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Generazione di Human CD40 delle cellule B attivate

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Liebig, T. M., Fiedler, A., Zoghi, S., Shimabukuro-Vornhagen, A., von Bergwelt-Baildon, M. S. Generation of Human CD40-activated B cells. J. Vis. Exp. (32), e1373, doi:10.3791/1373 (2009).

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Abstract

CD40-attivate le cellule B (linfociti B CD40-) sono stati identificati come fonte alternativa di immuno-stimolatorie cellule presentanti l'antigene (APC) per l'immunoterapia del cancro 1-3. Rispetto alle cellule dendritiche (DC), il miglior APC caratterizzato, le cellule CD40-B hanno diverse proprietà distinte biologici e tecnici. Simile alla DC, le cellule B mostrano un aumento dell'espressione di MHC e molecole co-stimolatorie (Fig.1b), mostrano una forte capacità migratoria e presentazione dell'antigene presente in modo efficiente alle cellule T, dopo stimolazione con il ligando dell'interleuchina-4 e CD40 (CD40L). Tuttavia, a differenza di DC immature o mature, le cellule B CD40-esprimono la piena triade nodo homing linfa composto da CD62L, CCR7/CXCR4, e la funzione dei leucociti antigene-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessaria per homing di organi linfatici secondari (Fig.1a) 3. Cellule CD40-B può essere generato senza difficoltà da piccolissime quantità di sangue periferico che può essere ulteriormente espanse in vitro di grandi quantità di altamente puri-CD40 delle cellule B (> 10 9 cellule per paziente) da donatori sani e come il cancro pazienti (Fig.1c, d) 1,4.

In questo protocollo dimostriamo come ottenere pienamente attivato le cellule B CD40-da PBMC umane. Molecole chiave per la coltura cellulare sono ligando CD40, l'interleuchina-4 (IL-4) e ciclosporina A (CsA), che viene rifornito in un ciclo di 3-4 cultura giorno. Per scopi di laboratorio CD40-stimolazione è fornito da NIH/3T3 cellule che esprimono CD40 ligando ricombinante umano (tCD40L NIH/3T3) 5. Per evitare la contaminazione con le cellule non transfettate, espressione del ligando CD40 umano sulla trasfettate deve essere controllata regolarmente (Fig.2).

Dopo 14 giorni CD40-B colture cellulari costituiti da oltre il 95% delle cellule B puro e una espansione del CD40 delle cellule B con più di 65 giorni è spesso possibile senza alcuna perdita di funzione 1, 4. Le cellule B CD40-in modo efficiente raccogliere, trasformare e antigeni presenti alle cellule T 6. Non solo naϊve primo, ma anche di espandere le cellule T di memoria 7,8. CD40-attivate le cellule B possono essere utilizzati per studiare l'attivazione delle cellule B, la differenziazione e la funzione. Inoltre, essi rappresentano uno strumento promettente per la vaccinazione terapeutica o preventiva contro i tumori 9.

Protocol

Il protocollo per la generazione di umani CD40 delle cellule B attivate da PBMC è diviso in due parti: la parte A dimostra la preparazione di ligando CD40 esprimere NIH/3T3 celle, che sarà usato come piatto legato cellule nutrici. Parte B descrive l'attuale B CD40-cultura.

A. Preparazione di cellule di alimentazione (tCD40L NIH/3T3)

Il NIH/3T3 tCD40L è un aderente murino linea cellulare di fibroblasti, che non dovrebbe mai diventare completamente confluenti. Le cellule sono quindi suddivisi due volte alla settimana. Coltura per più di 6 settimane non è raccomandato.

  1. Rimuovere medio vecchio dalla coltura primaria con una pipetta sterile e lavare le cellule con 10 ml di PBS 1x. Aspirare il PBS dopo il lavaggio.
  2. Aggiungere 4 ml di tripsina / EDTA in un centimetro 75 2 fiasco per 5-10 minuti a 37 ° C. Usa picchiettando leggermente per staccare le cellule.
  3. Aggiungere 10 ml di medium di tipo selvatico e girevole con delicatezza.
  4. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 ml con una pipetta sterile e girare le celle in basso a 225 xg per 5 min.
  5. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 10 ml di medium di tipo selvatico. Contare il numero di cellulare di una aliquota della sospensione cellulare e preparare tre da 50 mL con il numero appropriato di cellule:
    1. 1,5 x 10 6 cellule per subcolture
    2. 0,2 x 10 6 cellule / pozzetto di irradiazione utilizzate nel CD40-B colture cellulari
    3. resto di congelare (se necessario).
  6. Spin le cellule verso il basso a 225 xg per 5 min.
  7. Rimuovere il surnatante.
    1. Per subcolture: risospendere 1,5 x 10 6 cellule in 10 ml di tipo medio selvatici in un CM 75 2 fiasco coltura cellulare (cellule densità di 1,5 x 10 5 cellule / ml), aggiungere G-418 [0,7 mg / ml] e incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2. Dividere le celle due volte alla settimana.
    2. Per la B CD40-coltura cellulare: Avete bisogno di 1,2 x 10 6 cellule per un 6-pozzetti. Risospendere le cellule in terreno di tipo selvatico ad una densità di 0,1 x 10 6 cellule / ml e irradiare li a 78 Gy. Tavola 2 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto e incubare loro a 37 ° C con 5% di CO 2. Utilizzare questa piastre preparate per la stimolazione delle cellule B quando tCD40L NIH/3T3 cellule sono aderenti (almeno 4 ore: controllare l'aderenza con il microscopio, non aspettare più di 24 ore per iniziare la stimolazione delle cellule B). (Continua con B.)

