השורש הגבי אך מופרדת מקרום המוח.</li>
	<li>קצור את ה-DRGs לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל מלא ב-10 מ"ל של תוסף DMEM קר כקרח.</li>
	<li>צנטריפוגה את ההכנה (200 × גרם, 5 דקות, טמפרטורת החדר) ולהסיר את supernatant.</li>
	<li>יש להוסיף 250 μL של PBS המכיל קולגןאז IV (1 מ"ג/מ"ל) ו-Dispase II (2.4 U/mL).</li>
	<li>דגירה של DRG עם תמיסת קולגן IV/Dispase II (C/D) (80 דקות, 37 מעלות צלזיוס, תסיסה קלה). בעת איגום גרעינים ממספר עכברים, יש לשמור על יחס של 125 μL של תמיסת C/D לכל גנגליון.</li>
	<li>כדי להשבית את האנזימים, יש להוסיף 5 מ"ל של תוסף DMEM בינוני.</li>
	<li>צנטריפוגה את התמיסה (200 × גרם, 5 דקות) ולהסיר בעדינות את supernatant באמצעות פיפטה.</li>
	<li>כדי למנוע אובדן תאים לא רצוי, השאירו ~ 100 μL של הסופר-נטנט.</li>
	<li>יש להוסיף 1 מ"ל של תוסף DMEM בינוני.</li>
	<li>באמצעות אקדח פיפטה ושלושה פיפטות פסטר זכוכית בגדלים הולכים ופוחתים, טריטוראט בעדינות (~ 10 למעלה / למטה לכל גודל פיפטה פסטר) את ה- DRG להכנת תא יחיד.</li>
	<li>בארון בטיחות ביולוגית, יש לדלל אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS סטרילי לריכוז סופי של 15%. אחסן 1 מ"ל aliquots ב -20 °C.</li>
	<li>צור גרדיאנט BSA בצינור חרוטי של 15 מ"ל על ידי הוספת 2 מ"ל של PBS סטרילי וחלוקה איטית של 1 מ"ל של 15% תמיסת BSA בתחתית הצינור. הימנע מהפרעה לשיפוע על ידי הסרה עדינה של הפיפטה.</li>
	<li>באמצעות פיפטה P200, לאט לאט פיפטה את תרחיף הגרעינים המשולשים (המכיל את הנוירונים) על צד הצינור לתוך השיפוע.</li>
	<li>צנטריפוגה של שיפוע BSA המכיל נוירון (200 × גרם, 12 דקות, טמפרטורת החדר). הגדר את ההאצה וההאטה של הצנטריפוגה למהירות המינימלית. הערה: לאחר צנטריפוגה, הנוירונים יהיו בתחתית הצינור בעוד שפסולת התאים תילכד בשיפוע BSA.</li>
	<li>יש להסיר בעדינות את כל הסופרנטנט באמצעות פיפטה.</li>
	<li>השהה את התאים ב-500 μL של Neurobasal.</li>
	<li>צלחת 104 נוירונים לכל באר (200 μL של נוירובסל/באר) בצלחת 96 באר מצופה למינין, בעלת תחתית שטוחה. הערה: בממוצע, חוקר יוכל למלא ~ 8 בארות לכל עכבר.</li>
	<li>תרבית את הנוירונים (37 מעלות צלזיוס, לילה) כדי לאפשר התקשרות.</li>
</ol>3. תרבות משותפת וציטומטריה של זרימה
<ol><li>לאט לאט להסיר את neurobasal מתרבית נוירון.</li>
	<li>לאחר גירוי של 48 שעות עם IL-2 ו-IL-15 (ראה שלבים 1.14-1.15), יש להשעות את תאי ה-NK ולהוסיף 10 תאי NK5 /באר לתרבית הנוירונים (צלחת תחתונה שטוחה 96 היטב). הערה: בממוצע, החוקר יוכל למלא ~ 6 בארות לכל עכבר.</li>
	<li>תרבית משותפת של התאים בתוספת MX נוירובסאלי (37 °C, 48 שעות).</li>
	<li>לאסוף את התאים, לשטוף עם PBS (3x), צנטריפוגה (500 × גרם, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס).</li>
	<li>השליכו את הסופרנאטנט והכתימו את התאים ב-Viability Dye eFlour-780 (1:1,000, 15 דקות, 4 מעלות צלזיוס).</li>
	<li>לאסוף את התאים, לשטוף עם PBS (3x), צנטריפוגה (500 × גרם, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס).</li>
	<li>חסום אתרים לא ספציפיים בתאים באמצעות CD16/32 (1:100, 15 דקות, 4 °C).</li>
	<li>לאסוף את התאים, לשטוף עם PBS (3x), צנטריפוגה (500 × גרם, 5 דקות, 4 °C).</li>
	<li>כתם (15 דקות, 4 מעלות צלזיוס) התאים עם BV421 anti-NK-1.1 (1:100), פלואורסצין איזותיוציאנט (FITC) אנטי-NKp46 (1:100), ופיקואריתרין (PE) אנטי-GM-CSF (1:100).</li>
	<li>לאסוף את התאים, לשטוף עם PBS (3x), צנטריפוגה (500 × גרם, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס).</li>
	<li>יש להשליך את הסופר-נטנט, לתלות מחדש את התאים במאגר FACS (500 μL) ואת האימונופנוטיפ של תאי ה-NK על ידי ציטומטריה של זרימה11. ראו איור 1A עבור אסטרטגיית ה-gating.</li>
</ol>

