Name: O Bioensaio celular Caco-2 para Medição da Biodisponibilidade de Ferro Alimentar (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Aprenda a medir a biodisponibilidade de ferro alimentar usando o bioensaio celular Caco-2. Este método validado permite avaliar fontes de ferro em alimentos e suplementos de forma eficiente e econômica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

O autor é profundamente grato pelos esforços técnicos de Yongpei Chang e Mary Bodis. A aplicação extremamente bem sucedida desse modelo no campo da nutrição é resultado direto de sua expertise e atenção aos detalhes. O desenvolvimento desse modelo foi financiado inteiramente pelo Departamento de Agricultura, Serviço de Pesquisa Agrícola dos Estados Unidos.

NOTA: Como ponto de referência conveniente para os leitores, a seguinte metodologia descreve as condições de cultura específicas e materiais necessários para a medição da biodisponibilidade fe a partir de 20 amostras experimentais, além dos controles de qualidade necessários, em uma execução do bioensaio. O aumento do número de amostras além dessa capacidade não é recomendado devido ao tempo necessário para várias culturas celulares e etapas de digestão in vitro dentro do bioensaio.
1. Escolher a quantidade de amostras
<ol><li>Para alimentos sólidos ou líquidos, determine uma quantidade de alimentos que podem ser considerados representativos da amostra a ser testada.<ol><li>Em testes para biodisponibilidade fe de uma variedade de feijão, use 100-150 g de semente de feijão e processe essa quantidade para uma amostra homogênea.</li>
		<li>Para amostras líquidas, como sucos fortificados, produtos lácteos e bebidas esportivas, certifique-se de que os alimentos estão bem misturados antes da amostragem. NOTA: A quantidade de material de semente de feijão mencionado acima é essencial para explicar as diferenças inerentes entre as sementes desta cultura de grampo.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparação de amostras
<ol><li>Enxágüe o solo e a poeira de qualquer amostra de alimentos com água destilada desionizada antes do processamento.</li>
	<li>Processe a quantidade adequada de amostra conforme os objetivos experimentais, como pelo método de cozimento e fresagem. NOTA: Para cozinhar e processar, é fundamental usar panelas e equipamentos que não são uma fonte potencial de contaminante Fe. Equipamento de aço inoxidável não contamina; no entanto, equipamentos como moedores de moinho de pedra, panelas de ferro fundido e qualquer equipamento de aço não inoxidável contendo Fe pode adicionar quantidades significativas de Fe contaminante. Um moedor de café de aço inoxidável padrão é muitas vezes adequado para moagem.</li>
	<li>Lyophilize e triture em pó homogêneo. NOTA: Uma vez homogeneizadas, pesquisas mostraram que três replicações independentes de análise são adequadas para cada alimento que está sendo medido.<ol><li>Se a homogeneidade da amostra for difícil de alcançar, revise a formulação ou processamento do produto. Se isso não for possível, adicione replicações se a não homogeneidade não for grave.</li>
		<li>Para a maioria dos alimentos sólidos homogêneos, utilize 0,5 g de amostra liofilizada por réplica. Se necessário, use até 1,0 g de amostra por réplica, mas verifique se mais de 0,5 g produz um benefício no grau de resposta. NOTA: Quantidades superiores a 0,5 g de alimentos sólidos podem entupir a membrana de diálise (veja abaixo).</li>
		<li>Use 1-2 mL de amostras líquidas. NOTA: A lyofilização muitas vezes não é necessária para amostras líquidas.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Cultura celular caco-2
<ol><li>Culturas de ações<ol><li>Adquira células Caco-2 de um fornecedor certificado.</li>
		<li>Cultura as células a partir de frascos de estoque a 37 °C em uma incubadora com atmosfera de ar de 5% CO2 (umidade constante) usando o Médio De Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco complementado com 25 mM HEPES (pH 7.2), 10% (v/v) soro bovino fetal (FBS) e 1% solução antimíctica antibiótico-antimíctica.</li>
		<li>Uma vez que células suficientes estão disponíveis, geralmente após 7-10 dias de cultura, semearam as células em frascos não revestidos de colágeno a uma densidade de 30.000 células/cm2.</li>
		<li>Escolha o tamanho do frasco dependendo do número de células disponíveis e necessárias para semeadura de placas multiwell. NOTA: Em geral, os frascos T225 (225 cm2) funcionam melhor para experimentos onde são utilizadas 11 placas multiwell (6-well; 9,66 cm2/well) (10 placas para comparações de amostras, 1 placa para controles de qualidade) por bioensaio.</li>
		<li>Cultivar células em frascos por 7 dias, mudando o meio a cada dois dias, e usar no7º dia para semear as placas multiwell. NOTA: Recomenda-se usar uma faixa de passagem de no máximo 10-15 passagens de quando as células são iniciadas a partir da cultura do estoque e posteriormente usadas em uma série de experimentos. As passagens de cultura celular devem ser limitadas, pois uma ampla gama de passagens pode resultar em mudanças adaptativas na linha celular e, assim, variabilidade na resposta do modelo.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultura celular em placas multiwell<ol><li>Semente as células Caco-2 a uma densidade de 50.000 células/cm2 em placas revestidas de colágeno de 6 poços. NOTA: Esta etapa geralmente funciona melhor se feita em uma quarta-feira. Os seguintes passos tornarão evidente por que este dia da semana é ótimo.</li>
		<li>Cresça as células por 12 dias a 37 °C em uma incubadora com atmosfera de ar de 5% de CO2 (umidade constante) utilizando DMEM complementado com HEPES de 25 mM (pH 7.2), 10% (v/v) FBS e 1% solução antimicomolética antibiótico. NOTA: A colheita das monocamadas celulares por mais de 12 dias pode resultar em crescimento excessivo celular. Pesquisas anteriores mostraram claramente que, nessas condições, aos 12 dias após a semeadura, a monocamada celular é madura, bem presa à placa, e ótima na consistência da resposta 29,30,31. O crescimento das células por mais tempo, como até 19-21 dias, resulta em crescimento excessivo celular, e a mídia rapidamente se esgota em nutrientes, resultando em monocamadas não saudáveis.</li>
		<li>Durante o período de 12 dias, troque o meio pelo menos a cada 2 dias em um horário diário consistente.</li>
		<li>No pós-semeadura de12 dias , substitua o meio de cultura por 2 mL de Meio Essencial Mínimo (MEM [pH 7]) complementado com PIPES de 10 mM (piperazine-N,N'-bis-[2-ácido estanolfônico]), solução antibiótico-antimicomolética de 1%, hidrocortisona (4 mg/L), insulina (5 mg/L), selênio (5 μg/L), triiodotironina (34 μg/L) e fator de crescimento epidérmico (20 μg/L). NOTA: Se a semeadura fosse iniciada em uma quarta-feira, então o12º dia seria uma segunda-feira.</li>
