В этом протоколе у пациентов с пигментным ретинитом были созданы 3D-органоиды сетчатки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток (iPSC). Эти органоиды успешно повторили некоторые клинические фенотипы пигментного ретинита.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
* These authors contributed equally
В этом протоколе у пациентов с пигментным ретинитом были созданы 3D-органоиды сетчатки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток (iPSC). Эти органоиды успешно повторили некоторые клинические фенотипы пигментного ретинита.
Пигментный ретинит (РП) является редким наследственным дегенеративным заболеванием сетчатки с распространенностью около 1/4000 человек во всем мире. У большинства пациентов с РП наблюдается прогрессирующая дегенерация фоторецепторов, приводящая к потере периферического зрения, ночной слепоте и, наконец, полной слепоте. На сегодняшний день сообщалось о тысячах мутаций в более чем 90 генах, связанных с РП. В настоящее время существует несколько животных моделей для всех пораженных генов и различных типов мутаций, что в значительной степени затрудняет расшифровку механизмов, лежащих в основе патологии генов/мутаций, и ограничивает лечение и разработку лекарств. Индуцированные пациентами 3D-органоиды сетчатки (РО), полученные из плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), обеспечили лучшую систему для моделирования раннего начала заболевания человека, чем клетки и животные. Для изучения РП эти полученные от пациента 3D-органоиды сетчатки были использованы для повторения клинических фенотипов РП. В РО РП, полученных от пациентов, отчетливо проявлялась неправильная локализация родопсина. По сравнению с другими животными моделями, модели органоидов сетчатки пациента, полученные из iPSC, более точно повторяют особенности RP и представляют собой идеальный подход к исследованию патогенеза заболевания и разработке лекарств.
Заболевания сетчатки человека, такие как пигментный ретинит и возрастная макулярная дегенерация, плохо изучены из-за отсутствия соответствующих экспериментальных моделей 1,2. Хотя сетчатка мыши очень похожа на сетчатку человека и является мощным инструментом для изучения этиологии дегенерации сетчатки, существуют огромные видовые различия между мышамии людьми. Например, ядерная архитектура фоторецепторных клеток у мышей и человека отличается, а сетчатка мышей не обладает макулой 5,6
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол соответствует рекомендациям комитета по этике исследований человека Столичного медицинского университета.
1. Культивирование клеток и генерация ИПСК
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
На схематической иллюстрации описаны процедуры дифференцировки для получения здоровых и больных органоидов сетчатки, полученных из ИПСК (Рисунок 1). От iPSC до RO вариации могут быть получены в зависимости от нескольких факторов. Статус iPSC является определяющим этапом генерации RO. Кроме того, настоятельно рекомендуется, чтобы исследователи записывали каждый шаг, каталог и номер партии всех носителей, чтобы можно было отследить весь эксперимент. На рисунке 2А .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Органоиды сетчатки представляют собой трехмерные слоистые структуры, полученные из ИПСК или эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), и представляют собой очень многообещающую модель для имитации пространственных и временных закономерностей развития сетчатки человека31,32. АФ состоят из различных типов клеток сетчатки, включая фоторецепторы, биполярные клетки, ганглиозные клетки, амакриновые клетки, горизонтальные клетки и глию Мюлле.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все авторы не раскрывают конфликт интересов.
Мы благодарим М.С. Янь-пина Ли и Чжо-линь Лю за их техническую поддержку и полезные комментарии относительно рукописи. Эта работа была частично поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82171470, 31871497, 81970838, Z20J00122), Пекинским муниципальным фондом естественных наук (Z200014, 82125007) и Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2017YFA0105300).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 96 конических скважин с V-образным забоем | Sumitomo Bakelite | MS-9096VZ | |
| A-83– 01 | Исследования и D Systems | 2939/10 | |
| Адгезионный микроскоп слайды | CITOtest | 188105 | |
| Agarose | Gene Tech | 111760 | |
| Amaxa Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | Трансфекционная система |
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | R& D Systems | 3718-FB | |
| Blebbistatin | Nuwacell Biotechnologies | RP01008 | |
| Пробирка для забора крови | BD Vacutainer EDTA | 366643 | |
| CHIR99021 | TOCRIS | 4423/10 | |
| Предметные стекла обложки | CITOGLAS | 10212440C | |
| cTarget hPSC Medium | Nuwacell Biotechnologies | RP01020 | |
| DAPI | Invitrogen | D-1306 | |
| DMEM/Ham' s F12 | Gibco | 10565-042 | |
| Ослик против мышей 488 | Инвитроген | A-21202 | |
| Осел против кролика 594 | Инвитроген | A-21207 | |
| ЭДТА | Nuwacell Биотехнологии | RP01007 | |
| Средоточие | FluorSaveTM Реагент | 345789 | |
| EX-CYTE Среда для усиления роста | Sigma | 811292 | Среда для стимуляции роста |
| Фетальная бычья сыворотка | Gibco | 04-002-1A | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | 26873-85-8 | Градиентная среда |
| плотности FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | L-глутаминовая добавка |
| HA-100 | STEMCELL Technologies | 72482 | |
| Ветчина s F12 | Gibco | 11765-054 | |
| hLIF | Thermo Fisher Scientific | AF-250-NA | |
| Гомогенизатор | EDEN lab | D-130 | |
| IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Iscove' s Модифицированный Dulbecco Medium | Gibco | 12440053 | |
| KnockOut Замена сыворотки - многовидовая | среда для замены сыворотки | Gibco | A3181502 |
| /M-опсин | Millipore | ab5405 | |
| Монотиоглицерин | Sigma | M6145 | |
| N-2 добавка | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nanodrop Спектрофотометр | Thermo Fisher Scientific | ND2000 | Спектрофотометр |
| ncEpic 125x Дополнение | Nuwacell Biotechnologies | RP01001-02 | 125x Дополнение |
| ncEpic Basal Medium | Nuwacell | Biotechnologies RP01001-01 | Базальная среда hpsc |
| ncLaminin511 человеческий рекомбинантный белок | Nuwacell Biotechnologies | ||
| PD0325901 | STEMCELL Technologies | 72182 | |
| Пенициллин-стрептомицин | Gibco | 15140-122 | |
| Рекомбинантный человеческий BMP4 | R& D Systems | 314-BP | |
| Ретиноевая кислота | Sigma | R2625 | |
| Родопсин | Sigma | O4886 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| sIL6-R | Thermo Fisher Scientific | RP-75602 | |
| StemSpan SFEM medium | STEMCELL Technologies | 09600 | |
| Taurine Sigma | T8691 | ||
| Реагент | Тризол Инвитроген | 15596026 | |
| Витронектин | Nuwacell Biotechnologies | RP01002 | |
| нож V-Lance Alcon | Surgical 8065912001 |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Эта статья была опубликована
Видео скоро будет доступно