<ol><li>Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+dorsal+root+ganglia+and+primary+sensory+neurons+for+the+treatment+of+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Targets%22%5BJournal%5D)">Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).</li>
<li>Baral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptor+sensory+neurons+suppress+neutrophil+and+gammadelta+T+cell+responses+in+bacterial+lung+infections+and+lethal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia.</a> Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).</li>
<li>Binshtok, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptors+are+interleukin-1beta+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nociceptors are interleukin-1beta sensors.</a> Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).</li>
<li>Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuro-immune+regulation+of+mucosal+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuro-immune regulation of mucosal physiology.</a> Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).</li>
<li>Samad, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-mediated+induction+of+Cox-2+in+the+CNS+contributes+to+inflammatory+pain+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity.</a> Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).</li>
<li>Godinho-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-entrained+and+brain-tuned+circadian+circuits+regulate+ILC3s+and+gut+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis.</a> Nature. 574, 254-258 (2019).</li>
<li>Talbot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding-dependent+VIP+neuron-ILC3+circuit+regulates+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier.</a> Nature. 579, 575-580 (2020).</li>
<li>Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ligands+for+the+NKG2D+activating+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor.</a> Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).</li>
<li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+or+adaptive+immunity%3F+The+example+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331, 44-49 (2011).</li>
<li>Davies, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Killer+Cells+Degenerate+Intact+Sensory+Afferents+following+Nerve+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury.</a> Cell. 176, 716-728 (2019).</li>
<li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2, 100333(2021).</li>
<li>Goswami, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+mouse+TRPV1-lineage+neurons+revealed+by+RNA-Seq+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis.</a> Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).</li>
<li>Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1-lineage+neurons+are+required+for+thermal+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation.</a> EMBO J. 30, 582-593 (2011).</li>
<li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+natural+killer+cell+functions+by+capsaicin+through+a+direct+and+TRPV1-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism.</a> Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Davies et al.11 מצאו שתאי עצב פצועים מווסתים את RAE1. באמצעות מגע בין תאים, תאי NK המבטאים NKG2D הצליחו לזהות ולחסל נוירונים RAE1+ , אשר בתורם מגבילים כאב כרוני11. בהתחשב בכך שתאי NK מבטאים גם קולטני נוירופפטידים שונים, וכי נוירופפטידים אלה ידועים ביכולותיהם האימונומודולטוריות, נראה חשוב יותר ויותר לחקור את האינטראקציה בין תאי NK לנוירונים nociceptor במבחנה. כאן פיתחנו פרוטוקול פשוט של תרבית משותפת המאפשר לחוקרים לחקור כיצד תאי עצב שולטים בתפקוד...

