Construção de vetores adenovirais usando tecnologia de montagem de DNA

Resumo

Neste estudo, um clone infeccioso de adenovírus humano tipo 7 (HAdV-7) foi construído, e um sistema vetorial HAdV-7 deletado por E3 foi estabelecido modificando o clone infeccioso. Essa estratégia usada aqui pode ser generalizada para fazer vetores de transferência de genes de outros adenovírus do tipo selvagem.

Resumo

Os vetores adenovirais têm sido usados como ferramenta de transferência de genes na terapia gênica há mais de três décadas. Aqui, apresentamos um protocolo para construir um vetor adenoviral manipulando o DNA genômico do HAdV-7 do tipo selvagem usando um método de montagem de DNA. Primeiro, um clone infeccioso de HAdV-7, pKan-Ad7, foi gerado pela fusão do DNA genômico viral com um produto de PCR da estrutura do plasmídeo, compreendendo o gene resistente à canamicina e a origem da replicação (Kan-Ori), por meio da montagem do DNA. Isso foi feito projetando um par de primers de PCR, que continham ~ 25 nucleotídeos da sequência terminal de HAdV-7 invertida terminal (ITR) na extremidade 5 ', um local de enzima de restrição sem cortador para o genoma HAdV-7 no meio e uma sequência específica do modelo para PCR priming na extremidade 3 '. Em segundo lugar, uma estratégia intermediária baseada em plasmídeo foi empregada para substituir a região E3 por elementos que expressam transgenes no clone infeccioso para gerar um vetor adenoviral. Resumidamente, pKan-Ad7 foi digerido com enzima de restrição de corte duplo Hpa I, e o fragmento contendo a região E3 foi ligado a outro produto de PCR do esqueleto do plasmídeo por montagem de Gibson para construir um plasmídeo intermediário pKan-Ad7HpaI. Por conveniência, a montagem de restrição foi usada para designar o método de clonagem de plasmídeo de digestão e montagem de restrição combinada. Usando montagem de restrição, os genes E3 em pKan-Ad7HpaI foram substituídos por um de expressão de proteína fluorescente verde (GFP), e a região E3 modificada foi liberada do plasmídeo intermediário e restaurada ao clone infeccioso para gerar um plasmídeo adenoviral pKAd7-E3GFP. Finalmente, pKAd7-E3GFP foi linearizado por digestão de Pme I e usado para transfectar células de empacotamento HEK293 para resgatar o vírus HAdV-7 recombinante. Para concluir, uma estratégia baseada em montagem de DNA foi introduzida aqui para a construção de vetores adenovirais em laboratórios gerais de biologia molecular sem a necessidade de materiais e instrumentos especializados.

Introdução

Nas últimas três décadas, os vetores adenovirais recombinantes têm sido amplamente utilizados no desenvolvimento de vacinas e terapia gênica 1,2,3,4 bem como na pesquisa básica devido às suas excelentes propriedades biológicas, como alta eficiência de transdução gênica, não integração ao genoma do hospedeiro, genoma viral manipulativo e facilidade de produção em larga escala.

Atualmente, os vetores adenovirais mais comumente utilizados são construídos com base no adenovírus humano....

Protocolo

NOTA: Os adenovírus são classificados como Nível de Biossegurança 2 (BSL-2); Todas as etapas para o uso dos vírus foram realizadas em um laboratório de nível de biossegurança 2. O HAdV-7 do tipo selvagem foi isolado em 2017 a partir da amostra de aspirado nasofaríngeo de um bebê de 10 meses que foi hospitalizado com infecção aguda do trato respiratório no Hospital Infantil de Pequim²⁰. Os estoques de vírus foram armazenados a -80 °C.

1. Extração do DNA genômico HAdV-7

1. Semear 2,0 x 10⁶ das células HEK293 em um frasco T-25 contendo 5 mL de meio d....

Resultados

A estratégia para a construção de um clone infeccioso do HAdV-7 é mostrada na Figura 1 e na Figura 2. Dois plasmídeos de clones infecciosos foram selecionados aleatoriamente e identificados por BstZ17 I, BamH I e EcoR V, respectivamente. Os resultados mostraram que os fragmentos eram consistentes com o tamanho esperado (Figura 2A), indicando que os plasmídeos foram construídos corretamente. Focos de cometas puderam ser vistos nas cé.......

