Name: Voorbereiding van menselijk myocardiale weefsel voor langdurige teelt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Leer ex vivo teelt van menselijk ventriculaire myocardweefsel in een biomimetische kamer met pre- en afterload. Deze methode maakt continue registratie van contractiekracht mogelijk voor cardiovasculair onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Onderzoek werd gefinancierd door DZHK-subsidies 81Z0600207 (JH, PS en DM) en 81X2600253 (AD en TS).
De auteurs willen Claudia Fahney, Mei-Ping Wu en Matthias Semisch bedanken voor hun steun bij het voorbereiden van de opstellingen, evenals voor het regelmatige onderhoud van de weefselkweek.

Weefselverzameling voor de hier beschreven experimenten werd goedgekeurd door de Institutional Review Boards van de Universiteit van München en de Ruhr-Universiteit Bochum. Studies werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Verklaring van Helsinki. Patiënten gaven hun schriftelijke geïnformeerde toestemming voorafgaand aan weefselverzameling.
1. Weefselverwerving
<ol><li>Verkrijg menselijk weefsel van patiënten die een harttransplantatie of hartoperatie ondergaan.</li>
	<li>Voordat u het weefsel aanschaft, bereidt u 2 L cardioplege oplossing (verder aangeduid als snijbuffer (tabel 1)).</li>
	<li>Na het verkrijgen van een transmurale linkerventrikelbiopsie van 4 cm x 4 cm, plaatst u het weefsel onmiddellijk (binnen 5 minuten na excisie) in een afsluitbaar plastic steriel bekerglas voor eenmalig gebruik met ongeveer 70 ml koude (4 °C) snijbuffer. Bewaren bij 4 °C. OPMERKING: De snijbuffer die in dit protocol wordt gebruikt, maakt koude opslag (4 °C) van het weefsel tot 36 uur mogelijk. Dit maakt koud transport van het weefsel mogelijk vanuit klinieken die niet dicht bij het laboratorium liggen. Transporttijden ≤ 24 uur zijn echter optimaal gebleken.</li>
</ol>2. Bereiding van agarose en het vibratoom
<ol><li>Zorg ervoor dat er voldoende kweekkamers zijn voorbereid en gesteriliseerd (figuur 1A).<ol>
<li>Dompel de kamers en grafietelektroden onder in 1 L van een 10% isopropanoloplossing en roer een nacht. Breng de volgende dag de kamers gedurende 3 minuten over naar een 100% isopropanoloplossing en autoclaaf de grafietelektroden bij 120 °C gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Laat de kamers en grafietelektroden aan de lucht drogen onder een laminaire stromingskap.</li>
		<li>Bevestig een printplaat aan elk van de kamers volgens de beschikbare posities op de rocker. Plaats twee grafietelektroden op de printplaat volgens de instructies van de fabrikant.</li>
		<li>Plaats een petrischaaldeksel van 35 mm op de kamer om besmetting te voorkomen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zet het Myodish teeltsysteem (zie Materiaaltabel) op in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 door het systeem aan te sluiten op een computer (figuur 1B).</li>
	<li>Bereid de 4% low-melt agarose in snijbuffer (zonder glucose; Tabel 2). De agarose kan 6 maanden bij 4 °C bewaard worden.<ol>
<li>Smelt op de dag van het experiment een voorraad agarose-oplossing met behulp van een waterbad dat is ingesteld op 80 °C. Afhankelijk van de hoeveelheid duurt het smelten ongeveer 30 minuten.</li>
		<li>Wanneer de agarose vloeibaar is, zuig dan 8 ml vloeibare agarose op in een spuit van 10 ml, met nog eens 2 ml lucht. Sluit de spuit met een steriele dop en plaats deze ondersteboven in een waterbad van 37 °C gedurende 20 minuten, om te voorkomen dat de agarose stolt en om de temperatuur in evenwicht te brengen om hyperthermieschade van het monster te voorkomen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schakel, indien aanwezig, het waterkoelingsapparaat van het vibratoom ten minste 30 minuten voorafgaand aan het snijden van het weefsel in om voldoende koelcapaciteit mogelijk te maken. Stel de temperatuur van de watercirculatie in op 4 °C. OPMERKING: De snijbak en koelplaat die hier werden gebruikt, bevatten beide een ingebouwde watercirculatie. Dit wordt sterk aanbevolen voor koeling en om de besmettingsrisico's te verlagen. Het is echter ook mogelijk om ijs als koeltechniek te gebruiken. Ook hoeft het waterkoelingsapparaat op dit punt in het protocol niet te worden aangesloten op de snijlade en/of koelplaat van de vibratome.</li>
	<li>Reinig de snijbak en monsterplaat van de vibratome door alle oppervlakken gedurende ten minste 3 minuten met 100% isopropanol te spoelen. OPMERKING: Afhankelijk van het gebruikte vibratoomsysteem kan de opstelling van het vibratoom verschillen. Raadpleeg de handleiding van het vibratoom dat in het laboratorium aanwezig is voor informatie over de opstelling en de kalibratiemethoden van het mes.</li>
	<li>Vul de snijbak tot 90%-95% met snijbuffer. In de huidige opstelling komt dit overeen met ongeveer 400 ml. Sluit de slang van het waterkoelingsapparaat aan op de kleppen op de snijbak en koelplaat van het vibratoom.</li>
	<li>Desinfecteer alle gereedschappen die nodig zijn voor de bereiding door ze gedurende 5 s onder te dompelen in een 100% isopropanoloplossing. Verwijder de gereedschappen uit de isopropanoloplossing en droog aan de lucht onder de laminaire stromingskap.</li>
</ol>3. Bijsnijden en insluiten van de monsters
<ol><li>Breng het weefselmonster over in een petrischaaltje van 100 mm gevuld met koude snijbuffer. Bewaar de schaal op een koelplaat bij 4 °C (aangesloten op koeler of op ijs geplaatst).</li>