		<li>No dia seguinte (ou seja, dia 13), retire o MEM e substitua-o por 1 mL de MEM (pH 7). NOTA: Esta etapa ocorreria em uma terça-feira. Este é o dia em que o bioensaio começa; assim, o cronograma de 13 dias rende a vantagem de um cronograma semanal consistente, permitindo que o bioensaio seja realizado de forma consistente no mesmo dia da semana.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Digestão in vitro
<ol><li>Preparação de anéis de inserção<ol><li>Crie um anel de inserção esterilizado usando um anel O de silicone equipado com uma membrana de diálise lavada com ácido (Figura 1A). NOTA: Prepare as pastilhas com 1 dia de antecedência (ou seja, segunda-feira, dia 12) do dia do bioensaio e armazene em 18 MΩ água a 4°C até estar pronto para uso.</li>
		<li>No dia do bioensaio (terça-feira, dia 13), retire as pastilhas da geladeira, escorra e substitua a água por 0,5 M HCl. Deixe-a em temperatura ambiente em uma capa de fluxo laminar por pelo menos 1h antes de ser usada. NOTA: Esta etapa deve ser feita antes de remover o MEM das placas de cultura. A lavagem ácida da membrana serve para remover a possível contaminação do Fe e esteriliza o anel e a membrana da inserção.</li>
		<li>Escorra os 0,5 M HCl das pastilhas e enxágue com água estéril de 18 MΩ. Guarde em água estéril de 18 MΩ à temperatura ambiente em uma capa de fluxo laminar até estar pronta para uso.</li>
		<li>Insira um anel em cada poço das placas de 6 poços com células Caco-2, criando assim um sistema de duas câmaras. Devolva as placas com as pastilhas para a incubadora. NOTA: Esta etapa deve ser feita logo após a adição de 1,0 mL de MEM a cada poço (ver Passo 3.2.5.).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação da solução pepsina<ol><li>No dia do experimento, prepare a solução pepsina dissolvendo 0,145 g de pepsina em 50 mL de 0,1 M HCl. Agite a solução suavemente em um agitador de plataforma por 30 minutos à temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação da solução pancreatina-bile<ol><li>No mesmo dia do experimento, prepare 0,1 M NaHCO3 dissolvendo 2,1 g de NaHCO3 em 250 mL de 18 MΩ de água.</li>
		<li>Misture 0,35 g de pancreatina e 2,1 g de extrato de bile em 175 mL de 0,1 M NaHCO3.</li>
		<li>Uma vez que o extrato de pancreatina e biliar seja solubilizado, adicione 87,5 g de uma fraca resina de troca de cáção (ver a Tabela de Materiais) e misture tremendo por 30 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Despeje o chorume em uma coluna grande e colete o elunato.</li>
		<li>Elute a coluna com um adicional de 70 mL de 0,1 M NaHCO3, coletando este volume na solução bile pancreatina. NOTA: O objetivo da resina é remover o contaminante Fe comumente encontrado nos extratos de pâncreas-bile.</li>
	</ol></li>
	<li>Iniciar digestão in vitro .<ol><li>Pesar a amostra em um tubo de centrífuga estéril de 50 mL (polipropileno), seguido pela adição de 10 mL de soro fisiológico no pH 2, contendo 140 mM NaCl e 5 mM KCl.</li>
		<li>Inicie o processo de digestão gástrica adicionando 0,5 mL da solução de pepsina suína preparada à amostra e incubar em um agitador de balanço em um ajuste baixo e suave por 1h a 37 °C.</li>
		<li>Após esse período, inicie o processo de digestão intestinal de cada amostra ajustando o pH para 5,5-6,0 com 1,0 M NaHCO3.</li>
		<li>Adicione 2,5 mL da solução pancreatina-bile a cada tubo de amostra e ajuste o pH para 6,9-7,0 com 1,0 M NaHCO3.</li>
		<li>Uma vez ajustado o pH, equalize o volume em cada tubo usando a solução de 140 mM NaCl, 5 mM KCl (pH 6.7), medindo o peso do tubo com um valor-alvo de 15 g. NOTA: Para alguns alimentos, pode-se precisar levar o volume total para 16 g ou 17 g, dependendo da capacidade de tampão dos alimentos.</li>
		<li>Transfira 1,5 mL de cada digestão intestinal para a câmara superior (ou seja, contendo o anel de inserção com a membrana de diálise) de um poço correspondente da placa de cultura de 6 poços contendo as células Caco-2 (Figura 1B).</li>
		<li>Substitua a tampa da placa e incubar a 37 °C (atmosfera de ar de 5% CO2 ) em um agitador de balanço a 6 oscilações/min por 2h.</li>
		<li>Remova o anel de inserção com o digestor e adicione mais 1 mL de MEM (pH 7) a cada poço.</li>
		<li>Retorne a placa de cultura celular à incubadora (37 °C; 5% de atmosfera de ar CO2 ) por mais 22 h.</li>
		<li>Após 22 h, remova o meio de cultura celular e adicione 2,0 mL de água de 18 MΩ à monocamada celular. NOTA: A água vai liseticamente as células.</li>
		<li>Colher toda a célula lysate em tubos padrão de microcentrífugo de polipropileno ou semelhante para análises subsequentes de proteína celular e ferritina celular.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Medição da ferritina celular Caco-2 e proteína celular
<ol><li>Use o lisecelular do passo 4.4.10. para a medição da ferritina celular e proteína.<ol><li>Para medir o teor de ferritina das células Caco-2, siga as instruções do kit (veja a Tabela de Materiais), com exceção do aumento do tempo de incubação de 30 min para 2 h para o conjugado de anticorpo anti-ferritina do rato (HRP).</li>
		<li>Para medir a proteína celular, siga as instruções fornecidas no kit de proteína celular (veja a Tabela de Materiais).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Fairweather-Tait, S. J., Dainty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+stable+isotopes+to+assess+the+bioavailability+of+trace+elements%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Additives+Contaminants%22%5BJournal%5D)">Use of stable isotopes to assess the bioavailability of trace elements: a review.</a> Food Additives Contaminants. 19 (10), 939-947 (2002).</li>
<li>Hadley, K. B., Johnson, L. K., Hunt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+absorption+by+healthy+women+is+not+associated+with+either+serum+or+urinary+prohepcidin%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Iron absorption by healthy women is not associated with either serum or urinary prohepcidin.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 84 (1), 150-155 (2006).</li>
<li>Glahn, R. P., Cheng, Z., Giri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+labeling+of+staple+food+crops+with+isotopic+iron+does+not+consistently+result+in+full+equilibration%3A+revisiting+the+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Extrinsic labeling of staple food crops with isotopic iron does not consistently result in full equilibration: revisiting the methodology.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9621-9628 (2015).</li>