גופי התאים של נוירונים חושיים מקורם בגרעיני השורש הגבי (DRG). ה- DRG ממוקמים במערכת העצבים ההיקפית (PNS), בין הקרן הגבית של חוט השדרה לבין קצות העצבים ההיקפיים. האופי הפסאודו-חד קוטבי של נוירוני DRG מאפשר העברת מידע מהענף ההיקפי, אשר innervates את רקמת המטרה, אל הענף המרכזי, אשר נושא את המידע הסומטוסנסורי אל חוט השדרה1. באמצעות קולטני תעלות יונים מיוחדים, נוירונים מסדר ראשון חשים איומים הנשקפים מפתוגנים, אלרגנים ומזהמים2, מה שמוביל לזרם הקטיונים (Na+, Ca2+) וליצירת פוטנציאל פעולה 3,4,5.
תאי עצב אלה גם שולחים פוטנציאל פעולה אנטי-דרומי לכיוון הפריפריה, שם התרחשה חישת הסכנה הראשונית, מה שמוביל לשחרור מקומי של נוירופפטידים 1,4. לכן, נוירונים nociceptor לשמש מנגנון הגנה, התראה המארח על סכנה סביבתית 4,5,6,7.
כדי לתקשר עם נוירונים מסדר שני, הנוציצפטורים משחררים מוליכים עצביים שונים (למשל, גלוטמט) ונוירופפטידים (למשל, פפטיד הקשור לגנים קלציטונין (CGRP), חומר P (SP) ופפטיד מעיים vasoactive (VIP))6,7. פפטידים אלה פועלים על נימים ומקדמים אקסטרווזיה של פלזמה, בצקת, ואת הזרימה והמודולציה המקומית של תאי מערכת החיסון 2,4,7.
המערכת הסומטוסנסורית ומערכת החיסון משתמשות במערכת תקשורת משותפת המורכבת מציטוקינים ונוירופפטידים, והקולטנים הקוגנטיים שלהם4. בעוד שתקשורת דו-כיוונית זו מסייעת בהגנה מפני סכנה ובשימור הומאוסטזיס, היא יכולה גם לתרום לפתופיזיולוגיה של מחלות4.
תאי NK מסווגים כתאי לימפה מולדים והם מתמחים בחיסול תאים נגועים ויראליים. תפקוד תאי NK נשלט על ידי איזון של קולטנים מגרים ומעכבים, כולל הקולטן המפעיל NKG2D8. הליגנד האנדוגני של NKG2D, חומצה רטינואית מוקדמת1 (RAE1), מתבטא בתאים העוברים עקה כגון גידולים וזיהום 8,9.
מחקרים אחרונים הראו כי פגיעה עצבית היקפית מניעה נוירונים תחושתיים לבטא מולקולות לא מסתגלות כגון stathmin 2 (STMN2) ו- RAE1. כך, באמצעות מגע בין תאים, תאי NK המבטאים NKG2D הופעלו על ידי אינטראקציה עם נוירונים המבטאים RAE1. בתורו, תאי NK היו מסוגלים לחסל נוירונים nociceptor פצוע קהה רגישות יתר כאב קשורה בדרך כלל עם פגיעה עצבית10. בנוסף לציר NKG2D-RAE1, תאי NK מבטאים את הקולטנים הקוגנטיים עבור מתווכים שונים המיוצרים על ידי nociceptor. לכן ייתכן שהמתווכים האלה מווסתים את פעילות תאי ה-NK. מאמר זה מציג שיטת תרבית משותפת כדי לחקור את הביולוגיה של האינטראקציה בין תאי הנוירון-NK של nociceptor. גישה זו תסייע לקדם את ההבנה כיצד נוירונים של nociceptor מווסתים תגובות של תאי חיסון מולדים לפציעה, זיהום או ממאירות.

