Name: Uso de microscopia Time-Lapse e Depleção Nuclear Específica de Estágio de Proteínas para Estudo da Meiose em S. cerevisiae (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Aprenda a usar microscopia time-lapse e depleção nuclear específica de estágio de proteínas para estudar a meiose em Saccharomyces cerevisiae. Este método revela funções distintas de proteínas essenciais para a segregação cromossômica.

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Agradecemos ao Centro de Imagem de Microscopia de Luz da Universidade de Indiana. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa dos Institutos Nacionais de Saúde (GM105755).

1. Preparação dos materiais necessários
<ol><li>Preparar reagentes para o crescimento e esporulação de células de levedura. NOTA: Se as cepas de levedura em brotamento forem ade2 - e trp1-, complemente todos os meios nas etapas 1.1.1-1.1.3 com uma concentração final de 0,01% de adenina e 0,01% de triptofano de 1% de estoques. Se o meio esterilizante por autoclave, adicione estes aminoácidos somente depois que os reagentes tiverem sido autoclavados e deixados esfriar até a temperatura ambiente.<ol><li>Para o crescimento vegetativo, prepare 2x meio sintético completo + dextrose (2XSC) dissolvendo 6,7 g de levedura nitrogenada base sem aminoácidos, 2 g de mistura completa de aminoácidos e 20 g de dextrose em 500 mL de água. Esterilizar a mistura por autoclave durante 20 minutos a 121 °C ou filtrando através de um filtro de 0,2 μm.</li>
		<li>Para a primeira etapa da esporulação, prepare 2x meio sintético completo + acetato (2XSCA) dissolvendo 6,7 g de levedura à base de nitrogênio sem aminoácidos, 2 g de mistura completa de aminoácidos e 20 g de acetato de potássio em 500 mL de água. Esterilizar a mistura por autoclave durante 20 minutos a 121 °C ou filtrando através de um filtro de 0,2 μm.</li>
		<li>Para a etapa final da esporulação, prepare acetato de potássio a 1% (1% de KAc) dissolvendo 5 g de KAc em 500 mL de água. Esterilizar a mistura por autoclave durante 20 minutos a 121 °C ou filtrando através de um filtro de 0,2 μm.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare medicamentos e reagentes para microscopia, sincronização e ancoragem.<ol><li>Para aderir células ao coverslip durante a imagem de lapso de tempo, faça 1 mg/mL de concanavilina A () em 1x PBS. Esterilizar o filtro utilizando um filtro de 0,2 μm e armazenar alíquotas pequenas (~10 μL) a -20 °C.</li>
		<li>Para usar o sistema NDT80-in, faça 2 mL de 1 mM β-estradiol dissolvido em etanol. Esterilizar o filtro utilizando um filtro de 0,2 μm e armazenar alíquotas (~500 μL) a -20 °C.</li>
		<li>Para o sistema de ancoragem afastada, produzir 1 mg/mL de rapamicina dissolvida em DMSO. Esterilizar o filtro utilizando um filtro de 0,2 μm e armazenar alíquotas pequenas (~10 μL) a -20 °C. NOTA: Prepare pequenas alíquotas de rapamicina para evitar múltiplos ciclos de congelamento-descongelamento da droga.</li>
	</ol></li>
	<li>Gerar cepas de levedura contendo o sistema NDT80-in (P GAL1,10-NDT80/PGAL1,10-NDT80; GAL4-ER/ GAL4-ER) e uma proteína-alvo marcada com FRB no fundo genético da âncora (tor1-1/tor1-1; fpr1Δ/ fpr1Δ; Rpl13A-FKBP12/Rpl13A-FKBP12)4,8. O Ctf19-FRB foi utilizado para este estudo. Além disso, uma cópia da proteína histona Htb2 foi marcada com mCherry para permitir o monitoramento da progressão meiótica e da segregação da cromatina.</li>
	<li>Preparar uma câmara para imagens de lapso de tempo<ol><li>Iniciar o preparo da câmara 6 h-24 h antes da imagem (Figura 2). Corte uma câmara de 18 mm x 18 mm da inserção da caixa de ponta da pipeta usando um bisturi aquecido ou outra lâmina afiada.</li>
		<li>Use uma ponta de pipeta de plástico para espalhar uma fina camada de selante de silicone ao redor das bordas inferiores da câmara que aderirá à tampa. Adicionar selante suficiente para que as arestas da câmara fiquem completamente cobertas (ver figura 2).</li>
		<li>Aderir a câmara a uma folha de cobertura de 24 mm x 50 mm, colocando suavemente a câmara, de lado para baixo, na folha de cobertura. Certifique-se de que não há lacunas no selante para que a câmara não vaze.</li>