<li>Consaul, J. R., Lee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+tagging+in+iron+bioavailability+research%3A+a+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Extrinsic tagging in iron bioavailability research: a critical review.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 31 (4), 684-689 (1983).</li>
<li>Jin, F., Cheng, Z., Rutzke, M. A., Welch, R. M., Glahn, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+labeling+method+may+not+accurately+measure+Fe+absorption+from+cooked+pinto+beans+%28Phaseolus+vulgaris%29%3A+comparison+of+extrinsic+and+intrinsic+labeling+of+beans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Extrinsic labeling method may not accurately measure Fe absorption from cooked pinto beans (Phaseolus vulgaris): comparison of extrinsic and intrinsic labeling of beans.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (16), 6881-6885 (2008).</li>
<li>Junqueira-Franco, M. V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+absorption+from+beans+with+different+contents+of+iron%2C+evaluated+by+stable+isotopes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Nutrition+ESPEN%22%5BJournal%5D)">Iron absorption from beans with different contents of iron, evaluated by stable isotopes.</a> Clinical Nutrition ESPEN. 25, 121-125 (2018).</li>
<li>Petry, N., Egli, I., Zeder, C., Walczyk, T., Hurrell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphenols+and+phytic+acid+contribute+to+the+low+iron+bioavailability+from+common+beans+in+young+women%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Polyphenols and phytic acid contribute to the low iron bioavailability from common beans in young women.</a> Journal of Nutrition. 140 (11), 1977-1982 (2010).</li>
<li>Petry, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+iron+isotope+studies+in+Rwandese+women+indicate+that+the+common+bean+has+limited+potential+as+a+vehicle+for+iron+biofortification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Stable iron isotope studies in Rwandese women indicate that the common bean has limited potential as a vehicle for iron biofortification.</a> Journal of Nutrition. 142 (3), 492-497 (2012).</li>
<li>Petry, N., Egli, I., Campion, B., Nielsen, E., Hurrell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+reduction+of+phytate+in+common+bean+%28Phaseolus+vulgaris+L.%29+seeds+increases+iron+absorption+in+young+women%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Genetic reduction of phytate in common bean (Phaseolus vulgaris L.) seeds increases iron absorption in young women.</a> Journal of Nutrition. 143 (8), 1219-1224 (2013).</li>
<li>Petry, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytic+acid+concentration+influences+iron+bioavailability+from+biofortified+beans+in+Rwandese+women+with+low+iron+status%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Phytic acid concentration influences iron bioavailability from biofortified beans in Rwandese women with low iron status.</a> Journal of Nutrition. 144 (11), 1681-1687 (2014).</li>
<li>Petry, N., Boy, E., Wirth, J. P., Hurrell, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+The+potential+of+the+common+bean+%28Phaseolus+vulgaris%29+as+a+vehicle+for+iron+biofortification%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Review: The potential of the common bean (Phaseolus vulgaris) as a vehicle for iron biofortification.</a> Nutrients. 7 (2), 1144-1173 (2015).</li>
<li>Petry, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Rwandese+women+with+low+iron+status%2C+iron+absorption+from+low-phytic+acid+beans+and+biofortified+beans+is+comparable%2C+but+low-phytic+acid+beans+cause+adverse+gastrointestinal+symptoms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">In Rwandese women with low iron status, iron absorption from low-phytic acid beans and biofortified beans is comparable, but low-phytic acid beans cause adverse gastrointestinal symptoms.</a> Journal of Nutrition. 146 (5), 970-975 (2016).</li>
<li>Donangelo, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+zinc+absorption+from+two+bean+%28Phaseolus+vulgaris+L.%29+genotypes+in+young+women%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Iron and zinc absorption from two bean (Phaseolus vulgaris L.) genotypes in young women.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (17), 5137-5143 (2003).</li>
<li>Dellavalle, D. M., Glahn, R. P., Shaff, J. E., O'Brien, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+absorption+from+an+intrinsically+labeled+lentil+meal+is+low+but+upregulated+in+women+with+poor+iron+status%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Iron absorption from an intrinsically labeled lentil meal is low but upregulated in women with poor iron status.</a> Journal of Nutrition. 145 (10), 2253-2257 (2015).</li>
<li>Miller, D. D., Schricker, B. R., Rasmussen, R. R., Van Campen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+method+for+estimation+of+iron+availability+from+meals%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">An in vitro method for estimation of iron availability from meals.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 34 (10), 2248-2256 (1981).</li>
<li>Glahn, R. P., Wien, E. M., Van Campen, D. R., Miller, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+cell+iron+uptake+from+meat+and+casein+digests+parallels+in+vivo+studies%3A+use+of+a+novel+in+vitro+method+for+rapid+estimation+of+iron+bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Caco-2 cell iron uptake from meat and casein digests parallels in vivo studies: use of a novel in vitro method for rapid estimation of iron bioavailability.</a> Journal of Nutrition. 126 (1), 332-339 (1996).</li>
<li>Martini, L. A., Tchack, L., Wood, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+treatment+downregulates+DMT1+and+IREG1+mRNA+expression+in+Caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Iron treatment downregulates DMT1 and IREG1 mRNA expression in Caco-2 cells.</a> Journal of Nutrition. 132 (4), 693-696 (2002).</li>
<li>Glahn, R. P., Wortley, G. M., South, P. K., Miller, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+iron+uptake+by+phytic+acid%2C+tannic+acid%2C+and+ZnCl2%3A+studies+using+an+in+vitro+digestion%2FCaco-2+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of iron uptake by phytic acid, tannic acid, and ZnCl2: studies using an in vitro digestion/Caco-2 cell model.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (2), 390-395 (2002).</li>
<li>Glahn, R. P., Lee, O. A., Yeung, A., Goldman, M. I., Miller, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+cell+ferritin+formation+predicts+nonradiolabeled+food+iron+availability+in+an+in+vitro+digestion%2FCaco-2+cell+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Caco-2 cell ferritin formation predicts nonradiolabeled food iron availability in an in vitro digestion/Caco-2 cell culture model.</a> Journal of Nutrition. 128 (9), 1555-1561 (1998).</li>