Discussão

Diferentes adenovírus têm vários tropismos teciduais, e a prevalência de imunidade pré-existente do hospedeiro contra diferentes adenovírus pode flutuar intensamente em seres humanos²⁴, o que atrai o interesse na construção de novos vetores adenovirais para terapia gênica ou desenvolvimento de vacinas. No entanto, o estabelecimento de um novo sistema de vetores adenovirais permanece complicado para laboratórios genéricos de biologia molecular.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 mL	Axygen	MCT-150-C	Armazenamento de vírus
Tubos de centrífuga de polipropileno de 15 mL Corning		430790	Armazenamento de vírus
150 mm Placas de cultura tratadas com TC	Corning	430599	Crescimento de células HEK29E
20 K MWCO de diálise	ThermoFisher Scientific	66005	Diálise de vírus
Ácido acético	Amresco	714	Extração de DNA
Afl II	NEB	R0520	Digestão
Agarose	Takara	5260	Eletroforese
Idade I	NEB	R0552	Digestão
Asc I	NEB	R0558	Digestão
BamH I	NEB	R0136	Digestão
Benzonase Nuclease	Sigma	E8263-25KU	Purificação do vírus
BsrG I	NEB	R0575	Digestão
Elevador de células	Corning	3008	Raspe as células
CsCl	Sigma	C3032	Purificação do kit de recuperação de gel de DNA do vírus
	Zymo	D4045	Recuperação de DNA
Dulbecco ' s Águia modificada' s medium (DMEM)	Cytiva	SH30022.01	HEK293 células médias
E.coli TOP10 células competentes	TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD.	CB-104	Transformação do produto de montagem
EcoR V	NEB	R3195	Digestão
EDTA	Thermo Fisher Scientific	R3104	Extração de DNA
Soro fetal bovino (FBS)	Cytiva	SV30208.02	Cultura de células HEK293
DNA genômico Kit de limpeza e concentrador	Zymo	D4065	Purificação de DNA
Glicerol	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd	G810575	Diálise de
células HEK293	ATCC	CRL-1573	Amplificação do vírus
DNA polimerase de alta fidelidade	NEB	M0491	PCR
Hind III	NEB	R3104	Digestão
Sulfato de canamicina	Amresco	408	Seleção do plasmídeo
Kpn I	NEB	R3142	Digestão
Lambda / HindIII Marcador de DNA	Takara	3403	Eletroforese
LB caldo	BD	240230	LB placa para bactérias
LB meio	Solarbio Life Science	L1010	Meio para bactérias
MgCl2	Sigma	63068	Diálise de
vírus Microcentrífuga	Thermo Fisher Scientific	Sorvall Legend Micro 21R	Extração de DNA
NaCl	Sigma	S5886	Diálise do vírus
Nde I	NEB	R0111	Digestão
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621	Montagem de DNA
Nhe I	NEB	R0131	Digestão
Fosfato Tampolado Salino	Cytiva	SH30256.01	Lavagem de células
Pipeta	Thermo Fisher Scientific	Matrix	Aspirar o meio
Plasmídeo Maxprep Kit	Vigorous Biotechnology Beijing Co., Ltd.	N001	Extração de
Kit Miniprep de Plasmídeo de	TIANGEN BIOTECH (PEQUIM) CO., LTD.	DP103	Extração de DNA
Pme I	NEB	R0560	Digestão
Acetato de potássio	Amresco	698	Extração de
DNA Protease K	Thermo Fisher Scientific	AM2542	Extração de DNA
pShuttle-CMV	Stratagene	240007	Modelo de PCR
RNase	Beyotime	D7089	Extração de DNA
Sal I	NEB	R0138	Digestão
Sbf I	NEB	R3642	Digestão
SDS	Amresco	227	Extração de DNA
Rotor de balde oscilante	HITACHI	S52ST	Purificação do frasco de
células T-25	do vírus Corning	430639	Crescimento de células HEK29E
Frasco de células T-75	Corning	430641	Crescimento de células HEK29E
Reagente de transfecção	Polyplus-transfecção	114-15	Transfecção
Microscópio eletrônico de transmissão	FEI	TECNAI 12	Obsevação de vírus
Tris-HCl	Amresco	234	Diálise de vírus
Ultracentrífuga	HITACHI	Himac CS120GXII	Purificação de vírus

do vírus DNA