		<li>Espalhe 8-10 μL de na folha de cobertura. Dispense o no meio da tampa e use uma ponta de pipeta para espalhar o em uma camada fina de tal forma que cubra a maior parte do deslizamento da tampa que é cercado pela câmara. NOTA: As câmaras de plástico podem ser reutilizadas indefinidamente. Após a conclusão da imagem de lapso de tempo, remova a câmara da lâmina de cobertura usando uma navalha, limpe o selante de silicone da câmara e mantenha as câmaras submersas em etanol a 95% para uso futuro.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Esporulação de células de levedura
<ol><li>Execute os seguintes passos para a fome de células de levedura para induzir o programa meiótico. NOTA: Estes passos destinam-se à esporulação da estirpe de levedura W303. Outras cepas podem exigir protocolos diferentes15. A eficiência de esporulação é altamente variável entre as cepas de laboratório, com W303 exibindo uma eficiência de esporulação de ~60%16,17,18.<ol><li>Pegue uma única colônia da cepa de levedura diploide apropriada de uma placa e inocular 2 mL de 2XSC e deixe crescer a 30 °C em um tambor de rolo por 12-24 h até a saturação.</li>
		<li>Diluir a cultura saturada em 2XSCA adicionando 80 μL da cultura da etapa 2.1.1 a 2 mL de 2XSCA. Deixe crescer a 30 °C em um tambor de rolo por 12-16 h. Não deixe em 2XSCA por mais de 16 h porque as células podem ficar doentes ou auto-fluorescentes.</li>
		<li>Realizar duas lavagens girando a cultura a 800 x g à temperatura ambiente (25 °C) por 1 min, descartando o líquido e ressuspendendo o pellet em 2 mL de água destilada estéril.</li>
		<li>Após a segunda lavagem, retire o líquido e ressuscite o pellet em 2 mL de KAc a 1% e deixe-o crescer a 25 °C em um tambor de rolo por 8-12 h. As células que entraram na meiose irão parar no paquiteno da prófase I.</li>
	</ol></li>
	<li>Sistema de liberação Prophase I<ol><li>Adicionar β-estradiol diretamente à cultura de esporulação a uma concentração final de 1 μM e vórtice o tubo de cultura rapidamente. O β-estradiol liberará células da prófase I.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Depleção da proteína-alvo do núcleo usando a técnica de ancoragem afastada
<ol><li>Adicione rapamicina às células para esgotar a proteína marcada com FRB do núcleo em um estágio específico.<ol><li>Para esgotar as proteínas do núcleo na saída da prófase I, adicione rapamicina a uma concentração final de 1 μg/mL ao tubo de cultura de esporulação ao mesmo tempo que a adição de β-estradiol.</li>
		<li>Para esgotar as proteínas do núcleo em um estágio específico da meiose, monitore o estágio do ciclo celular a partir de 60 minutos após a adição de β-estradiol. A cada 20 minutos, pipete 5 μL de cultura para uma tampa de 24 mm x 40 mm e cubra as células com uma tampa de 18 mm x 18 mm. Mantenha as culturas girando no tambor do rolo a 25 °C entre os pontos de tempo.</li>
		<li>Fotografe as células usando o filtro A594/mCherry e a objetiva de 60x de um microscópio de fluorescência. Defina a porcentagem de transmitância para 2% e o tempo de exposição para 250 ms. A presença de uma, duas ou quatro massas de DNA indicará o estágio meiótico em que as células progrediram. Adicionar rapamicina a uma concentração final de 1 μg/ml na fase meiótica de interesse.</li>
	</ol></li>
	<li>Mantenha as células girando no tambor do rolo a 25 °C até que estejam prontas para a geração de imagens. A depleção nuclear de uma proteína-alvo ocorre 30-45 min após a adição de rapamicina 2,8.</li>
</ol>4. Microscopia de fluorescência de lapso de tempo
<ol><li>Faça uma almofada de ágar que será usada para criar uma monocamada de células para geração de imagens (consulte a etapa 4.2).<ol><li>Corte e descarte a tampa e o fundo 1/3 de um tubo de microfuga de 1,5 mL para criar um cilindro. O cilindro servirá como um molde para a almofada de ágar. Faça dois cilindros para ter um extra caso o ágar não polimerize adequadamente no primeiro.</li>
		<li>Coloque o cilindro do tubo de microfuga cortado em uma lâmina de vidro limpa com a parte superior do tubo de cabeça para baixo sentada no slide.</li>
