Medição Exocitose em Neurônios Usando Labeling FM

Biology

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Summary

A capacidade de medir a cinética de liberação de vesícula pode ajudar a fornecer a introspecção em alguns dos princípios básicos da neurotransmissão. Aqui usamos imagens em tempo real das vesículas marcadas com o corante fluorescente vermelho FM 4-64 para medir a taxa de liberação de vesículas pré-sinápticas no hipocampo culturas neuronal.

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Newton, J., Murthy, V. Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling. J. Vis. Exp. (1), e117, doi:10.3791/117 (2006).

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Abstract

A capacidade de medir a cinética de liberação de vesícula pode ajudar a fornecer a introspecção em alguns dos princípios básicos da neurotransmissão. Aqui usamos imagens em tempo real das vesículas marcadas com corante FM para monitorar a taxa de liberação de vesículas pré-sinápticas. FM4-64 é um corante vermelho anfifílicos fluorescentes styryl que incorpora nas membranas das vesículas sinápticas como endocitose é estimulado. Interações lipofílicas fazer com que a tintura para aumentar grandemente a fluorescência, assim emitindo um sinal luminoso quando associada a vesículas e uma nominal quando no líquido extracelular. Após uma etapa de lavagem é usado para ajudar a remover corante externa dentro da membrana plasmática, a FM restante é concentrado dentro das vesículas e depois é expelido quando exocitose é induzida por outra rodada de estimulação elétrica. A taxa de liberação de vesículas é medido a partir da queda da fluorescência. Desde FM coloração pode ser aplicada externa e transitoriamente, é uma ferramenta útil para determinar as taxas de exocitose em culturas de neurônios, especialmente quando se comparam as taxas entre as sinapses e transfectadas boutons controlo vizinhas.

Protocol

Células: Rat (ou mouse) principal do hipocampo culturas neuronais (14-28 dias in vitro).

Estimulação: Elétrica, entregues através de dois eletrodos de platina; 70-90 mV

Microscopia: lente 60x de óleo em um microscópio invertido CCD fluorescente.

Software: Slidebook (Intelligent imagem Innovations, Santa Monica, CA)

Consulte a página métodos complementares para mais detalhes

  1. Quente HEPES-salina tamponada (HBS) à temperatura ambiente. Adicione o receptor de glutamato antagonistas APV (50 mM de concentração final) e CNQX (10 mM final). Cada experimento FM geralmente requer 20-30 mL HBS. Para trabalhar concentração de 10 mM FM 4-64 (Molecular Probes), diluir solução estoque 1:1000 em BH (com antagonistas acrescentado). Fazer 2 mL FM Soln para cada experimento. Cubra com papel alumínio solução para evitar exposição à luz.

  2. Montar a lamínula contendo os neurônios para a câmara de eletrodo. Verifique se a mídia na câmara é o nível com o topo da câmara e cobre completamente os eletrodos. Remova qualquer excesso de solução de baixo da lamínula. Adicione o óleo para a lente (se estiver usando uma lente de petróleo).

  3. Configurar o aparelho de perfusão. Primeiro enxaguar com alguns mililitros de cada um seguindo os na ordem dada (deixar que cada um fluxo completamente antes de adicionar o seguinte): água, água, etanol, então HBS. Em seguida adicione o HBS (salvo alguns mililitros para adicionar à mão em etapas futuras) e fechar a perfusão. Configurar a saída de perfusão e de sucção em lados opostos nas bordas da lamínula. É melhor se a saída de perfusão chega na câmara, onde, como a sucção deve descansar no topo. Ao adicionar HBS (quer por perfusão ou com a mão), abra a sucção e ajustar sua posição de modo que mantém a mídia da direita em nível de apenas cobrir completamente os eletrodos.