<li>Yun, S., Habicht, J. P., Miller, D. D., Glahn, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+digestion%2FCaco-2+cell+culture+system+accurately+predicts+the+effects+of+ascorbic+acid+and+polyphenolic+compounds+on+iron+bioavailability+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">An in vitro digestion/Caco-2 cell culture system accurately predicts the effects of ascorbic acid and polyphenolic compounds on iron bioavailability in humans.</a> Journal of Nutrition. 134 (10), 2717-2721 (2004).</li>
<li>Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogenization%2C+lyophilization+or+acid-extraction+of+meat+products+improves+iron+uptake+from+cereal-meat+product+combinations+in+an+in+vitro+digestion%2FCaco-2+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Homogenization, lyophilization or acid-extraction of meat products improves iron uptake from cereal-meat product combinations in an in vitro digestion/Caco-2 cell model.</a> British Journal of Nutrition. 101 (6), 816-821 (2009).</li>
<li>Tako, E., Bar, H., Glahn, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combined+application+of+the+Caco-2+cell+bioassay+coupled+with+in+vivo+%28Gallus+gallus%29+feeding+trial+represents+an+effective+approach+to+predicting+Fe+bioavailability+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">The combined application of the Caco-2 cell bioassay coupled with in vivo (Gallus gallus) feeding trial represents an effective approach to predicting Fe bioavailability in humans.</a> Nutrients. 8 (11), 732-757 (2016).</li>
<li>Engle-Stone, R., Yeung, A., Welch, R., Glahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meat+and+ascorbic+acid+can+promote+Fe+availability+from+Fe-phytate+but+not+from+Fe-tannic+acid+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Meat and ascorbic acid can promote Fe availability from Fe-phytate but not from Fe-tannic acid complexes.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (26), 10276-10284 (2005).</li>
<li>Tako, E., Blair, M. W., Glahn, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofortified+red+mottled+beans+%28Phaseolus+vulgaris+L.%29+in+a+maize+and+bean+diet+provide+more+bioavailable+iron+than+standard+red+mottled+beans%3A+studies+in+poultry+%28Gallus+gallus%29+and+an+in+vitro+digestion%2FCaco-2+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+Journal%22%5BJournal%5D)">Biofortified red mottled beans (Phaseolus vulgaris L.) in a maize and bean diet provide more bioavailable iron than standard red mottled beans: studies in poultry (Gallus gallus) and an in vitro digestion/Caco-2 model.</a> Nutrition Journal. 10, 113(2011).</li>
<li>Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+thigh%2C+chicken+liver%2C+and+iron-fortified+wheat+flour+increase+iron+uptake+in+an+in+vitro+digestion%2FCaco-2+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+Research%22%5BJournal%5D)">Chicken thigh, chicken liver, and iron-fortified wheat flour increase iron uptake in an in vitro digestion/Caco-2 cell model.</a> Nutrition Research. 28 (12), 851-858 (2008).</li>
<li>Beasley, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+bread+wheat+improves+grain+iron+concentration+and+bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of bread wheat improves grain iron concentration and bioavailability.</a> Plant Biotechnology Journal. 17 (8), 1514-1526 (2019).</li>
<li>Zhu, L., Glahn, R. P., Nelson, D., Miller, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+soluble+ferric+pyrophosphate+to+common+iron+salts+and+chelates+as+sources+of+bioavailable+iron+in+a+Caco-2+cell+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparing soluble ferric pyrophosphate to common iron salts and chelates as sources of bioavailable iron in a Caco-2 cell culture model.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 5014-5019 (2009).</li>
<li>Wortley, G., Leusner, S., Good, C., Gugger, E., Glahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+availability+of+a+fortified+processed+wheat+cereal%3A+a+comparison+of+fourteen+iron+forms+using+an+in+vitro+digestion%2Fhuman+colonic+adenocarcinoma+%28Caco-2%29+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Iron availability of a fortified processed wheat cereal: a comparison of fourteen iron forms using an in vitro digestion/human colonic adenocarcinoma (Caco-2) cell model.</a> British Journal of Nutrition. 93 (1), 65-71 (2005).</li>
<li>Jumarie, C., Malo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+phosphatase+and+peptidase+activities+in+Caco-2+cells%3A+differential+response+to+triiodothyronine%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+and+Developmental+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">Alkaline phosphatase and peptidase activities in Caco-2 cells: differential response to triiodothyronine.</a> In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 30 (11), 753-760 (1994).</li>
<li>Engle, M. J., Goetz, G. S., Alpers, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+cells+express+a+combination+of+colonocyte+and+enterocyte+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Caco-2 cells express a combination of colonocyte and enterocyte phenotypes.</a> Journal of Cellular Physiology. 174 (3), 362-369 (1998).</li>
<li>Ferruzza, S., Rossi, C., Sambuy, Y., Scarino, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-reduced+and+serum-free+media+for+differentiation+of+Caco-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Alternatives+to+Animal+Experimentation%22%5BJournal%5D)">Serum-reduced and serum-free media for differentiation of Caco-2 cells.</a> Alternatives to Animal Experimentation. 30 (2), 159-168 (2013).</li>
<li>Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Tako, E., Glahn, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fast+cooking+and+enhanced+iron+bioavailability+properties+of+the+Manteca+yellow+bean+%28Phaseolus+vulgaris+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">The fast cooking and enhanced iron bioavailability properties of the Manteca yellow bean (Phaseolus vulgaris L).</a> Nutrients. 10 (11), 1609(2018).</li>
<li>Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Hooper, S. D., Hart, J. J., Glahn, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+white+or+yellow+dry+beans+%28Phaseolus+vulgaris+L.%29+into+a+heat+treated+flour+enhances+the+iron+bioavailability+of+bean-based+pastas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Functional+Foods%22%5BJournal%5D)">Processing white or yellow dry beans (Phaseolus vulgaris L.) into a heat treated flour enhances the iron bioavailability of bean-based pastas.</a> Journal of Functional Foods. 71, 104018(2020).</li>
</ol>