	<li>Verwijder endocardiale trabeculae door het endocardium met een pincet vast te houden en met een schaar ongeveer 3 mm endocardweefsel weg te snijden. Verwijder op dezelfde manier overmatig vetweefsel onder het epicard, indien aanwezig.</li>
	<li>Fixeer het gesneden weefselmonster, endocardiale kant naar boven, tot een rubberen lap van 2 cm x 2 cm met behulp van vier naalden van 0,9 mm x 70 mm 20 G die in een vierkante positie (0,9 cm x 0,9 cm) zijn bevestigd; Figuur 1C, D). Zorg ervoor dat de diagonale rand van elke naaldpunt naar binnen wijst. Dit verbetert de fixatie en voorkomt schade aan het myocardium. LET OP: De oriëntatie van het bovengenoemde vierkant moet orthogonaal zijn ten opzichte van de verwachte overheersende myofiberrichting.</li>
	<li>Snijd al het overtollige weefsel buiten het vierkant van de vier naalden weg met behulp van een scalpel. Als de grootte van het oorspronkelijke monster het toelaat, gebruikt u tijdens dit preparaat twee monsters van myocardiale weefsels uit hetzelfde onbewerkte monster.</li>
	<li>Plaats het bijgesneden monster met een pincet op een steriel stuk weefsel om eventuele overtollige snijbuffer op het monster te verwijderen. Om uitdroging van het monster te voorkomen, mag u het monster niet langer dan 10 s op het weefsel bewaren.</li>
	<li>Plaats het (de) monster(s) in een petrischaaltje van 35 mm, zodat het mes loodrecht op de uitlijning van de cardiomyocyten snijdt en het epicardium naar beneden is gericht. Als het preparaat twee monsters bevat, zorg er dan voor dat de monsters gecentreerd zijn en elkaar niet aanraken.</li>
	<li>Neem de agarose spuit uit het waterbad en dompel het (de) monster(s) onder in agarose. (Figuur 2A). Laat de agarose 5 min stollen op een koelplaat. De monsters moeten in contact blijven met de petrischaal, die ervoor zorgt dat het snijvlak evenwijdig is aan de overheersende myocardiale vezelrichting. LET OP: Maak de spuit niet volledig leeg om luchtbellen te voorkomen. Let op de hoeveelheid agarose die in de spuit achterblijft tijdens het onderdompelen van de monsters. In het geval van luchtbellen in de schaal met de monsters, trekt u voorzichtig luchtbellen terug in de spuit.</li>
</ol>4. De monsters op de snijbak plaatsen
<ol><li>Verwijder de gestolde agarose met het (de) monster(s) uit de petrischaal van 35 mm met een spatel of een soortgelijk gereedschap door deze tussen het monster en de zijkant van de petrischaal te wiggen. Snijd een deel van de agarose weg met behulp van een scalpel terwijl je de monsters bedekt houdt. LET OP: Verwijder niet te veel van de agarose. Er moet ten minste 5 mm agarose overblijven aan de lange en korte zijden in het X / Z-vlak. OPMERKING: Stap 4.2-4.4 moet snel achter elkaar worden uitgevoerd (d.w.z. maximaal 5 s). Heb alle benodigde tools binnen handbereik voordat u begint. Na plaatsing is geen herpositionering van het monster mogelijk. Probeer de blootstelling van de lijm aan lucht en vocht te beperken. Contact met lucht of vloeistoffen zal de lijm stollen, waardoor deze onbruikbaar wordt.</li>
	<li>Plaats en verdeel met een pipet 60 μL lijm in en rond het midden van het snijplatform.</li>
	<li>Plaats de epicardiale zijde van het monster in agarose met een pincet op het gelijmde gebied. Verplaats niet. De endocardiale zijde van het monster moet zichtbaar zijn in de agarose. Laat de lijm 1 min stollen. Druk de agarose met het monster voorzichtig vanaf de bovenkant aan met een stomp gereedschap (bijv. pincet) terwijl u voorkomt dat u in de agarose snijdt of deze beschadigt.</li>
	<li>Plaats het monsterplatform op de aangewezen plaats in de snijbak van het vibratoom, gevuld met snijbuffer.</li>
</ol>5. Het vibratoom starten
<ol><li>Stel de trillingsamplitude in op 1 mm en de initiële snijsnelheid op 0,07 mm/s. Stel de dikte van de plak in op 300 μm om plakjes te snijden.</li>
	<li>Zolang het mes alleen de agarose snijdt, verhoogt u de snijsnelheid tot het maximum, dat in dit geval 1,50 mm / s is. Zodra het vibratoom begint met het snijden van het weefsel, verlaagt u de snelheid onmiddellijk tot 0,07 mm / s. OPMERKING: Als het weefsel niet soepel wordt gesneden, bijvoorbeeld als er grote fibrotische gebieden in het monster zijn, kan dit helpen om de snijamplitude tot 1,5 mm te verhogen en de snijsnelheid te verlagen tot 0,04 mm / s.</li>
</ol>6. Medium- en incubatorvoorbereiding tijdens de snijprocedure
<ol><li>Vul elke teeltkamer met 2,4 ml compleet teeltmedium (tabel 3).</li>
	<li>Plaats de met medium gevulde teeltkamers op het teeltsysteem in de incubator set op 37 °C, 5% CO2, 21% O2 en een vochtigheid van 80%. Breng het medium gedurende ten minste 20 minuten in evenwicht.</li>
	<li>Sluit het teeltsysteem aan op een computer en start het bijbehorende softwareprogramma.</li>
	<li>Stel de rockersnelheid in op 60 rpm en stel de stimulatieparameters in (stimulatiepulsen en frequentie). Stel voor menselijke cardiale plakjes de standaardstimulatie in op bifasische impulsen met 50 mA stroom, elk bestaande uit 3 ms positieve stroom, een 1 ms pauze en een 3 ms puls van omgekeerde stroom, met een pacing rate van 30 slagen per minuut (BPM). OPMERKING: In goed bewaarde weefsels is de typische stimulatiedrempel ongeveer 15 mA. Om betrouwbare stimulatie te garanderen en rekening te houden met een eventuele verhoging van de stimulatiedrempel, wordt aanbevolen om de stroom in te stellen op een waarde die de stimulatiedrempel twee- tot drievoudig overschrijdt.</li>
	<li>Controleer de elektrode-indicatoren van de software om te controleren of de elektroden van de teeltkamers correct werken. OPMERKING: Actie is nodig wanneer de kanaalindicator in de teeltsoftware rood wordt. In dit geval zijn de bipolaire pulsladingen niet in evenwicht.</li>