		<li>Faça 6 mL de uma solução de ágar a 5% (use 1% de KAc como solvente) em um copo de 50 mL e coloque-o no micro-ondas até que o ágar esteja totalmente dissolvido. NOTA: O ágar ferverá facilmente no micro-ondas; observe o ágar e inicie e pare o micro-ondas quando o ágar começar a ferver e girar o béquer. Inicie e pare o micro-ondas várias vezes para dissolver completamente o ágar. A solução de ágar é feita em excesso da quantidade necessária para garantir que o ágar se dissolva completamente.</li>
		<li>Corte a ponta do pipete para fazer uma abertura maior e pipete ~500 μL de ágar derretido em cada cilindro de tubo de microfuga. Deixe descansar à temperatura ambiente até que o ágar se solidifique (~10-12 min).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de células de levedura para imagens<ol><li>Gire 200 μL da cultura de esporulação a partir do passo 3.2 a 800 x g por 2 min em tubos de microcentrífuga de 1 mL. Remover e eliminar 180 μL do sobrenadante. Ressuspeite a pastilha no sobrenadante restante girando e agitando o tubo.</li>
		<li>Pipetar 6 μL das células concentradas para a tampa no meio da câmara feita na etapa 1.4.</li>
		<li>Segure o cilindro com a almofada de ágar feita na etapa 4.1 e deslize-a cuidadosamente para fora da lâmina de vidro. Certifique-se de que o ágar esteja completamente plano na parte inferior e, usando a parte inferior de uma ponta de pipeta, aplique uma pequena quantidade de pressão no molde de microfuga, de modo que a almofada de ágar seja empurrada ligeiramente acima do limite do tubo.</li>
		<li>Inverta o molde de modo que a almofada de ágar esteja voltada para baixo em direção à câmara.</li>
		<li>Usando fórceps, coloque suavemente a almofada de ágar (ainda no molde do tubo de microfuga) em cima das células. Use uma ponta de pipeta para deslizar suavemente a almofada de ágar ao redor da câmara 10-20 vezes para criar uma monocamada de células na tampa.</li>
		<li>Deixe a almofada de ágar na câmara por 12-15 min. Esta etapa permitirá que as células adiram ao na folha de cobertura.</li>
		<li>Transferir 2 mL de cultura de esporulação da etapa 3.2 para dois tubos de microcentrífuga e girar a 15.700 x g por 2 min. Transfira o sobrenadante para tubos de microfuga limpos e gire novamente a 15.700 x g por 2 min. Transfira o sobrenadante para tubos de microcentrífuga limpos a serem usados na próxima etapa. NOTA: É importante usar o sobrenadante KAc pré-condicionado com o β-estradiol e rapamicina para garantir uma esporulação eficiente e depleção contínua da proteína de interesse.</li>
		<li>Depois que a almofada de ágar tiver ficado na câmara por 12-15 minutos, flutue e remova a almofada de ágar antes da imagem. Para o fazer, adicionar 2 ml do sobrenadante da etapa 4.2.7 dropwise à câmara. Uma vez que o líquido tenha atingido o topo da câmara, a almofada de ágar provavelmente flutuará. NOTA: Se a almofada de ágar não flutuar automaticamente, aguarde 1-2 min. Se a almofada de ágar ainda não flutuar, remova-a suavemente com fórceps. Idealmente, a almofada de ágar flutuaria por conta própria, porque removê-la antes de flutuar poderia levar à remoção das células.</li>
		<li>Depois que a almofada de ágar flutuar, remova-a suavemente com pinça e descarte-a. Coloque uma tampa de 24 mm x 50 mm na parte superior da câmara para evitar a evaporação durante a imagem.</li>
	</ol></li>
	<li>Configurando um filme no microscópio NOTA: As instruções abaixo são para um microscópio invertido equipado com um suporte de lâmina que acomoda a tampa de 24 mm x 50 mm (consulte a Tabela de Materiais para detalhes do microscópio, da câmera e do software). Uma objetiva de imersão em óleo de 60x é usada para aquisição de imagens. Este protocolo pode precisar ser alterado ao usar outros microscópios ou outros suportes de lâminas. As etapas exatas para executar as etapas 4.3.2 a 4.3.16 variam dependendo do microscópio e do software de imagem usado. Ver secção 4.4 para instruções para um microscópio diferente.<ol><li>Encaixe a tampa dentro do suporte deslizante. Cole a argila de moldagem ao lado da tampa para mantê-la segura no suporte da corrediça.</li>
		<li>Abra o software de aquisição de imagens. Use os botões de ajuste fino e de curso para focar as células usando DIC ou campo brilhante.</li>
		<li>No menu principal do software de aquisição de imagens, clique em Arquivo > Adquirir (Resolve 3D). Três janelas irão aparecer.</li>