O autor não tem conflitos de interesse.

Desde sua criação, inúmeros estudos foram publicados que descrevem este método para o bioensaio celular Caco-2. As condições básicas permaneceram relativamente inalteradas desde a publicação inicial em 199818. No entanto, nos últimos 20 anos, inúmeros detalhes técnicos foram refinados e padronizados para produzir consistência sem precedentes na resposta ao bioensaio. A adesão cuidadosa e precisa à cultura celular e às condições de digestão in vitro são a chave para a resposta consistente ...

Para entender completamente a necessidade e o benefício da pesquisa da biodisponibilidade celular Caco-2 para a biodisponibilidade da Fe, é preciso primeiro entender as abordagens que estavam em vigor antes do advento desse modelo. A medição da biodisponibilidade fe a partir de um alimento ou refeição in vivo é uma tarefa desafiadora, particularmente quando combinações de alimentos precisam ser avaliadas em uma refeição ou dieta. A rotulagem isotópica tem sido a abordagem mais comum para a medição da biodisponibilidade fe nos últimos 50 anos1. A rotulagem isotópica é usada para estudos de refeição única e múltiplas refeições e é impraticável para estudos de longo prazo. Isótopos estáveis de Fe como 57Fe e 58Fe são os mais utilizados; no entanto, estudos têm sido realizados com radioisótopos como 59Fe, utilizando a contagem de corpo inteiro2. Para alimentos vegetais, a rotulagem isotópica tem sido feita através de rotulagem extrínseca ou intrínseca. Para rotulagem extrínseca, uma quantidade conhecida de isótopo é adicionada à comida ou refeição. O alimento é então misturado, e um período de equilíbrio de 15-30 min é incorporado ao protocolo antes do consumo. A cultura hidropônica que adiciona o isótopo à solução de nutrientes para incorporá-lo na planta enquanto ela cresce e se desenvolve - é necessária para a rotulagem intrínseca de alimentos vegetais. Os prós e contras de cada abordagem são discutidos abaixo.
Rotulagem isotópica extrínseca No início da década de 1970, a absorção de Fe humano foi estudada pela rotulagem extrínseca de Fe em alimentos, onde uma quantidade conhecida de isótopo é adicionada à quantidade conhecida de Fe na comida ou refeição, misturada e equilibrada por 15-30 minutos antes das medições. Várias quantidades de isótopos extrínsecos têm sido utilizadas, variando de 1% a 100% do Fe intrínseco, mas mais comumente na faixa de 7%-30%3. A rotulagem extrínseca baseia-se no pressuposto de que o isótopo fe extrínseco fica totalmente equilibrado com o Fe intrínseco da comida ou refeição. A absorção de isótopos extrínsecos é então medida, e cada átomo do isótopo extrínseco é calculado para representar um determinado número de átomos fe intrínsecos. Este cálculo é baseado nas quantidades relativas molares. Em 1983, múltiplos estudos de validação da técnica foram resumidos em artigode revisão 4. A validação da técnica foi feita comparando simultaneamente a absorção percentual do rótulo isotópico extrínseco à absorção percentual de um rótulo isotópico intrínseco. Assim, uma razão da absorção extrínseca para intrínseca próxima a 1 sugere que cada piscina de Fe foi igualmente absorvida. Na época, também foi considerada uma relação próxima a 1, representando o equilíbrio do isótopo extrínseco com o Fe intrínseco da comida ou refeição. As razões de absorção fe extrínseca à intrínseca variaram de valores médios de 0,40 a 1,62, com razão média (±SD) de 1,08 ± 0,14 em 63 comparações. É importante notar que, em todos os estudos resumidos nesta revisão, nenhum testou diretamente o equilíbrio do rótulo extrínseco com o Fe intrínseco. Em resumo, os autores da revisão concluíram o seguinte:
"A técnica de etiqueta extrínseca tem se mostrado válida para vários alimentos em determinadas condições experimentais. Mas, esse método ainda não pode ser considerado comprovado em relação a todos os tipos de alimentos. O método de etiqueta extrínseca não é apropriado para monitorar a absorção de ferro a partir de uma dieta que contém formas insolúveis de ferro. A validade desta técnica baseia-se no pressuposto básico de que a tag extrínseca troca completamente com todo ferro alimentar não-hemo endógeno. No momento, não se sabe como completamente as diferentes formas de ferro não-heme são rotuladas por uma tag extrínseca. Isso é importante à luz de estudos que sugerem que os inibidores de ferro podem afetar a etiqueta extrínseca de forma diferente de algumas formas de ferro não-heme nos alimentos. Pesquisas sobre fatores alimentares que podem prejudicar uma troca isotópica completa são escassas. Assim, a interpretação dos dados de biodisponibilidade da pesquisa de etiquetas extrínsecas requer a consideração de inibidores de troca que possam estar presentes na alimentação ou na dieta."
Desde 1983, foram publicados apenas dois estudos que avaliaram a exatidão da rotulagem extrínseca de Fe 3,5. Em ambos os estudos, o equilíbrio de um rótulo isotópico extrínseco foi diretamente comparado com o Fe intrínseco dos alimentos, que, nesses estudos, eram culturas alimentares básicas. Foram testadas variedades de feijão branco, vermelho e preto, juntamente com lentilhas e milho. Utilizando técnicas de digestão in vitro estabelecidas e a medição da solubilidade e precipitação de Fe, ambos os estudos demonstraram que a rotulagem isotópica extrínseca não resulta consistentemente em equilíbrio total, com evidências de que, para algumas variedades de feijão, a misequilibração pode ser muito alta dependendo da quantidade de isótopo extrínseco e da cordo casaco de sementes 3. Apesar das conclusões do artigo de revisão de 1983, os estudos de rotulagem extrínseca de feijão continuaramem 6,7,8,9,10,11,12. Nenhum desses estudos incluiu testar o equilíbrio do rótulo extrínseco com o Fe intrínseco.
Rotulagem intrínseca A rotulagem intrínseca de alimentos vegetais para a avaliação da biodisponibilidade fe elimina as questões de precisão do equilíbrio na rotulagem extrínseca. No entanto, essa abordagem não pode produzir grandes quantidades de material devido à exigência de espaço de estufa para a cultura hidropônica. A cultura hidropônica é intensiva em mão-de-obra, requer uma alta quantidade de isótopo estável caro, e muitas vezes resulta em crescimento vegetal diferente em termos de produção e concentração de sementes Fe. Devido ao custo, a rotulagem intrínseca só é adequada para estudos de pequena escala que visam compreender mecanismos subjacentes à absorção de Fe ou fatores que influenciam a absorção de Fe dos alimentos. A produção de 1-2 kg de uma cultura de alimentos básicos custa aproximadamente US $ 20.000-US $ 30.000 apenas para materiais, dependendo do isótopo e abordagem hidropônica13,14.
Dado os desafios associados à rotulagem isotópica, os investigadores procuraram desenvolver abordagens in vitro. Os métodos iniciais utilizaram alimentos gástricos e intestinais simulados, juntamente com a medição da solubilidade fe ou dialyzabilidade fe como estimativa de biodisponibilidade15. Tais estudos rapidamente descobriram que a dialise fe não era uma medida consistente de biodisponibilidade, pois Fe pode ser solúvel, firmemente ligado a compostos e, portanto, não trocável, levando à superestimação da biodisponibilidade. Para lidar com essas questões, evoluiu a metodologia de utilização de uma linha celular intestinal humana, adicionando assim um componente vivo e permitindo a medição da captação de Fe16. As células intestinais humanas-Caco-2 foram originadas de um carcinoma de cólon humano e têm sido amplamente utilizadas em estudos de absorção de nutrientes. Esta linha celular é útil, pois, na cultura, as células se diferenciam em enterócitos que funcionam de forma semelhante às células fronteiriças do intestino delgado. Estudos mostram que as células Caco-2 apresentam os transportadores apropriados e resposta a fatores que influenciam a absorçãode Fe 17,18.
Os estudos iniciais, utilizando radioisótopos para medir a absorção de Fe em células Caco-2, foram refinados para medir a absorção de Fe com base na formação de ferritina celular Caco-2. A medição da ferritina celular Caco-2 aumentou o rendimento da amostra e negou questões de manuseio de radioisótopos e o equilíbrio da Fe extrínseca com fe intrínseco19,20. A medição da absorção de Fe através da formação de ferritina permitiu aos pesquisadores estudar uma ampla gama de alimentos, incluindo refeições complexas21. Assim, a digestão simulada (in vitro) juntamente com a absorção fe celular Caco-2 proporcionou uma melhor avaliação fisiológica da absorção fe dos alimentos. É importante notar que este modelo determina principalmente diferenças relativas na biodisponibilidade fe. Como muitas linhas celulares úteis, as células Caco-2 também mostraram variabilidade na responsividade, mas mantiveram diferenças relativas consistentes na absorção de Fe entre os alimentos. A técnica adequada e a atenção cuidadosa aos detalhes podem melhorar a resposta consistente da formação de ferritina celular nas células Caco-2.
O modelo de célula in vitro/Caco-2 também é conhecido como bioensaio celular Caco-2. Este ensaio foi minuciosamente validado por meio de comparação direta com estudos humanos e animais22. Além da comparação paralela direta do bioensativo aos ensaios de eficácia humana, este modelo tem mostrado uma resposta qualitativamente semelhante na absorção de Fe à de humanos 18,19,23. Portanto, como abordagem in vitro, o bioensa de células Caco-2 garante alta credibilidade como ferramenta de triagem para avaliação da nutrição fe a partir de alimentos. Tem sido amplamente aplicado a inúmeros alimentos e produtos alimentícios 21,24,25,26,27,28.
Desde sua criação, em 1998, o bioensaio celular Caco-2 avançou no campo da nutrição fe, pois ajudou a identificar fatores que influenciam a absorção intestinal do Fe. Ao fazê-lo, esse modelo desenvolveu e refinou os objetivos de pesquisa para estudos humanos mais definitivos e menos dispendiosos. Pode-se também argumentar que o uso do modelo nega a necessidade de alguns testes em humanos.
Em resumo, a entrega relativa de Fe de um alimento ou refeição pode ser medida com o bioensaio celular Caco-2. Independentemente da quantidade de Fe na refeição de teste, o bioensaio define a quantidade relativa de Fe levada para o enterócito - a primeira etapa do processo de absorção. Este é o passo mais importante na definição da biodisponibilidade fe, pois na maioria das vezes o objetivo é medir com a intenção de melhorar ou, no mínimo, monitorar a qualidade nutricional de Fe em um alimento. Dado que o estado do ferro é regulado pela absorção e, portanto, a absorção de Fe é regulada em indivíduos deficientes fe para atender às necessidades nutricionais, as condições padrão do modelo são projetadas para que a absorção fe pelas células seja máxima. Dessa forma, o bioensaio fornece uma verdadeira medida do potencial do alimento para entregar Fe.