<table><tbody><tr><td>נגד עכבר CD16/32</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>חתול מס': 017769</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>חתול מס': 009669</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA) דרגת תרבית</td><td>World Precision Instruments</td><td>Cat מס': 504167</td><td></td></tr><tr><td>BV421 נגד עכבר NK-1.1</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>חתול מס': 12430112</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים (50 &mu; m)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>חתול מס': A3160702</td><td></td></tr><tr><td>קולגנז IV</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>חתול מס': 15140148</td><td></td></tr><tr><td>דיפטריה טוקסיןfl/fl</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>חתול מס': SH3057402</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>חתול מס': 13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>חתול מס': 07-200-95</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בידוד תאים של EasySep Mouse NK</td><td>סיגמא</td><td>חתול מס': CLS2595</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)</td><td>סיגמא</td><td>חתול מס': C0130</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>סיגמא</td><td>חתול מס': 04942078001</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>סיגמא</td><td>חתול מס': 806552</td><td></td></tr><tr><td>FITC אנטי-עכבר NKp46</td><td>סיגמא</td><td>חתול מס': L2020</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תחתונה שטוחה 96 בארות</td><td>סיגמא</td><td>חתול מס': 03690</td><td></td></tr><tr><td>פיפטת זכוכית פסטור</td><td>סיגמא</td><td>חתול מס': 470236-274</td><td></td></tr><tr><td>גורם נוירוטרופי שמקורו בקו תאי גליה (GDNF)</td><td></td> <td>VWR חתול מס': 02-0131</td><td></td></tr><tr><td>למינין</td><td>ארז</td><td>חתול מס': 03-50/31</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>גיבקו</td><td>חתול מס': A14867-01</td><td></td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי IL-15</td><td>Gibco</td><td>חתול מס': 22400-089</td><td></td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי IL-2</td><td>Gibco</td><td>Cat מס': 21103-049</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה עצבי (NGF)</td> <td>Life Technologies</td><td>מס' קטלוגי: 13257-019</td><td></td></tr><tr><td>מדיה נוירובזאלית</td><td>PeproTech</td><td>חתול מס': 450-51-10</td><td></td></tr><tr><td>PE נגד עכבר GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>חתול מס': 212-12</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין ו Streptomycin</td><td>PeproTech</td><td>חתול מס': 210-15</td><td></td></tr><tr><td>Pestles</td><td>טכנולוגיית תאי גזע</td><td>חתול מס': 19855</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td>Biolegend</td><td>חתול מס': שיבוט 108732</td><td>PK136</td></tr><tr><td>RPMI 1640 מדיה</td><td>Biolegend</td><td>חתול מס': 137606</td><td>Clone 29A1.4</td></tr><tr><td>TRPV1Cre</td><td>Biolegend</td><td>חתול מס': 505406</td><td>Clone MP1-22E9</td></tr><tr><td>פינצטה וכלי ניתוח.</td><td>Biolegend</td><td>חתול מס': 65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 96 בארות בצורת U תחתונה</td><td>Biolegend</td><td>חתול מס': 101319</td><td></td></tr><tr><td>כדאיות צבע eFlour-780</td><td>בקטון דיקינסון</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

נטרול יחסי הגומלין בין תאי הרג טבעיים לבין נוירונים של נוסיצפטורים

Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons

נוירונים סומטוסנסוריים התפתחו כדי לזהות גירויים רעילים ולהפעיל רפלקסים הגנתיים. על ידי שיתוף אמצעי תקשורת, נוירונים nociceptor גם לכוון את הגנות המארח על ידי שליטה על הפעילות של המערכת החיסונית. התקשורת בין מערכות אלה היא בעיקר אדפטיבית, עוזר להגן על הומאוסטזיס, זה יכול גם להוביל, או לקדם, את הופעת מחלות כרוניות. שתי המערכות התפתחו יחד כדי לאפשר אינטראקציה מקומית כזו, כפי שנמצאת ברקמות לימפה ראשוניות ומשניות וברירית. מחקרים אחרונים הראו כי nociceptors מזהים ומגיבים ישירות לאנטיגנים זרים, ציטוקינים שמקורם בתאי מערכת החיסון ומיקרובים.
הפעלת Nociceptor לא רק גורמת לרגישות יתר לכאב וגירוד, אלא מורידה את סף ירי הנוציצפטור, מה שמוביל לשחרור מקומי של נוירופפטידים. הפפטידים המיוצרים על ידי, ומשוחררים, הטרמינלים ההיקפיים של nociceptors יכול לחסום את chemotaxis ואת הקיטוב של לימפוציטים, שליטה על לוקליזציה, משך, וסוג של דלקת. עדויות עדכניות מראות כי נוירונים תחושתיים מתקשרים עם תאי חיסון מולדים באמצעות מגע בין תאים, לדוגמה, תוך הפעלת קולטני דו-ממד מקבוצה (NKG2D) על תאי הרג טבעי (NK).
בהתחשב בכך שתאי NK מבטאים את הקולטנים הקוגנטיים עבור מתווכים שונים המיוצרים על ידי nociceptor, ניתן להעלות על הדעת כי nociceptors להשתמש נוירופפטידים כדי לשלוט על הפעילות של תאי NK. כאן, אנו מפתחים שיטת תרבית משותפת כדי לחקור אינטראקציות נוירון-NK של nociceptor בצלחת. באמצעות גישה זו, מצאנו כי נוירונים של nociceptor מותני מפחיתים את ביטוי הציטוקינים של תאי NK. באופן כללי, שיטה רדוקציוניסטית כזו יכולה להיות שימושית כדי לחקור כיצד נוירונים מעוררי גידול שולטים בתפקוד האנטי-סרטני של תאי NK, וכיצד תאי NK שולטים בחיסול תאי עצב פצועים.