</ol>7. De plakjes voorbereiden
OPMERKING: Initiële subendocardiale plakjes zijn vaak niet geschikt voor weefselkweek en moeten worden weggegooid vanwege ongelijke morfologie. Na de eerste vijf tot 10 plakjes verbeteren de segmenttextuur en morfologie. De ideale plak is minstens 1 cm x 1 cm, heeft geen of slechts beperkte fibrotische vlekken, is niet gefragmenteerd en heeft homogene vezeluitlijning (figuur 2B, D). Interstitiële fibrose, gelegen tussen de myocytvezels, is vaak aanwezig in falend menselijk myocardium. Verrassend genoeg is dit geen negatieve voorspeller van teeltsucces.
<ol><li>Giet een voldoende hoeveelheid koude snijbuffer in een petrischaaldeksel van 5 cm om ervoor te zorgen dat plakjes niet uitdrogen. Plaats de plakjes in het deksel van de petrischaal met daarin de koude snijbuffer.</li>
	<li>Scheid de agarose van het weefsel met behulp van een pincet. Voorkom het aanraken van het weefsel. Behandel het weefsel zorgvuldig, omdat eventuele schade aan het weefsel het succespercentage van de teelt zal verminderen.</li>
	<li>Bepaal de richting van de myocardiale vezels door een nauwkeurige inspectie tegen een lichtbron. Dit is van belang bij het bevestigen van de plastic driehoeken aan het weefsel in stap 7.6. OPMERKING: Stap 7.4 en 7.5 moeten snel achter elkaar worden uitgevoerd, binnen 5 s.</li>
	<li>Bevestig twee plastic driehoeken aan een monster met behulp van lijm om het weefsel in de kweekkamers te verankeren.<ol>
<li>Leg 1 μL lijm op een steriel petrischaaldeksel. Gebruik een gehaakt pincet om een van de geautoclaveerde plastic driehoeken op te pakken. Dompel snel de voorrand van de driehoek in de lijm en plak de driehoek op het monster, loodrecht op de cardiomyocytenuitlijning. Herhaal dit voor de andere driehoek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Knip weefsel af dat de driehoeksbreedte overschrijdt met een scalpel (figuur 2C). Plaats de plak met de twee gemonteerde driehoeken terug in de snijbuffer van de snijbak. OPMERKING: Herhaal stap 7.2 tot en met 7.5 totdat er voldoende plakjes klaar zijn om de teeltkamers te vullen. We raden aan om een paar extra plakjes te bereiden om plakjes met slechte contractie te kunnen vervangen.</li>
</ol>8. Montage van de plakjes
LET OP: De nabelasting wordt bepaald door de stijfheid van de veerdraad in de teeltkamers. Er zijn drie verschillende types beschikbaar, gebaseerd op de dikte van de veerdraad.
<ol><li>Neem een medium gevulde kweekkamer uit de incubator. Selecteer een van de voorbereide segmenten en plaats deze in de kamer door één driehoek aan elke pin aan te sluiten.</li>
	<li>Pas de afstand tussen de montagepennen aan op basis van de monstergrootte. Zorg ervoor dat het monster is ondergedompeld in medium. Plaats de kamer terug in de aangewezen socket van het teeltsysteem in de incubator. LET OP: Span het weefsel niet te veel en buig de veerdraad niet te veel!</li>
	<li>Stel de voorspanning in na plaatsing van de schotel op de rocker.<ol>
<li>Verminder de voorspanning door de stelschroef tegen de klok in te draaien. Doe dit totdat de basislijn van de bijbehorende grafiek op het computerscherm niet meer verandert.</li>
		<li>Verhoog voorzichtig de voorspanning (d.w.z. verhoog de spanning) door de stelschroef met de klok mee te draaien. Voor de kamers met de hoogste stijfheid, ga door totdat de overeenkomstige basislijn in de grafiek is toegenomen met 1000-1200 eenheden, wat overeenkomt met 1 mN voorspanning. OPMERKING: De exacte afstelling is afhankelijk van de individuele veerconstante van een teeltkamer, die kan worden bepaald door kalibratie voorafgaand aan een experiment volgens de instructies van de fabrikant. De opnamesoftware maakt het mogelijk om rekening te houden met de kalibratie van de individuele kamer, zodat de krachten gelijkmatig in μN worden weergegeven. Het wordt aanbevolen om elektrische stimulatie toe te passen vanaf het begin van de teelt. Als zodanig is het goed mogelijk dat de slice begint samen te trekken tijdens de preload-aanpassing. Richt u in dit geval op de diastolische basislijn om de voorbelasting te beoordelen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Het medium veranderen
<ol><li>Bereid het teeltmedium volgens het recept in tabel 3. Voeg kort voor gebruik van het medium 50 μL β-mercaptoethanol (50 mM) toe aan een buis van 50 ml. Bewaren bij 4 °C.</li>
	<li>Wissel eens in de 2 dagen het teeltmedium gedeeltelijk om. Ververs het medium om de 2 dagen, als langdurige teelt van de myocardiale plakjes gewenst is.</li>
	<li>Verwarm het verse medium voor in een waterbad of heteluchtincubator bij 37 °C gedurende 30-45 minuten. Verwijder een kweekkamer uit de incubator en plaats deze onder een laminaire stromingskap. LET OP: Het is essentieel om de kamer, evenals het medium, warm te houden bij 37 °C (> 35 °C) om hypercontracturen als gevolg van lage temperaturen te voorkomen. Minder duidelijke schade kan aanwezig zijn als een toename van diastolische spanning binnen enkele uren na medium uitwisseling. Dit lijkt misschien te herstellen, maar herhaalde stress kan leiden tot accumulerende verslechtering.</li>
	<li>Verwijder het medium uit de teeltkamer en laat ongeveer 0,8 ml in de kamer achter. Voeg 1,6 ml vers medium toe aan dezelfde kamer. Het totale volume van het medium moet ongeveer 2,4 ml per kamer zijn.</li>
	<li>Plaats de afdekking van de kamer terug en plaats de teeltkamer terug in zijn respectieve positie.</li>
</ol>