<table><tbody><tr><td>0,5 M HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A508-4 Traço de Ácido ClorídricoMetal Grau</td><td></td></tr><tr><td>18 megaohm água</td><td></td><td></td><td>Também conhecida como água destilada, deionizada</td></tr><tr><td>3,3&prime;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt</td><td>Sigma Aldrich Co</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>placas de 6 poços</td><td>Costar</td><td>3506</td><td>Uso para experimentos de bioensaio</td></tr><tr><td>ácido ascórbico</td><td>Sigma Extrato biliar Aldrich Co</td><td>A0278</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich Co</td><td>B8631</td><td></td></tr><tr><td>Caco-2 células</td><td>American Type Culture Collection</td><td>HTB-37</td><td>HTB-37 é uma variedade comum.</td></tr><tr><td>Frascos de cultura de células T225</td><td>Falcon</td><td>&nbsp; </td><td></td>353138</tr><tr><td>Frascos de cultura de células T25</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cultura de células T75</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>Chelex-100</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>142832</td><td>Conhecida como a resina de troca catiônica fraca no protocolo</td></tr><tr><td>colágeno</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>membrana de diálise</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>Spectra/Por 7 Tubo de Diálise RC Pré-tratado 15.000 MWCO</td><td>Spectra/Por 7 Tubo de Diálise RC Pré-Tratado 15.000 MWCO</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia Modificada' s</td><td>Meio Gibco</td><td>12100046</td><td>DMEM</td></tr> fator <tr><td>de crescimento epidérmico</td><td>Sigma Aldrich Co</td><td>E4127-5X.1MG</td><td></td></tr><tr><td>Ferritina ELISA Kit</td><td>de ensaio Eagle Biosciences</td><td>FRR31-K01</td><td></td></tr><tr><td>soro bovino fetal</td><td>R & D Systems</td><td>S12450</td><td>Optima</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich Co</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona-Solúvel em Água</td><td>Sigma Aldrich Co</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>anel de inserção</td><td>Corning Costar</td><td>não vendido</td><td>Transwell, para placa de 6 poços, sem</td></tr><tr><td>membrana de insulina</td><td>Sigma Aldrich Co</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich Co</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>coluna grande</td><td>VWR International</td><td>KT420400-1530</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium</td><td>Gibco</td><td>41500034</td><td>MEM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>pancreatina</td><td>Sigma Aldrich Co</td><td>P1750</td><td></td></tr><tr><td>PIPES sal dissódico</td><td>Sigma Aldrich Co</td><td>Piperazina-1,4-bis (ácido 2-etanossulfônico) sal dissódico P3768</td><td></td></tr><tr><td>pepsina suína</td><td>Sigma Aldrich Co</td><td>P6887 ou (P7012-25G Kit de ensaio de proteína Sigma</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>Kit de ensaio de proteína Bio-Rad DC 500-0116</td><td>Medição de anéis de silicone de proteína celular Caco-2</td></tr><tr><td></td><td>Web Seal, Inc Rochester NY</td><td>2-215S500</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>Selenito</td> <td>de sódioSigma Aldrich Co</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>ZellShield</td><td>Minerva Biolabs</td><td>13-0050</td><td>Use a 1% como antibiótico/antimicótico encomendado pela Thomas Scientific</td></tr></tbody></table>