תאי NK טוהרו באופן מגנטי מבקרת פסולת (TRPV1 wt::D TAfl/wt) של עכברים ספלנוציטים ועוררו (48 שעות) עם IL-2 ו-IL-15. לאחר מכן תאי ה-NK גודלו בתרבית בלבד או בתרבית משותפת עם נוירוני DRG שנקטפו מנוירון נוסיצפטור שלם (בקרת פסולת; TRPV1 wt::D TA fl/wt) או עכברים אבלטים (TRPV1cre::D TAfl/wt). לאחר מכן נחשפו התאים לקפסאיצין אגוניסט TRPV1 (1 μM) או לרכבו. לאחר 24 שעות של תרבית משותפת, תאי ה-NK טוהרו באמצעות FACS ורמות ההפעלה שלהם היו אימונופנוטיפיות באמצעות ציטומטרי...

נוירונים Nociceptor ותאי NK אינטראקציה פעילה בהקשר דלקתי. גישה של תרבות משותפת מאפשרת ללמוד את יחסי הגומלין האלה.

Somatosensory neurons have evolved to detect noxious stimuli and activate defensive reflexes. By sharing means of communication, nociceptor neurons also ...

בהתחשב בכך שנוירון הנוציצפטור מפריש נוירופפטידים שונים ושתא NK ביטא את הקולטן לנוירופפטידים אלה, החלטנו להמציא שיטת תרבית משותפת כדי לחקור את יחסי הגומלין בין תא ה-NK לבין תאי הנוירונים של הנוציצפטור. שיטה רדוקציוניסטית כזו יכולה להיות שימושית כדי לחקור כיצד נוירון nociceptor לשלוט על תפקוד אנטי סרטני של תא NK, וזה יכול להיות גם מעניין לחקור כיצד תא NK שולט על חיסול של נוירונים פצועים. מי שידגים את ההליך יהיה עלי אחמדי, סטודנט לתואר שני לשעבר מהמעבדה שלי.כדי להתחיל את ההרג הטבעי או בידוד תאים NK ותרביה, לאסוף את הטחול העכבר בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר המכיל 500 microliters של PBS סטרילי, ולאחר מכן הומוגניות הטחול באמצעות מזיק. לאחר מכן, לדלל את התאים עם מיליליטר אחד של PBS סטרילי ולסנן את התערובת דרך מסננת תאים של 50 מיקרון לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. טען את נפח ההומוג'נט המסונן ל-10 מיליליטר באמצעות PBS סטרילי.לספור את התאים ב 10 microliters של הומוגנט מדולל באמצעות hemocytometer. צנטריפוגה של התאים הנותרים במשך חמש דקות ב 500 G ולהסיר את supernatant. לאחר מכן יש להשעות את התאים ב-10 עד 8 תאים למיליליטר בתוספת RPMI 1640 בינונית.לטהר באופן מגנטי את תאי הטחול NK באמצעות ערכת בידוד תאי NK של עכבר ולאשר את טוהר תאי NK באמצעות ציטומטריה של זרימה. סופרים את התאים באמצעות המוציטומטר, ואחריו צנטריפוגה בחמש דקות ב-500 גרם, ואז מסירים את הסופר-נאטנט. כדי לעורר את תאי ה-NK הכדוריים, יש להשעות את התאים הללו בתרבית RPMI 1640 בתוספת IL-2 ו-IL-15.תרבית פעמיים 10 עד השישית תאי NK למיליליטר בצלחת U-bottom של 96 באר במשך 48 שעות. 24 שעות לפני גירוי תאי NK, מצפים את צלחת 96 הבאר עם 100 מיקרוליטר לכל באר של למינין ודגירה אותו במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, הסר את התמיסה ואפשר לבארות להתייבש באוויר בארון הבטיחות הביולוגית.לאחר מכן, אבטח את העכבר המומת על הלוח במצב נוטה. הרימו את העור וחתכו את העור לאורך העמוד הגבי. חותכים את המפרק המותני ומפרידים את העצה מעמוד השדרה המותני באמצעות מספריים.לאחר מכן להפריד את עמוד השדרה על ידי חיתוך השרירים והצלעות משני הצדדים בכיוון הגולגולת עד בסיס הגולגולת הוא הגיע. השתמש מספריים כדי לחתוך את עמוד השדרה במפרק atlantooccipital. לאחר מכן, להסיר את השריר ואת רקמת השומן מן עמוד השדרה.הצמד ופתח את עמוד השדרה כדי להסיר את חוט השדרה לפני קבלת גישה לשורש הגבי גנגליון או DRG בפורמינה הבין חולייתית המחוברת לחוט השדרה דרך השורש הגבי. לאחר מכן, קצרו את ה-DRGs לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר מלא ב-10 מיליליטר של DMEM קר כקרח. לאחר מכן צנטריפוגה את ההכנה במשך חמש דקות ב 200 G בטמפרטורת החדר ולהסיר את supernatant.הוסף 250 מיקרוליטרים של PBS המכילים מיליגרם אחד למיליליטר קולגן IV ו -2.4 יחידות למיליליטר dispase II.