<ol><li>George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+cardiac+electrophysiology+assessment+by+dual+voltage+and+calcium+optical+mapping+of+human+organotypic+cardiac+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Expereiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices.</a> Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781(2020).</li>
<li>Lu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+stretch+enhances+growth+and+maturation+of+3D+stem-cell-derived+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium.</a> Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).</li>
<li>Pontes Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology%2C+adhesion+junctions%2C+presence+of+myofibrils+and+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PloS one. 7 (5), 38147(2012).</li>
<li>Klumm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+cultivation+of+human+atrial+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Long-term cultivation of human atrial myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 13, 839139(2022).</li>
<li>Krane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+defects+in+cardiac+lineage+commitment+and+maturation+cause+hypoplastic+left+heart+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome.</a> Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).</li>
<li>Miller, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+slice+culture+system+reliably+demonstrates+clinical+drug-related+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. , 406(2020).</li>
<li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li>
<li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organotypic+cultured+cardiac+slices%3A+new+platform+for+high+throughput+preclinical+human+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).</li>
<li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slicing+and+culturing+pig+hearts+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913(2020).</li>
<li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+biomimetic+culture+system+for+pig+and+human+heart+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices.</a> Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).</li>
<li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).</li>
<li>Abu-Khousa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+degree+of+t-system+remodeling+predicts+negative+force-frequency+relationship+and+prolonged+relaxation+time+in+failing+human+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium.</a> Frontiers in Physiology. 11, 182(2020).</li>
<li>Bojkova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+infects+and+induces+cytotoxic+effects+in+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).</li>
<li>Esfandyari, D. A. -O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-365+regulates+human+cardiac+action+potential+duration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration.</a> Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+gene+editing+ameliorates+skeletal+and+cardiac+muscle+failure+in+pig+and+human+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).</li>
<li>Pitoulis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodelling+of+adult+cardiac+tissue+subjected+to+physiological+and+pathological+mechanical+load+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro.</a> Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).</li>
<li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nifedipine+blocks+Ca2%2B+store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2%2B+channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li>
<li>de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calciseptine%2C+a+peptide+isolated+from+black+mamba+venom%2C+is+a+specific+blocker+of+the+L-type+calcium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).</li>
<li>Schleifer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+molecular+modelling+study+of+the+calcium+channel+blockers+nifedipine+and+black+mamba+toxin+FS2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computer-Aided+Molecular+Design%22%5BJournal%5D)">Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).</li>
<li>Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dihydropyridine+%28Bay-K8644%29+that+enhances+calcium+currents+in+guinea+pig+and+calf+myocardial+cells.+A+new+type+of+positive+inotropic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent.</a> Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).</li>
<li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+slices+come+to+age%3A+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li>
<li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li>
</ol>