o bioensaio celular caco-2 para medição da biodisponibilidade de ferro alimentar

The Caco-2 Cell Bioassay for Measurement of Food Iron Bioavailability

O conhecimento da biodisponibilidade fe é fundamental para a avaliação da qualidade nutricional da Fe nos alimentos. A medição in vivo da biodisponibilidade fe é limitada pelo custo, throughput e as ressalvas inerentes à rotulagem isotópica do alimento Fe. Assim, existe uma necessidade crítica de uma abordagem de alto rendimento e custo-benefício. O bioensaio celular Caco-2 foi desenvolvido para satisfazer essa necessidade. O bioensaio celular Caco-2 para biodisponibilidade fe utiliza digestão gástrica e intestinal simulada juntamente com a cultura de uma linha celular epitelial intestinal humana conhecida como Caco-2. Nas células de Caco-2, a absorção de Fe estimula a formação intracelular de ferritina, uma proteína de armazenamento Fe facilmente medida por ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA). Forma-se de ferritina proporcional à absorção de Fe; assim, medindo a produção de ferritina celular Caco-2, pode-se avaliar a absorção intestinal de Fe a partir de digestões simuladas de alimentos para o enterócito. 
Através dessa abordagem, o modelo replica o passo inicial chave que determina a biodisponibilidade de Alimentos Fe. Desde sua criação, em 1998, essa abordagem modelo tem sido rigorosamente comparada a fatores conhecidos por influenciar a biodisponibilidade humana fe. Além disso, tem sido aplicado em estudos paralelos, com três estudos de eficácia humana avaliando culturas bioesforificadas da Fe. Em todos os casos, o bioensaio previu corretamente as quantidades relativas da biodisponibilidade fe dos fatores, culturas e dieta geral. Este artigo fornece métodos detalhados sobre a cultura celular Caco-2, juntamente com o processo de digestão in vitro e ferritina celular ELISA necessário para conduzir o bioensa de célula Caco-2 para biodisponibilidade fe.

Identificação e medição da biodisponibilidade de Fe em culturas de alimentos básicos Uma das principais razões para o desenvolvimento desse modelo foi identificar fatores que influenciam a biodisponibilidade da Fe nas culturas alimentares básicas e fornecer uma ferramenta para os criadores de plantas que lhes permitiriam identificar e desenvolver variedades com biodisponibilidade fe aprimorada. O feijão comum (Phaseolus vulgaris) tem sido alvo globalmente como uma cultura para a biofortificaç...