		<li>Na janela chamada Resolve 3D, clique no ícone do Erlenmeyer Flask . Isso abrirá uma janela intitulada Design/Run Experiment, que contém os controles para configurar um experimento para configurar um filme de lapso de tempo.</li>
		<li>Na guia Design , navegue até a guia Seccionamento. Marque a caixa ao lado de Seção Z. Defina as pilhas z da seguinte forma: Espaçamento óptico entre seções = 1 μm, Número de seções ópticas = 5, Espessura da amostra = 5,0 μm.</li>
		<li>Na guia Canais , clique no ícone + para que uma opção de canal apareça. Selecione o canal apropriado. Para este experimento, selecionamos A594, que é usado para criar imagens mCherry. Marque a caixa ao lado de Imagem de referência e defina a posição Z para o meio da amostra no menu suspenso.</li>
		<li>Selecione um valor no menu suspenso adjacente a %T e Exp. para definir a porcentagem de transmitância e o tempo de exposição, respectivamente. Para este experimento, 2% de transmitância e 250 ms de tempo de exposição são usados no canal A594, e 10% de transmitância e 500 ms de tempo de exposição são usados para campo brilhante. NOTA: O tempo de exposição e a porcentagem de transmitância variam com diferentes microscópios. Para evitar a superexposição, use a menor porcentagem de transmitância e o menor tempo de exposição possível, o que permita a visualização adequada da proteína de interesse.</li>
		<li>Na guia Time-lapse, marque a caixa ao lado de Time-lapse. Na tabela exibida, insira 10 na coluna min na linha de lapso de tempo e 10 na coluna de horas na linha de tempo total. Isso executará um curso de tempo tirando imagens a cada 10 minutos por 10 h.</li>
		<li>Marque a caixa ao lado de Manter o foco com foco final para evitar desvios de palco durante o filme. Na guia Pontos , marque a caixa ao lado de Visitar Lista de Pontos.</li>
		<li>No menu principal, clique em Exibir > Lista de Pontos. Uma janela chamada lista de pontos será exibida. Mova o palco para uma área da câmara que mostre uma monocamada de células. Clique em Marcar ponto na janela da lista de pontos.</li>
		<li>Mova o palco para selecionar de 25 a 30 pontos sem qualquer sobreposição para evitar a superexposição das células. Cada campo será fotografado durante cada curso de tempo.</li>
		<li>Na janela da lista de pontos, selecione Calibrar tudo para definir o foco final para cada ponto. Na guia Design na janela Desgin/Run Experiment , insira o intervalo de valores de ponto (obtidos na janela da lista de pontos) na caixa ao lado de Visitar Lista de Pontos. Na guia Executar , salve o arquivo no destino apropriado no computador. Na janela Design/Executar experimento , selecione o botão Reproduzir (ícone de triângulo verde) para iniciar o filme.</li>
	</ol></li>
	<li>Método opcional: Configurando um filme em um microscópio NOTA: Estas instruções destinam-se a um microscópio invertido equipado com um suporte de lâmina que pode acomodar uma tampa de 24 mm x 50 mm. Consulte Tabela de materiais para obter especificações sobre o microscópio, a câmera e o software de imagem usados. Uma objetiva de imersão em óleo de 60x é usada para aquisição de imagens.<ol><li>Encaixe a tampa dentro do suporte deslizante. Abra o software de aquisição de imagens. Use botões de ajuste fino e de curso para focar células usando DIC ou campo brilhante. Clique com o botão direito do mouse na janela aberta do software. Um menu suspenso será exibido.</li>
		<li>Clique em Controles de Aquisição > Aquisição. Clique em Aplicativo > Definir/Executar Experimento. Isso abrirá uma janela chamada ND Acquisition.</li>
		<li>Na janela que se abre, marque a caixa ao lado de XY. Mova o palco para o local desejado e clique na caixa em Nome do ponto para selecionar esse local como um ponto. Repita isso até que 25-30 pontos sejam selecionados sem qualquer sobreposição para evitar a superexposição das células. Cada campo será fotografado durante cada curso de tempo.</li>
		<li>Defina a porcentagem de transmitância para cada canal fluorescente. Como as cepas produzem Htb2-mCherry, o filtro mCherry é usado aqui. Na janela Aquisição aberta na etapa 4.3.3, navegue até o botão de 555 nm. Defina a porcentagem de transmitância para 5% ajustando a escala deslizante sob o botão de 555 nm até que ela leia 5%.</li>