JH, PS, DM en KL hebben niets te onthullen. AD en TS zijn aandeelhouders van InVitroSys GmbH, dat het Myodish teeltsysteem levert.

In het verleden heeft cardiovasculair onderzoek grote vooruitgang geboekt bij de teelt van cardiomyocyten. De 3D-teelt van cardiomyocyten met intacte geometrie is echter nog niet goed ingeburgerd. Vergeleken met eerdere protocollen die werden toegepast voor ex vivo kweek van myocardiaal weefsel, lijkt het protocol dat we hier beschreven meer op de in vivo omgeving van het weefsel. Bovendien zorgt de toepassing van pre- en afterload voor een meer biomimetische omgeving. We zijn in staat om de continue re...

In het afgelopen decennium heeft de in vitro kweek van myocardiale cellen grote vooruitgang geboekt, variërend van 2D- en driedimensionale (3D) technieken tot het gebruik van organoïden en geïnduceerde pluripotente stamcellen gedifferentieerd tot cardiale myocyten 1,2,3. Ex vivo en primaire celkweek is van grote waarde gebleken, vooral voor genetisch onderzoek en medicijnontwikkeling 4,5,6. Het gebruik van menselijke weefsels verbetert de translationele waarde van de resultaten. Langdurige 3D-teelt van myocardiale weefsels met intacte geometrie is echter niet goed ingeburgerd. De intacte geometrie is een belangrijk kenmerk om in vivo omstandigheden na te bootsen, omdat een goede hartfunctie, communicatie tussen verschillende cellen en cel-matrixinteracties vereisten zijn. Myocardiale weefselkweek ging door verschillende ontwikkelingsfasen. Het succespercentage en de stabiliteit van ex vivo myocardiale weefselkweek waren aanvankelijk vrij laag, maar recente benaderingen hebben veelbelovende resultaten opgeleverd 7,8,9,10,11.
Fischer et al. waren de eersten die aantoonden dat de levensvatbaarheid en contractiele prestaties van menselijk myocardiaal weefsel gedurende vele weken kunnen worden gehandhaafd in ex vivo celkweek7. Hun techniek was gebaseerd op dunne weefselschijfjes gesneden uit geëxplanteerd menselijk myocardium, die werden gemonteerd in nieuw ontwikkelde kweekkamers die gedefinieerde biomechanische omstandigheden en continue elektrische stimulatie boden. Deze kweekmethode lijkt sterk op de in vivo functie van myocardiaal weefsel en is gereproduceerd door verschillende onafhankelijke onderzoeksgroepen 2,12,13,14,15. Belangrijk is dat de door Fischer et al. gebruikte kamers ook een continue registratie van ontwikkelde krachten gedurende maximaal 4 maanden mogelijk maakten en zo ongekende mogelijkheden openden voor fysiologisch en farmacologisch onderzoek naar intact humaan myocardium7.
Vergelijkbare technieken werden onafhankelijk ontwikkeld door andere groepen en toegepast op menselijk, ratten-, varkens- en konijnenmyocardium 7,10,11. Pitoulis et al. ontwikkelden vervolgens een meer fysiologische methode, die de normale kracht-lengterelatie tijdens een contractiecyclus reproduceert, maar minder geschikt is voor high-throughput analyse16. Als zodanig kan de algemene benadering van biomimetische teelt worden beschouwd als een verdere stap in de reductie, verfijning en vervanging (3R) van dierproeven.
Het benutten van dit potentieel vereist echter gestandaardiseerde procedures, analyses met een hoog gehalte en een hoog doorvoerniveau. We presenteren een techniek die geautomatiseerd snijden van levend menselijk myocardium combineert met in vitro onderhoud in een biomimetisch teeltsysteem dat commercieel beschikbaar is geworden (zie Materiaaltabel). Met de voorgestelde aanpak wordt het aantal afzonderlijke plakjes dat kan worden gegenereerd uit een enkel transmuraal myocardiaal specimen alleen beperkt door de verwerkingstijd. Een exemplaar van voldoende grootte en kwaliteit (3 cm x 3 cm) levert vaak 20-40 plakjes weefsel op die gemakkelijk worden gesneden met een geautomatiseerd vibratoom. Deze plakjes kunnen in teeltkamers van het systeem worden geplaatst. De kamers maken elektrische stimulatie mogelijk, waarvan de parameters kunnen worden gemoduleerd (d.w.z. pulsduur, polariteit, snelheid en stroom), evenals de aanpassing van voor- en nabelasting, met behulp van veerdraden in de kamers. De samentrekking van elke plak wordt geregistreerd door de beweging van een kleine magneet die aan een veerdraad is bevestigd en weergegeven als een interpreteerbare grafiek. Gegevens kunnen te allen tijde worden vastgelegd en geanalyseerd met behulp van vrij beschikbare software. Afgezien van de constante baseline pacing, kunnen geplande protocollen worden uitgevoerd om hun refractaire periode, stimulatiedrempel, post-pauze-potentiatie en kracht-frequentierelatie functioneel te beoordelen.
Deze biomimetische teelt op lange termijn van meerdere myocardiale plakjes uit een individueel hart maakt de weg vrij voor toekomstig ex vivo onderzoek in zowel menselijk als dierlijk weefsel en vergemakkelijkt de screening op therapeutische en cardiotoxische geneesmiddeleffecten in de cardiovasculaire geneeskunde. Het is al toegepast op verschillende experimentele benaderingen 2,12,13,15. Hier geven we een gedetailleerde stapsgewijze beschrijving van de voorbereiding van menselijk weefsel en bieden we oplossingen voor vaak voorkomende teeltproblemen.