O bioensaponenciamento celular Caco-2 para biodisponibilidade de ferro (Fe) representa uma abordagem econômica e versátil para avaliar a biodisponibilidade da Fe a partir de alimentos, produtos alimentícios, suplementos, refeições e até regimes dietéticos. Validada minuciosamente aos estudos humanos, representa o estado da arte para estudos de biodisponibilidade fe.

O Bioensaio celular Caco-2 para Medição da Biodisponibilidade de Ferro Alimentar

Knowledge of Fe bioavailability is critical to the assessment of the nutritional quality of Fe in foods. In vivo measurement of Fe bioavailability is ...

O conhecimento da biodisponibilidade de ferro é essencial para a avaliação da qualidade nutricional do ferro nos alimentos. O bioensaio celular Caco-2 foi desenvolvido para atender a essa necessidade crítica de pesquisa. Este bioensaio é uma abordagem econômica e de alto rendimento para determinar a biodisponibilidade de ferro de diferentes dietas.Pode ser usado para caracterizar fatores que influenciam a biodisponibilidade de ferro e o refino in vivo objetivos do estudo. Demonstrando o procedimento estará Yongpei Chang, um técnico de pesquisa do meu laboratório. Para começar, cultura as células Caco-2 por 7 a 10 dias, e uma vez que células suficientes estão disponíveis as células em um frasco não revestido de colágeno.Em seguida, cresça as células em frascos por sete dias e mude o meio em um dia alternativo. No sétimo dia use as células para semear as placas multi-poços. Semente as células Caco-2 a uma densidade de 50.000 células por centímetro quadrado em seis placas bem revestidas de colágeno.Adicionar DMEM suplementado com HEPES, FBS e solução antimíctica 1%antibiótico para as placas. Em seguida, incubar por 12 dias a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Continue muda

the-caco-2-cell-bioassay-for-measurement-of-food-iron-bioavailability

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, descrevemos um método baseado em colorimetria para determinar o teor de ferro não-heme no tecido hepático de camundongos. O sulfonato de batofenantrolina é usado como substrato cromogênico na presença de um agente redutor, que converte o ferro férrico em ferro ferroso quelatável.

Ensaio Colorimétrico à Base de Sulfonato de Batofenantrolina: Um Método Simples e Rápido para Quantificação de Ferro Não-Heme em Tecido Hepático de Camundongo

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para avaliar a biodisponibilidade de ferro em fontes alimentares complexas. A técnica combina a simulação da digestão humana com a absorção de ferro por células Caco-2 diferenciadas. A formação de ferritina intracelular atua como um marcador para a absorção celular de ferro.

Bioensaio de células Caco-2: um método in vitro para medir a biodisponibilidade de ferro em fontes alimentares complexas

Apresentamos um protocolo simples e confiável para medir o teor de ferro em tecidos vegetais usando o método colorimétrico do azul da Prússia.

Um método colorimétrico para medir o teor de ferro nas plantas

Este método de especiação de redox de ferro é baseado na espectrometria de massa de plasma capilar indutivamente acoplada com empilhamento de amostras combinado com análise curta em uma corrida. O método analisa rapidamente e fornece baixos limites de quantificação para espécies de redox de ferro em uma variedade diversificada de tecidos e amostras biofluidas.

Configuração da Espectrometria de Massa de Plasma Acoplada de Eletroforese Capilar (CE-ICP-MS) para quantificação de espécies de redox de ferro (Fe(II), Fe(III))

Este artigo demonstra como preparar e administrar ferro isotópico não radioativo ligado à transferrina para estudos de transporte de ferro na gravidez de camundongos. A abordagem para quantificar o ferro isotópico em compartimentos fetoplacentários também é descrita.

Quantificando o transporte de ferro através da placenta de camundongo in vivo usando isótopos de ferro não radioativos

Aqui, é fornecido um protocolo para a medição do teor de ferro não heme em tecidos animais, utilizando um simples e bem estabelecido ensaio colorimétrico que pode ser facilmente implementado na maioria dos laboratórios.

Medição do teor de ferro não-heme do tecido usando um ensaio colorimétrico baseado em banhontrolina

Descrevemos um ensaio fluorescente que pode confirmar de forma rápida e barata a capacidade de novos compostos de quelar o ferro. O ensaio mede a capacidade dos compostos de superar a atividade de ligação de ferro da fraca sonda fluorescente quelante de ferro Calceína, resultando em um aumento quantificável na fluorescência quando ocorre a quelação.

Método fluorescente sem células quantificável e barato para confirmar a capacidade de novos compostos de quelar ferro 

A técnica é apresentada para a coleta in vivo de amostras de líquido intersticial de sites pertinentes tecido (pele aqui, experimentalmente inflamação) para a medição de produtos bioquímicos mediação dor e inflamação.

Bioensaio In-Vivo humanos para a medição de tecidos específicos de Mediadores nociceptiva e inflamatória

Um método preciso para a avaliação da morte celular é descrito. O protocolo convencional melhora a anexina V / iodeto de propídio (PI) protocolos, que apresentam até 40% de falsos-positivos eventos em linhagens celulares e pilhas de uma ampla gama de modelos animais.

Modificado anexina V / propídio Assay Apoptose Iodeto para avaliação rigorosa da morte celular

Um método para rapidamente tela voláteis de plantas hospedeiras por medição da resposta electrofisiológica de orangeworm umbigo do adulto...

Bioensaio eletroantenográfica como uma ferramenta de triagem para voláteis da planta hospedeira

Aprenda a medir a biodisponibilidade de ferro alimentar usando o bioensaio celular Caco-2. Este método validado permite avaliar fontes de ferro em alimentos e suplementos de forma eficiente e econômica.

O Bioensaio celular Caco-2 para Medição da Biodisponibilidade de Ferro Alimentar

Explorar mais vídeos