  4. Procure a área na lamela que você deseja para a imagem e tentar trazê-lo mais ou menos em foco. Áreas ideais contêm muitas sinapses, mas não deve ser tão densa que tais processos individuais tornam-se indistinguíveis. Não deve haver-to-mínimo corpos celulares, membranas externa (tais como aglomerados de astrócitos), ou outros materiais não-específicos (tais como fiapos). O corante pode FM inespecificamente aderir a estas.

  5. Use o "GT" cubo de filtro (que excita com luz verde e vermelha recolhe-to-longe emissões vermelho). Set "preferências capturar" SlideView para entregar 900 AP a 10Hz sobre o início da imagem 0 (tipicamente 300-900 APs são usados ​​para este estímulo de carga). Na janela de imagem, selecione a opção "fluo-vis-vermelho" configurações de filtro e mudar o tempo de exposição a 100 ms. Desligue quaisquer definições pré-existentes timelapse. Não tome todas as imagens até que você esteja pronto para começar a estimulação.

  6. Certifique-se que a sucção é on / aberto. Adicionar rapidamente o Soln FM (2 mL) para a câmara na extremidade oposta da sucção. Imediatamente pressione ok na janela de imagem para obter uma imagem e começar a estimulação. Esperar 30-45 segundos após a estimulação e então rapidamente lavar FM adicionando ~ 2 mL da HBS (eu faço isso à mão com uma pipeta, mas isso também pode ser feita por perfusão).

  7. Lave o FM com HBS, através de perfusão para ~ 10 minutos. A vazão deve ser 1-1,5 mL / min. Durante esta etapa de lavagem, alterar as preferências de estímulo para que o início da estimulação começa @ image 10 (tipicamente 900-1200 APs @ 10 Hz são usados ​​para este estímulo descoloração). Cerca de 7 min para a lavagem, verifique as preferências (início de estímulo na imagem 10). Agora, usando a janela do pequeno foco escolher e focar uma sub-região. Verifique se as configurações de estimulação foram alterados antes de prosseguir para a próxima etapa. Dê uma única imagem para ver se a lavagem completa (sinapses individuais devem ser claramente punctated). Se não, aumentar a taxa de fluxo de um 0.5mL/min adicionais, e esperar mais 2 minutos.

  8. Depois de lavagem é completa, ajustar o tempo de exposição necessário para continuar a receber um sinal bom, claro (geralmente entre 50-100 ms. Exposição vezes deve ser minimizado devido à fotodegradação rápida da FM). Em seguida, defina as preferências timelapse a tomar 38 imagens a cada 5 segundos. Verifique a perfusão para fazer há bastante HBS por mais 5 minutos, e deixar fluir a perfusão. Iniciar timelapse para começar a descoloração.

  9. Depois destain, alterar as configurações de estímulo para entregar 1.200 AP @ 10Hz (tipicamente 1200-2000 APs são usados ​​para esta etapa final) sobre a imagem 0. Desativar as configurações timelapse e tomar uma única imagem para começar a estimulação. A perfusão deve ainda estar fluindo Este passo ajudará a remover qualquer restantes vesicular corante FM, a fim de determinar de base / "total releasable" fluorescência. Após o estímulo é terminado, desligue as definições de estimulação, traga a região em foco. Feche a perfusão e de sucção, E depois tome duas imagens de referência final. De qualquer imagem ou Z-stack imagens (passos de 0,5 mm) podem ser tomadas. Z-stacks são úteis no caso de haver uma mudança no plano de foco durante o experimento.

  10. Sua experiência FM é feito. Se imediatamente fazer mais experimentos, a lente ea câmara devem ser limpos entre cada tentativa, mas o aparelho de perfusão não precisa ser limpo após o experimento final. Enxágüe completamente o aparelho com água, então etanol.