		<li>Defina o tempo de exposição para cada canal fluorescente. Na janela Aquisição , selecione 200 ms no menu suspenso Exposição. NOTA: O tempo de exposição e a porcentagem de transmitância variam com diferentes microscópios. Para evitar a superexposição, use a menor porcentagem de transmitância e o menor tempo de exposição possível, o que permita a visualização adequada da proteína de interesse.</li>
		<li>Clique na caixa ao lado de Z na janela ND Acquisition . Defina cinco z-stacks das células de levedura que estão separadas por 1,2 μM.</li>
		<li>Clique na caixa ao lado de λ. Selecione os canais apropriados a serem usados para o experimento. Para DIC, certifique-se de que Home está selecionado no menu suspenso em Z pos. Para mCherry, certifique-se de que Tudo está selecionado no menu suspenso em Z pos. Isso garante que, apenas uma única seção (no meio da pilha z) seja tomada para DIC.</li>
		<li>Marque a caixa ao lado de Hora na janela Aquisição de ND . Marque a caixa em Fase. No menu suspenso em Intervalo, selecione 10 min. Em Duração, selecione 10 hora(s). Isso irá executar o curso de tempo de tal forma que as imagens são tiradas a cada 10 minutos por 10 h.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Análise da segregação da cromatina
<ol><li>Abra o software Fiji. Abra um campo de visão de cada vez: para cada campo, abra os canais DIC e mCherry.</li>
	<li>Pegue a projeção de intensidade máxima do canal mCherry para obter uma única imagem: clique em Imagem > Pilhas > Projeto Z, selecione Intensidade Máxima no menu suspenso.</li>
	<li>Mescle os canais DIC e mCherry em uma imagem: clique em Imagem > Cor > Mesclar canais.</li>
	<li>Siga uma única célula através da meiose. Após a conclusão da meiose II, registre o número de massas de DNA.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Este protocolo combina o sistema NDT80-in para sincronizar células, a técnica de ancoragem para esgotar proteínas do núcleo e a microscopia de lapso de tempo de fluorescência para visualizar células de levedura em brotamento durante a meiose. O sistema NDT80-in é um método de sincronização do ciclo celular meiótico que utiliza uma prófase I de parada e liberação 4,8. Embora as células individuais variem ligeiramente na quantidade de tempo gasto ...

A microscopia de fluorescência time-lapse é uma ferramenta valiosa para o estudo da dinâmica da segregação cromossômica meiótica em leveduras em brotamento 1,2. As células de levedura em brotamento podem ser induzidas a sofrer meiose através da fome de nutrientes essenciais3. Durante a meiose, as células passam por uma rodada de segregação cromossômica seguida de duas divisões para criar quatro produtos meióticos que são embalados em esporos (Figura 1). Células individuais podem ser visualizadas ao longo de cada estágio da meiose, o que gera dados espaciais e temporais que podem ser facilmente perdidos por imagens de células fixas. Este protocolo mostra como a combinação da microscopia de fluorescência de lapso de tempo com dois métodos previamente estabelecidos, o sistema induzível NDT80 (NDT80-in) e a técnica de anchor away, pode ser usada para estudar a função de proteínas específicas em estágios meióticos distintos.
O sistema NDT80-in é uma poderosa ferramenta para sincronização do ciclo celular meiótico que se baseia na expressão induzível do fator de transcrição da meiose média NDT80 4,5. A expressão NDT80 é necessária para a saída 6,7 da prófase I. Com o sistema NDT80-in, o NDT80 está sob o controle do promotor GAL1-10 em células que expressam o fator de transcrição Gal4 fundido a um receptor de estrogênio (Gal4-ER)4,5. Como a Gal4-ER só entra no núcleo quando ligada ao β-estradiol, as células NDT80-in param na prófase I na ausência de β-estradiol, o que permite a sincronização das células na prófase I (Figura 1). β adição de estradiol promove a translocação do fator de transcrição Gal4-ER para o núcleo, onde se liga à GAL1-10 para impulsionar a expressão de NDT80, levando à entrada síncrona nas divisões meióticas. Embora a microscopia de lapso de tempo possa ser realizada sem sincronização, a vantagem de usar a sincronização é a capacidade de adicionar um inibidor ou uma droga enquanto as células estão em um estágio específico da meiose.