דגירה של DRG זה עם תמיסת קולגן-דיספאז במשך 80 דקות עם תסיסה קלה. כדי להשבית את האנזימים, הוסיפו חמישה מיליליטרים של תוסף DMEM בינוני וצנטריפוגה של התמיסה ב-200 גרם.לאחר חמש דקות, הסירו בעדינות את הסופרנטנט באמצעות פיפטה והשאירו כ-100 מיקרוליטרים של הסופר-נאטנט כדי למנוע אובדן תאים לא רצוי. לאחר מכן, הוסיפו מדיום DMEM של מיליליטר אחד לתאים והשתמשו באקדח פיפטה ובשלושה פיפטות פסטר מזכוכית בגדלים הולכים ופוחתים כדי להפוך בעדינות את ה-DRG להכנת תא אחד.תוך כדי עבודה בארון בטיחות ביולוגית, יש לדלל אלבומין בסרום בקר או BSA ב-PBS סטרילי לריכוז סופי של 15% ולאחסן אליקוט מיליליטר אחד במינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי ליצור שיפוע BSA בצינור חרוטי של 15 מיליליטר, הוסף שני מיליליטר של PBS סטרילי ולאחר מכן החלק באיטיות מיליליטר אחד של תמיסה של 15% BSA בתחתית הצינור. הימנע מהפרעה לשיפוע על ידי הסרה עדינה של הפיפטה.באמצעות פיפטה P200, הוסף את תרחיף הגרעינים המשולש המכיל את הנוירונים על צד הצינור לתוך השיפוע. לאחר מכן הגדר את ההאצה וההאטה למינימום כדי לצנטריפוגה של הנוירון המכיל את שיפוע BSA למשך 12 דקות ב 200 G.לאחר הצנטריפוגה, הסר את כל הסופרנטנט באמצעות פיפטה והשעה את התאים ב -500 מיקרוליטרים של Neurobasal. צלחת 10, 000 נוירונים לכל באר בצלחת תחתית שטוחה מצופה למינין 96 באר.כדי לאפשר את ההתקשרות של הנוירונים, לדגור את צלחת 96 באר לילה ב 37 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל בהתרבות משותפת, הסר באיטיות את הנוירובסל מתרבית הנוירונים. לאחר 48 שעות של גירוי עם IL-2 ו- IL-15, השהה את תאי ה- NK והוסף 10 לתאי ה- NK החמישי לכל באר לתרבית הנוירונים.תרבית משותפת של התאים בתוספת Neurobasal MX בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר 48 שעות, לאסוף ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS וצנטריפוגה אותם במשך חמש דקות ב 500 G בארבע מעלות צלזיוס. להשליך את supernatant לפני מכתים את התאים עם אחד עד 1, 000 מדולל כדאיות צבע eFluor 780 במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לשטוף ולעשות צנטריפוגה של התאים כפי שהוכח, ולאחר מכן לטפל עם CD 1632 במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לחסום אתרים לא ספציפיים על התאים, ולאחר מכן לאסוף ולשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים. לאחר המחזור הבא של שטיפה וצנטריפוגה, הכתימו את התאים ב-BV421, אנטי-NK-1.1, פלואורסצין איזותיוציאנט אנטי-NKp46, ופיקואריתרין אנטי-GM-CSF למשך 15 דקות. שוב, לאסוף ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS, צנטריפוגה אותם ולהשליך את supernatant, ולאחר מכן להשעות את התאים ב 500 microliters של חיץ FACS ואימונופנוטיפ תאי NK באמצעות ציטומטריה זרימה.כאשר תרבית לבדה, תאי NK ביטאו רמות בסיסיות של גורם מגרה מושבת גרנולוציטים מקרופאגים או GM-CSF ו- NKp46. כאשר תרבית משותפת עם נוירוני DRG שנקטפו מעכברים שלמים של nociceptor, גירוי קפסאיצין הפחית את הביטוי של תאי NK של GM-CSF. לקפסאיצין לא הייתה השפעה על פעילות תאי NK כאשר הוא תרבית יחד עם נוירוני DRG שנקטפו מעכברים אבלטים של nociceptor.הרמה של NKp46 לא הושפעה. השלבים המרכזיים בפרוטוקול זה הם הדיסוציאציה והבידוד של DRG. הרעיון הוא לשמור על כדאיות עצבית מקסימלית על ידי הימנעות מיצירת בועות ושימוש בפיפטה בגודל הנכון.לאחר הפרוטוקול, החוקרים יכולים להשתמש בריצוף RNA או qPCR כדי למדוד שינוי תעתיק בתאים מטוהרים של FACS, או שהם יכולים להשתמש ב- ELISA כדי למדוד את הפרשת הציטוקינים או הנוירופפטידים. יחסי גומלין כאלה מגלים כי תפקוד תאי NK ככל הנראה מכוון על ידי נוירון nociceptor. וההצלבה הזו עשויה להיות חשובה בתהליכים ביולוגיים המשתרעים מפגיעה עצבית, זיהום חיידקי וויראלי, ועד ממאירויות.