<table><tbody><tr><td>Chemie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose Low melting point</td><td>Roth</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>Bay-K8644</td><td>Cayman Chemical</td><td>19988</td><td></td></tr><tr><td>BDM (2,3-Butanedione monoxime)</td><td>Sigma</td><td>B0753-1kg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2*H2O</td><td>Merck</td><td>2382.1</td><td></td></tr><tr><td>Calciseptine</td><td>Alomone Labs</td><td>SPC-500</td><td></td></tr><tr><td>Glucose*H2O</td><td>AppliChem</td><td>A3730.0500</td><td></td></tr><tr><td>H2O</td><td>BBraun</td><td>3703452</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AppliChem</td><td>A1069.0500</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>BBraun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol 100%</td><td>SAV LP GmbH</td><td>UN1219</td><td></td></tr><tr><td>ITS-X-supplement</td><td>Gibco</td><td>5150056</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04933.0500</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Gibco</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2*6H2O</td><td>AppliChem</td><td>A1036.0500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4*H2O</td><td>Merck</td><td>1.06346.0500</td><td></td></tr><tr><td>Nifedipine</td><td>Sigma</td><td>N7634-1G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / streptomycin x100</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>AppliChem</td><td>A1108.0100</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoriumapparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow cabinet</td><td>Thermo Scientific</td><td>KS15</td><td></td></tr><tr><td>Frigomix waterpomp en koeling + BBraun Thermomix BM</td><td>BBraun</td><td></td><td>In-house gemaakte combinatie van koel- en verwarmingsoplossing.</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Binder</td><td>CB240</td><td></td></tr><tr><td>MyoDish kweeksysteem</td><td>InVitroSys GmbH</td><td>MyoDish 1</td><td>Myodish kweeksysteem</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200s</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad 37 graden</td><td>Haake</td><td>SWB25</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad 80 graden</td><td>Daglef Patz KG</td><td>7070</td><td></td></tr><tr><td>Materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mL plastic enkele-gebruik beker</td><td>Sarstedt</td><td>75.562.105</td><td></td></tr><tr><td>Filtratie-eenheid, Steritop Quick Release</td><td>Millipore</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Naalden 0.9 x 70 mm 20G</td><td>BBraun</td><td>4665791</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof driehoeken</td><td></td><td></td><td>In-house gemaakt</td></tr><tr><td>Razor Derby premium</td><td>Derby Tokai</td><td>B072HJCFK6</td><td></td></tr><tr><td>Razor Gillette Silver Blue</td><td>Gillette</td><td>7393560010170</td><td></td></tr><tr><td>Schaarwegbaar scalpel</td><td>Feather</td><td>02.001.30.020</td><td></td></tr><tr><td>Spuit 10 mL Luer tip BD Discardit</td><td>BBraun</td><td>309110</td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweekschaal 10 cm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweekschaal 3.5 cm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Buizen 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding van menselijk myocardiale weefsel voor langdurige teelt

Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation

Cardiomyocytenteelt heeft een groot aantal ontwikkelingen doorgemaakt, variërend van tweedimensionale (2D) celkweek tot van iPSC afgeleide organoïden. In 2019 werd een ex vivo manier aangetoond om myocardiale plakjes verkregen uit menselijke hartmonsters te cultiveren, terwijl de in vivo toestand van myocardiale contractie werd benaderd. Deze monsters zijn meestal afkomstig van harttransplantaties of plaatsingen van linkerventrikelhulpmiddelen. Met behulp van een vibratoom en een speciaal ontwikkeld teeltsysteem worden 300 μm dikke plakken tussen een vaste en een veerdraad geplaatst, waardoor een stabiele en reproduceerbare teelt gedurende enkele weken mogelijk is. Tijdens de teelt worden de plakjes continu gestimuleerd volgens individuele settings. Contracties kunnen in realtime worden weergegeven en geregistreerd en farmacologische middelen kunnen gemakkelijk worden toegepast. Door de gebruiker gedefinieerde stimulatieprotocollen kunnen worden gepland en uitgevoerd om vitale contractieparameters zoals post-pauze-potentiatie, stimulatiedrempel, kracht-frequentierelatie en refractaire periode te beoordelen. Bovendien maakt het systeem een variabele voor- en nabelastingsinstelling mogelijk voor een meer fysiologische teelt.
Hier presenteren we een stapsgewijze handleiding over het genereren van een succesvolle langetermijnkweek van menselijke linkerventrikel myocardiale plakjes, met behulp van een commerciële biomimetische teeltoplossing.

De samentrekking van de myocardiale plakjes werd weergegeven op het computerscherm na het inbrengen van de teeltkamer in de overeenkomstige connector (figuur 3). De samentrekking van de menselijke myocardiale plakjes begon onmiddellijk na stimulatie. De plakjes hypercontracteerden gedurende 5-10 min. Dit was zichtbaar als een toename van diastolische krachten, veroorzaakt door een tonische contractuur van beschadigde weefselfracties. Dit proces werd binnen 1-1,5 uur in verschillende mate ter...

We presenteren een protocol voor ex vivo kweek van humaan ventriculaire myocardiale weefsel. Het maakt een gedetailleerde analyse van contractiekracht en kinetiek mogelijk, evenals de toepassing van pre- en afterload om de in vivo fysiologische omgeving beter na te bootsen.

Voorbereiding van menselijk myocardiale weefsel voor langdurige teelt

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, ...

Met behulp van dit protocol kunnen menselijke linkerventrikelweefselschijfjes ex vivo worden gekweekt in een biomimetische kamer. De toepassing van pre- en afterloads verbetert de gelijkenis van de fysiologische omgeving. Deze techniek maakt continue registratie van weefselcontractie mogelijk.Door de gebruiker gedefinieerde stimulatieprotocollen maken de beoordeling mogelijk van vitale contractieparameters zoals potentiatie na pauze, stimulatiedrempel, kracht-frequentierelatie en refractaire periode. De langdurige teelt van myocardiale plakjes, met behulp van deze opstelling, zal de weg vrijmaken voor toekomstig ex vivo onderzoek, waardoor deze screening op therapeutische en cardiotoxische geneesmiddeleffecten in de cardiovasculaire geneeskunde wordt vergemakkelijkt. Om te beginnen dompelt u de teeltkamers en grafietelektroden onder in één liter van een 10% isopropanoloplossing en roert u deze nacht.Breng de volgende dag de kamers gedurende 3 minuten over naar een 100% isopropanoloplossing en laat vervolgens de kamers en grafietelektroden aan de lucht drogen onder een laminaire stromingskap. Bevestig een printplaat aan elke kamer volgens de beschikbare posities op de rocker. Plaats

preparation-of-human-myocardial-tissue-for-long-term-cultivation

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Volwassen hartspiercellen zijn primaire cellen die kunnen worden geïsoleerd uit dierlijke harten en gekweekt voor meerdere dagen. Binnen deze cultuur periode adenovirale gentransfer kan gebruikt worden om genetisch gecodeerd biosensoren (GEBS) of TL-fusie-eiwitten uit te drukken. Beide benaderingen laten cellulaire onderzoeken door middel van confocale microscopie.

Isolatie en genetische manipulatie van Adult hartspiercellen voor confocale Imaging

We beschrijven een betrouwbare methode voor het isoleren van volwassen muis hartspiercellen. Dit protocol geeft een consistent resultaat voor de cultuur van functionele volwassen hartspiercellen uit verschillende genetisch gemodificeerde muizen.