A técnica de anchor away é um sistema induzível pelo qual uma proteína pode ser esgotada do núcleo com a adição de rapamicina8. Esta técnica é ideal para estudar proteínas nucleares durante a divisão celular em leveduras em brotamento, porque as células de levedura sofrem mitose e meiose fechadas, nas quais o envelope nuclear não se decompõe. Além disso, esta técnica é muito útil para proteínas que têm múltiplas funções ao longo da meiose. Ao contrário de deleções, alelos mutantes ou alelos nulos meióticos, a remoção de uma proteína-alvo do núcleo em um estágio específico não compromete a atividade da proteína-alvo em estágios anteriores, permitindo uma interpretação mais precisa dos resultados. O sistema de ancoragem afastada utiliza o deslocamento de subunidades ribossomais entre o núcleo e o citoplasma que ocorre na maturação ribossômica8. Para esgotar a proteína-alvo do núcleo, a proteína-alvo é marcada com o domínio de ligação à rapamicina FKBP12 (FRB) em uma cepa na qual a subunidade ribossomal Rpl13A é marcada com FKBP12. Sem rapamicina, FRB e FKBP12 não interagem, e a proteína marcada com FRB permanece no núcleo. Após a adição de rapamicina, a rapamicina forma um complexo estável com FKBP12 e FRB, e o complexo é transportado para fora do núcleo devido à interação com Rpl13A (Figura 1). Para evitar a morte celular após a adição de rapamicina, as células abrigam a mutação tor1-1 do gene TOR1 . Além disso, essas células contêm fpr1Δ , um alelo nulo da proteína S. cerevisiae FKBP12, que impede que a Fpr1 endógena supere a Rpl13A-FKBP12 para FRB e ligação à rapamicina. As mutações de fundo ancoradas afastadas, tor1-1 e fpr1Δ, não afetam os tempos meióticos ou a segregação cromossômica2.
Para demonstrar a utilidade desta técnica, a proteína cinetócora Ctf19 foi esgotada em diferentes momentos ao longo da meiose. Ctf19 é um componente do cinetócoro que é dispensável na mitose, mas necessário para a segregação cromossômica adequada na meiose 9,10,11,12,13. Na meiose, o cinetócoro é eliminado na prófase I, e o Ctf19 é importante para a remontagem do cinetócoro 9,14. Para este protocolo, as células com o sistema NDT80-in foram sincronizadas, e a técnica de anchor away foi utilizada para esgotar a proteína-alvo Ctf19 do núcleo antes e após a liberação da prófase I e após a segregação cromossômica da meiose I (Figura 1). Este protocolo pode ser adaptado para esgotar outras proteínas de interesse em qualquer estágio da meiose e mitose.

<table><tbody><tr><td>&beta;-estradiol</td><td>Millipore Sigma</td><td>E8875</td><td>Faça estoques de 1mM em 95% EtOH</td></tr><tr><td>0,22 uM Filtro de tampa de garrafa rosqueada</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPT02RE</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-601</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td>Diluir 1:10 para usar como solvente para</td></tr><tr><td>24 mm x 50 mm lamínula No. 1.5</td><td>VWR Lâminas de microscópio North American</td><td>48393241</td><td></td></tr><tr><td>25 mm x 75 mm</td><td>VWR North American</td><td>48300-026</td><td></td></tr><tr><td>Sal de hemissulfato de adenina</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9126</td><td>Para complementar SC, SCA, e 1% Kac</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Concanavialin A</td><td>Mllipore Sigma</td><td>C2010</td><td>Faça como 1mg/mL em 1X câmera CCD PBS</td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ2</td><td>Fotometria</td><td></td><td>usada na seção 4.3</td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>Difco Yeast Nitrogen Base sem aminoácidos</td><td>BD</td><td>291920</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti2 microscópio de objetiva invertida</td><td>Nikon</td><td></td><td>Usado na seção 4.4</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>NIH</td><td></td><td>Faça o download da https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td>GE Personal DeltaVision Microscope</td><td>Applied Precision</td><td></td><td>Used in Section 4.3</td></tr><tr><td>L-Triptofano&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>T0254</td><td>Para complementar SC, SCA, e 1% Kac</td></tr><tr><td>Massa de Modelar</td><td>Crayola</td><td>&nbsp; 2302880000</td><td>Para fixar a lamínula no suporte de lâminas</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 5.30.04 Software de Imagem</td><td>Nikon</td><td></td><td>Usado na Seção 4.4</td></tr><tr><td>ORCA-Fustion BT Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C15440-20UP</td><td>Usado na Seção 4.4</td></tr><tr><td>Suporte de ponta de pipeta de plástico</td><td>Dot Scientific</td><td>LTS1000-HR</td><td>Corte uma seção quadrada de 4 x 4 quadradas da parte do rack deste produto.&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetato de Pottassium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264</td><td></td></tr><tr><td>Rapamicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP29631</td><td>Faça estoques de 1mg / mL em DMSO</td></tr><tr><td>Selante de Silicone</td><td>Aqueon</td><td>100165001</td><td>Também conhecido como cola de aquário.</td></tr><tr><td>SoftWorx7.0.0&nbsp; Software de imagem</td><td>Precisão</td><td></td> aplicada <td>usada na Seção 4.3</td></tr><tr><td>Mistura Completa Sintética (Kaiser)&nbsp;</td><td>Para óleo de imersão médio</td><td>DSCK2500</td><td></td></tr><tr><td>tipo N&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MXA22166</td><td></td></tr></tbody></table>