teasing-out-interplay-between-natural-killer-cells-nociceptor

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

Natural Killer T לתאים (NKT) הם הגורמים הקריטיים של התגובה החיסונית של סרטן, ויסות autioimmunity, אישור של זיהום, לבין התפתחות הפלאק artheriosclerotic. בראיון זה, מיץ' קרוננברג דן מאמצים במעבדה שלו כדי להבין את המנגנון שדרכו תאים NKT מופעלים על ידי אנטיגנים glycolipid.

ראיון: Antigen Presentation Glycolipid ידי CD1d ואת הפוטנציאל הטיפולי של הפעלת התא NKT

זיהוי Immunocytochemical של הפריפריה תת סיב עצב תחושתי (גילוי של ביטוי החלבון בו) הם המפתח להבנת המנגנונים המולקולריים שבבסיס תחושה היקפית. כאן אנו מתארים שיטות להכנת דגימות רקמה היקפי / הקרביים, כגון עצמות עור הגפיים, immunostaining מסוים של סיבי עצב היקפי חושית.

רקמות הכנה Immunostaining של סיבי עצב תחושתי עכבר Innervating עצמות סקין לימב

סרטון זה מתאר את הבידוד של נוירוני DRG באמצעות עיכול אנזימטי, דיסוציאציה מכנית וצנטריפוגה הדרגתית. תאי DRG מתורבתים יחד עם תאי הרג טבעיים על מטריצה חוץ-תאית כדי לחקור את האינטראקציה בין תאי מערכת החיסון לבין נוירונים חושיים.