Isolatie en cultuur van de volwassen muis Cardiomyocytes voor mobiele Signalering en<em&gt; In vitro</em&gt; Hypertrofie

Dit manuscript beschrijft de creatie van gedefinieerde geëngineerde hartweefsels met behulp van uitdrukking van oppervlaktemarkers en celsortering. De gedefinieerde weefsels kunnen vervolgens worden gebruikt in een multi-weefsel bioreactor om mechanismen van hartceltherapie te onderzoeken om zo een functioneel, maar gecontroleerd, modelsysteem van het menselijk hart te bieden.

De bouw van Defined Human Engineered hartweefsel om te studeren Mechanismen van Cardiac Cell Therapy

Verscheidene protocollen zijn ontwikkeld en beschreven voor de isolatie van verschillende hartcel typen uit een rat hart. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol beschreven dat de isolatie van hoge kwaliteit grote hartcellen (cardiomyocyten, endotheelcellen en fibroblasten) van een enkel preparaat mogelijk maakt, waardoor de experimentele kosten worden verminderd.

Gelijktijdige isolatie van hoogwaardige cardiomyocyten, endothelcellen en fibroblasten uit een volwassen rat hart

Dit protocol beschrijft de complete decellularization van menselijke myocard met behoud van de componenten van de extracellulaire matrix. Verdere verwerking van de resultaten van de extracellulaire matrix in de productie van deeltjes en een cytoprotective zelfassemblerende hydrogel.

Verwerking van menselijke cardiale weefsels richting de extracellulaire Matrix zelf monteren Hydrogel voor In Vitro en In Vivo toepassingen

Dit protocol beschrijft hoe hartweefsel te snijden en te kweken onder fysiologische omstandigheden gedurende 6 dagen. Dit cultuursysteem kan worden gebruikt als een platform voor het testen van de werkzaamheid van nieuwe harthartfalen therapieën evenals betrouwbare testen van acute cardiotoxiciteit in een 3D-hartmodel.

Snijden en kweken Varkensharten onder fysiologische omstandigheden

Gepresenteerd is een protocol voor de isolatie van menselijke en dierlijke ventriculaire cardiomyocyten van vibratome-cut myocardische plakjes. Hoge opbrengsten van calciumtolerante cellen (tot 200 cellen/mg) kunnen worden verkregen uit kleine hoeveelheden weefsel (&lt;50 mg). Het protocol is van toepassing op myocardium dat tot 36 uur aan koude ischemie wordt blootgesteld.

Isolatie van human ventriculaire cardiomyocyten van Vibratome-Cut Myocardial Slices

Een methode wordt beschreven voor de gelijktijdige isolatie van myocyten en niet-myocyten van zowel de atria als ventrikels van een enkel volwassen muizenhart. Dit protocol resulteert in consistente opbrengsten van zeer levensvatbare cardiale myocyten en niet-myocyten en beschrijft optimale celspecifieke kweekomstandigheden voor fenotyping en in vitro analyse.

Gelijktijdige isolatie en cultuur van atriale myocyten, ventriculaire myocyten en niet-myocyten uit een volwassen muizenhart

De verschillende effecten van verschillende graden van onderkoeling op myocardbescherming zijn niet grondig geëvalueerd. Het doel van deze studie was om de niveaus van celdood na verschillende hypothermiebehandelingen te kwantificeren in een op humane cardiomyocyten gebaseerd model, dat de basis legde voor toekomstig diepgaand moleculair onderzoek.

In vitro beoordeling van myocardbescherming na hypothermie-conditionering in een humaan cardiale myocytenmodel

Hier beschrijven we een protocol om een voldoende hoeveelheid enkele niet-cardiomyocyten met hoge levensvatbaarheid te isoleren uit een post-myocardinfarct (MI) muizenhart. Dit kan worden gebruikt voor daaropvolgende single-cell sequencing, flowcytometrie-analyse en primaire celcultuur.

Voorbereiding van een niet-cardiomyocytencelsuspensie voor single-cell RNA-sequencing van een post-myocardinfarct volwassen muizenhart

Driedimensionale hartweefsels die bio-engineered zijn met behulp van van stamcellen afgeleide cardiomyocyten zijn naar voren gekomen als veelbelovende modellen voor het bestuderen van gezond en ziek menselijk myocardium in vitro , terwijl ze de belangrijkste aspecten van de inheemse cardiale niche recapituleren. Dit manuscript beschrijft een protocol voor het vervaardigen en analyseren van gemanipuleerde hartweefsels met een hoog gehalte die zijn gegenereerd uit door de mens geïnduceerde...

Ontwerp van een bioreactor om de data-acquisitie en modeldoorvoer van gemanipuleerde hartweefsels te verbeteren

Leer ex vivo teelt van menselijk ventriculaire myocardweefsel in een biomimetische kamer met pre- en afterload. Deze methode maakt continue registratie van contractiekracht mogelijk voor cardiovasculair onderzoek.

Voorbereiding van menselijk myocardiale weefsel voor langdurige teelt

Meer video's verkennen