uso de microscopia time-lapse e depleção nuclear específica de estágio de proteínas para estudo da meiose em s. cerevisiae

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

A microscopia de fluorescência de lapso de tempo revolucionou a compreensão dos eventos do ciclo celular meiótico, fornecendo dados temporais e espaciais que muitas vezes não são vistos por imagens de células fixas. A levedura em brotamento provou ser um importante organismo modelo para estudar a segregação cromossômica meiótica, porque muitos genes meióticos são altamente conservados. A microscopia de lapso de tempo da meiose em levedura em brotamento permite o monitoramento de diferentes mutantes meióticos para mostrar como a mutação interrompe os processos meióticos. No entanto, muitas proteínas funcionam em vários pontos da meiose. O uso de mutantes nulos meióticos ou meióticos pode, portanto, interromper um processo precoce, bloqueando ou perturbando o processo posterior e dificultando a determinação dos fenótipos associados a cada papel individual. Para contornar esse desafio, este protocolo descreve como as proteínas podem ser condicionalmente esgotadas do núcleo em estágios específicos da meiose enquanto monitoram eventos meióticos usando microscopia de lapso de tempo. Especificamente, este protocolo descreve como as células são sincronizadas na prófase I, como a técnica de ancoragem é usada para esgotar proteínas do núcleo em estágios meióticos específicos e como a imagem de lapso de tempo é usada para monitorar a segregação cromossômica meiótica. Como exemplo da utilidade da técnica, a proteína cinetócora Ctf19 foi esgotada do núcleo em diferentes momentos durante a meiose, e o número de massas de cromatina foi analisado no final da meiose II. No geral, este protocolo pode ser adaptado para esgotar diferentes proteínas nucleares do núcleo enquanto monitora as divisões meióticas.

Para monitorar a segregação da cromatina, a proteína histona Htb2 foi marcada com mCherry. Na prófase I, a cromatina aparece como uma única massa de Htb2. Após os cromossomos homólogos se segregarem na primeira divisão meiótica, a cromatina aparece como duas massas distintas (Figura 3A). Depois que as cromátides irmãs se segregam, a cromatina aparece como quatro massas. Se alguns cromossomos não se ligarem aos microtúbulos fusiformes, massas adicionais podem ser vistas após a meiose I ou mei...

A microscopia de lapso de tempo é uma ferramenta valiosa para estudar a meiose em leveduras em brotamento. Este protocolo descreve um método que combina sincronização do ciclo celular, microscopia de lapso de tempo e depleção condicional de uma proteína-alvo para demonstrar como estudar a função de uma proteína específica durante a segregação cromossômica meiótica.

Uso de microscopia Time-Lapse e Depleção Nuclear Específica de Estágio de Proteínas para Estudo da Meiose em S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

Ao sincronizar as células na prófase um e, em seguida, esgotar a proteína-alvo em um estágio específico, esse método pode identificar funções temporariamente distintas de proteínas específicas. Proteínas condicionalmente esgotantes em estágios específicos da miose impedem os efeitos residuais que um mutante miotótico tradicional pode ter em estágios posteriores. Este método poderia ser usado para estudar a mitose de levedura em brotamento e outros organismos que não sofrem quebra do envelope nuclear.Além disso, este método pode ser usado em outros organismos para estudar eventos do ciclo celular antes da quebra do envelope nuclear. Para começar, faça uma almofada de ágar que será usada para criar uma monocamada de células para imagens. Corte e descarte a tampa e o fundo de um terço de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para criar um cilindro que servirá como um molde para a almofada de ágar.Coloque o cilindro do tubo de microcentrífuga cortado em uma lâmina de vidro limpa com a parte superior do tubo de cabeça para baixo, sentada no slide. Faça seis mililitros de uma solução de ágar a 5% em um copo de 50 mililitros. Corte a ponta da pipeta para fazer uma abertura maior e pipete aproximadamente 500 microlitros de ágar derretido no tubo de microcentrífuga.Deixe descansar à temperatura ambiente até que o ágar se solidifique. Para preparar as células de levedura, gire 200 microlitros da cultura de esporulação a 800 G por dois minutos em tubos de microcentrífuga de um mililitro. Descarte 180 microlitros do sobrenadante.Ressuspeite a pastilha no sobrenadante restante girando e agitando o tubo. Pipetar seis microlitros das células concentradas para a tampa deslizar no meio da câmara no local com. Segure o cilindro com a almofada de ágar e deslize-o