בידוד נוירונים חושיים וטיפוח משותף עם תאי הרג טבעיים

על מנת ללמוד את השינויים של סיבי עצב intraepidermal nociceptive (IENFs) בneuropathies כואב (PN), פיתחנו פרוטוקולים שיכולים ישירות לבחון שינויים מורפולוגיים תלת ממדיים שנצפו בIENFs nociceptive. ניתוח תלת ממדי של IENFs יש את הפוטנציאל כדי להעריך את השינויים מורפולוגיים של IENF בPN.

הדמיה תלת ממדית של סיבי עצב Intraepidermal nociceptive בביופסיות עור אדם

בדיקת הכף הקרה (CPA) מודדת היענות לקור בין 30 מעלות צלזיוס ל-5 מעלות צלזיוס, ויכולה גם למדוד הסתגלות לקור. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש ב-CPA כדי למדוד רגישות יתר לקור, שיכוך כאבים והסתגלות בעכברים.

שיטה פשוטה וזולה לקביעה קרה רגישות והסתגלות בעכברים

התחמקות של הרוצח הטבעי (NK) תא מתווכת מיגור על ידי תאים סרטניים חשוב לחניכה והתקדמות סרטן. כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים שאינם מבוססי רדיואקטיביות כדי להעריך את הרעילות של התאים NK בתיווך לקראת תאי גידול בכבד. בנוסף, פרוטוקול שלישי מוצג לניתוח העברת תאים של NK.

מדידה של הרוצח הטבעי Cell-בתיווך ציטורעילות והגירה בהקשר של תאים סרטניים בכבד

APTrack הוא תוסף תוכנה שפותח עבור פלטפורמת Open Ephys המאפשר הדמיית נתונים בזמן אמת ומעקב סף חשמלי בלולאה סגורה אחר פוטנציאלי פעולה עצביים. השתמשנו בזה בהצלחה במיקרונוירוגרפיה עבור nociceptors סיבי C אנושיים ועכבר C-fiber ו Aδ-fiber nociceptors.

מעקב סף חשמלי בלולאה סגורה בקוד פתוח בזמן אמת לחקר כאב תרגומי

פרוטאזום הממברנה העצבית (NMP) זוהה לאחרונה בתת-קבוצה של נוירונים סומטוסנסוריים כמווסת מרכזי של תפיסת מגע, כאב וגירוד. מאמר זה מציג זרימת עבודה חזקה לניתוח ביטוי ותפקוד NMP ספציפי לסוג התא באמצעות מיון תאים, פרופיל טרנסקריפטום וניתוחים אימונו-פלואורסצנטיים מבוססי תרבית.

ניתוח ספציפי לתת-סוג תא של פרוטאזום ממברנה עצבית בנוירונים סומטוסנסוריים

אנו מתארים פרוטוקול המאפשר הדמיה של המיטוכונדריה לחיות הנוירונים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי פני משכי זמן ארוכים. הדמיה על תקופות ממושכות נעשה באמצעות הביטוי lentivirus בתיווך של חלבון פלואורסצנטי ממוקד mitochondrially ושימוש זול הבמה העליון חממה כי תוכנן ונבנה במעבדה שלנו.

Neuromodulation ותחבורה מיטוכונדריאלי: הדמיה חיה נוירונים בהיפוקמפוס פני משכי זמן ארוכים

בסרטון הזה, אנו מתארים שיטת הדמיה של תא חי להתחלק סימטרית חושי אבי איברים ותאי אפידרמיס ב...

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

חקור את האינטראקציה בין תאי NK לנוירוני נויצפטורים בשיטת תרבית משותפת. שיטה זו מאפשרת לבחון כיצד נוירונים אלו מווסתים את פעילות תאי ה-NK נגד גידולים ואת תפקידם בהסרת נוירונים פגועים.

נטרול יחסי הגומלין בין תאי הרג טבעיים לבין נוירונים של נוסיצפטורים

גלה סרטונים נוספים