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Discussion

De 300 potenciais de ação (APs) é suficiente para induzir, pelo menos, uma rodada de reciclagem de vesícula, um estímulo de carga de 300 ou mais APs muitas vezes é dado para rotular a piscina de reciclagem de vesículas. Apesar de estímulos de carga mais intensa, tais como 900 APs, pode permitir que um número nominal de vesículas adicional a ser rotulados, isso também aumenta a quantidade de tempo que o corante pode incorporar nas membranas extracelulares, levando a uma maior coloração não específica. Eu encontrei a etapa de lavagem a ser fundamental para garantir descoloração adequada. É importante para perfundir com taxa de fluxo de 1-1,5 mL por minuto, geralmente para 10 + 2 minutos. Uma única imagem pode ser tomada a 7 minutos para a lavagem para acompanhar o grau de remoção de corante. Se necessário, a taxa de fluxo e ou tempo de lavagem pode ser ligeiramente aumentada. Para nossos experimentos não seria desejável para a lavagem de proceder maior do que 10-12 minutos, pois isso aumenta a probabilidade de perder vesícula rotulagem através de eventos exocitose espontânea que pode ocorrer mesmo quando a célula está em repouso. Para a etapa de descoloração, 900-1200 APs foram administradas a libertação de todos os vesículas rotulados. Além disso outra APs 1200-2000 foram muitas vezes dada para obter um valor base de "fluorescência releasable", usados ​​para normalizar os dados de descoloração.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
APV Sigma-Aldrich A5282
FM 4-64 Molecular Probes, Life Technologies T-3166
CNQX disodium salt Sigma-Aldrich C-239

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References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).

Comments

4 Comments

  1. The data you can see on the screen look af if you see a lot of photobleaching. Is this true?
    How do you correct for this?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2008 - 2:20 PM
  2. As in all fluorescence imaging experiments, bleaching can be corrected for in several ways.
    First, we use a sequence of frames where no stimulation was applied to obtain the bleaching rate
    (make sure to subtract a background region from all the frames). We then fit an exponential
    to this control background-subtracted data.
    Bleach(i) = Bleach(0)*exp(-i/tau) Then, we go back to the original data (minus the background) and apply the exponential correction.  F_corrected(i) = F(i)/exp(-i/tau)

    There are many descriptions of bleach correction on the web (just google).
    A nice description of bleach correction was recently described in:
    http://www.jneurosci.org/cgi/content/full/²5/19/4766/DC1 (see second supplementary material)
    A technical article on general calibration can be found in Journal of Microscopy, ²16:15-²4 (²004)
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2008 - 10:49 AM
  3. Thanks for this nice protocol.
    I started working with this technique and found your video really helpful.
    One question i would like to ask is related to the reproducability of this kind of experiments. Can you do repeated loading / unloadings on the same set of synapses?

    E.g., in my first experiments i use 600Ap/²0Hz stimuli for loading and destaining of the synapses, respectively. Image acquisation is done with with 1 Hz and a total of 70 images (²0 images before/after stimulation).

    While i get nice punctae with corresponding destaining curves in the first loading/unloading cycle, i found it vitually impossible to do a second round of stimulations at the same set of synapses. After the second loading the whole neurites become very bright, no punctae are identifiable and there is also no clear destaining, apart of photo bleaching.

    Can it be that the dye is damaging the synapses? (I use neutral density filters with ~5% transmission and select the exposure times as short as possible).

    Any comment or help on this is highly appreciated!

    Best,

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2009 - 6:12 AM
  4. Paul,

    It is not uncommon to have difficulty for repeated staining. It is often related to one of two things:

    (i) Too much background: it is possible that you are ending up with too much surface stain with repeated loading and you are swamping the actual intravesicular signal. You can test this by skipping the labeling step in the first round - just stimulate as many times to mimic stainign and destaining, but don't add FM dye. Then, try the second round staining.

    (ii) The preparation becoming unhealthy either due to excessive electrical stimulation or phototoxicity. You can test this by skipping stimulation the first round and just have dye present for the same time, wash it out. Then, wait and do the second round as usual. To test phototoxicity, you can do staining and destaining in the first round, but just don't image at all. Then, start imaging only for the second staining.

    In the end, I am afraid that you may have to try several combinations of things.

    Best,

    -venki murthy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2009 - 12:31 PM

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