cuidadosamente para fora da lâmina de vidro.Certifique-se de que o ágar esteja completamente plano na parte inferior e, usando a parte inferior da ponta da pipeta, aplique uma pequena quantidade de pressão no molde da microcentrífuga, de modo que a almofada de ágar seja empurrada ligeiramente acima do limite do tubo. Em seguida, inverta o molde de tal forma que a almofada de ágar esteja voltada para baixo em direção à câmara. Use fórceps para colocar suavemente a almofada de ágar no topo das células e a ponta da pipeta para deslizar suavemente a almofada de ágar ao redor da câmara 10 a 20 vezes para criar uma monocamada de células no deslizamento da tampa.Mantenha a almofada de ágar na câmara por 12 a 15 minutos. Em seguida, transfira dois mililitros de cultura de esporulação para dois tubos de microcentrífuga e gire a 15.700 G por dois minutos. Depois de transferir o sobrenadante para tubos de microcentrífuga limpos, gire novamente na mesma condição e colete o sobrenadante para limpar os tubos de microcentrífuga.Adicione dois mililitros do sobrenadante gota a gota à câmara que contém a almofada de ágar. Uma vez que o líquido tenha atingido o topo da câmara, a almofada de ágar provavelmente flutuará. Remova a almofada de ágar suavemente com pinça e descarte-a.Coloque uma tampa de 24 por 50 milímetros na parte superior da câmara para evitar a evaporação durante a imagem. Para configurar o filme no microscópio, encaixe a tampa dentro do suporte da lâmina. Cole a argila de moldagem ao lado da tampa para mantê-la segura no suporte da corrediça.Abra o software de aquisição de imagens. Use botões de ajuste grossos e finos para focar as células usando DIC ou campo brilhante. No menu principal do software de aquisição de imagens, clique em Arquivo, selecione Adquirir e quatro janelas aparecerão.Na janela denominada Resolve 3D, clique no ícone do frasco de Erlenmeyer. Isso abrirá uma janela intitulada Design Run Experiment, que contém os controles para configurar um experimento para configurar um filme de lapso de tempo. Na guia Design, navegue até a guia Seccionamento.Selecione a caixa ao lado de Seção Z e defina o espaçamento de seção óptica para um micrômetro e o número de seções ópticas para cinco. Em seguida, na guia Canais, clique no ícone de adição e selecione o canal apropriado. Em seguida, selecione a caixa ao lado de Imagem de referência e defina a posição Z para o meio da amostra no menu suspenso.Selecione um valor de transmitância e tempo de exposição no menu suspenso. Na guia Time-lapse, marque a caixa ao lado de Time-lapse e insira valores para minutos e horas para identificar o intervalo de tempo de aquisição de imagem. Marque a caixa ao lado de Manter o foco com foco final para evitar desvios de palco durante o filme.E na guia Pontos, marque a caixa ao lado de Visitar Lista de Pontos. No menu principal, clique em Exibir e selecione Lista de pontos. Mova o palco para uma área da câmara que mostre uma monocamada de células.Clique em Marcar ponto na janela Lista de pontos. Mova o estágio para selecionar de 25 a 30 pontos sem qualquer sobreposição para evitar a superexposição das células e da imagem de cada campo durante cada curso de tempo. Na janela Lista de pontos, selecione Calibrar tudo para definir o foco final para cada ponto.Na guia Executar, salve o arquivo no destino apropriado no computador. Na janela Executar experimento, selecione o botão Reproduzir para iniciar o filme. Abra o software Fiji.Abra os canais DIC e mCherry. Obtenha uma única projeção de intensidade máxima do canal mCherry clicando em Imagem, seguido por Pilhas e Projeto Z e selecione Intensidade Máxima no menu suspenso. Para mesclar os canais DIC e mCherry em uma imagem, clique em Imagem, Cor e selecione Mesclar canais.Siga uma única célula através da meiose. Após a conclusão da meiose II, registre o número de massas de DNA. Em células do tipo selvagem com o fundo de âncora afastada, há tipicamente quatro massas de DNA no final da meiose II, representando os quatro produtos da meiose.Em uma pequena fração das células, apenas três massas são visíveis após a meiose II.Quando o Ctf19-FRB é ancorado no momento da liberação da prófase I, aproximadamente 47% das células exibem mais de quatro massas de DNA após a conclusão da meiose, sugerindo um defeito na fixação de cinetocoros e microtúbulos. Com a ancoragem de Ctf19-FRB, após a montagem do cinetócoro, mas antes da meiose I, ou após a meiose II, aproximadamente 16% das células exibem massas de DNA adicionais. Uma das partes mais importantes deste protocolo é adicionar o sobrenadante dropwise à sua câmara para evitar interromper sua monocamada.Além disso, observe o tempo necessário para se preparar para a geração de imagens para considerá-la em sua análise. Ao alterar proteínas fluorescentes, este procedimento pode ser usado para responder às perguntas sobre a duração do ciclo celular, segregação cromossômica, abundância de proteínas e localização de proteínas.

use-time-lapse-microscopy-stage-specific-nuclear-depletion-proteins

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