B. CD 40-B di coltura cellulare

I. Preparazione di PBMC per CD40-stimolazione (giorno 0):

Attenzione: prima di continuare a constatare che le cellule feeder siano aderenti. Aggiungere sempre soluzioni fresche di interleuchina-4 e ciclosporina A per il terreno di coltura immediatamente prima dell'uso.

  1. Prendete PBMC, fresco o opportunamente scongelati. Risospendere PBMC due volte in 50 mL di PBS 1x di lavarli e spin down prima volta a 265 xg per 7 min e una seconda volta a xg 190 per 7 minuti per eliminare altre cellule. Gettare il surnatante e risospendere le cellule in 20 ml di PBS. Determinare il numero di cellule in una parte aliquota della sospensione cellulare.
  2. Spin down quantità necessaria di cellule a 225 xg per 5 min. Per un 6-pozzetti 4 x 10 6 cellule / pozzetto sono necessari, quindi 24 x 10 6 cellule per piastra.
  3. Rimuovere il supernatante e risospendere il PBMC con 1 x 10 6 cellule / ml in B CD40-terreno di coltura fresco integrato con 50 U / mL di interleuchina-4 come un fattore di crescita e di 0,63 mg / ml ciclosporina A per prevenire conseguenza di cellule T (concentrazioni indicati si riferiscono a un mezzo ml di cultura!).
  4. Rimuovere il surnatante da 6 pozzetti di pre-incubazione piatto con tCD40L NIH/3T3 cellule.
  5. Lavare l'aderente tCD40L NIH/3T3 cellule con 2 ml di PBS per primo pozzo e in una seconda fase con 2 ml di CD40-B medio di lavaggio.
  6. Delicatamente aggiungere 4 ml di sospensione PBMC (1 x 10 6 cellule / ml) in ciascun pozzetto della piastra ben 6.
  7. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2.
  8. Il giorno 7, reculture le cellule (Continua al punto 3.2.).

II. Ricoltivazione di cellule CD40-B (7 ° giorno e poi ogni 3-4 giorni):

  1. Cluster raccolta di cellule CD40-B da 6 pozzetti da risospendere con una pipetta da 10 mL e la piscina in un tubo da 50 ml.
  2. Spin down a 225 xg per 7 minuti e sostituire completamente il sopranatante con CD40-B medio di lavaggio. Mentre conta la quantità delle cellule di una aliquota, girare la celle in basso a 225 xg per 5 minuti. Risospendere le cellule B CD40-CD40-B in terreno di coltura ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / ml.
  3. Aggiungi soluzioni fresche di interleuchina-4 in una concentrazione di 50 U / mL e 0,63 mcg / mL ciclosporina A per la media.
  4. Rimuovere il surnatante da un 6-pozzetti pre-incubate con tCD40L NIH/3T3 cellule.
  5. Lavare le cellule aderenti con 2 ml di PBS per primo pozzo e in una seconda fase con 2 ml di CD40-B medio di lavaggio.
  6. 6 cellule / ml) di sospensione CD40-B in ciascun pozzetto della piastra ben 6.
  7. Incubare le piastre a 37 ° C con 5% di CO 2.
  8. Cellule sottocultura di nuovo ogni 3-4 giorni per finire con elevata purezza umano CD40 delle cellule B attivate dopo un totale di 14 giorni.

C. Soluzione dei problemi - Che cosa succede se le cellule CD40-B non crescono?

  1. Hai controllato di espressione ligando CD40 delle cellule alimentatore?
  2. La piastra-bound cellule alimentatore utilizzato per la stimolazione non deve essere più di 24 ore?
  3. È una possibile contaminazione con micoplasma?
  4. È stata la interleuchina-4 soluzione utilizzata per la supplementazione appena scongelato e aveva l'attività biologica appropriata?
  5. È stato aggiunto ciclosporina A nella concentrazione giusta?

Figura 1
Figura 1. Si prega di cliccare qui per una versione più grande della figura 1.

Figura 2
Figura 2. Si prega di cliccare qui per una versione più grande della figura 2.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
A. Preparation of Media:
1. Feeder cell wild type medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
2. Feeder cell selection medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
G-418 (0.7 mg/mL)
3. CD40-B washing medium
IMDM
L-Glutamine (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
4. CD40-B culture medium
IMDM
L-Glutamine (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
rh Transferrin (50 μg/mL)
rh Insulin (5 μg/mL)
AB-Humanserum (10%)
B. Miscellaneous Reagents:
DMEM / Ham’s F12 PAA Laboratories Cat No: E15-813
IMDM Invitrogen REF 21980-032
Dulbecco’s PBS (10x) PAA Laboratories Cat No H15-011
AB-Human Serum Invitrogen Cat No 34005100
holo-Transferrin human Sigma-Aldrich Cat No T0665
Insulin human Sigma-Aldrich Cat No I2643
Gencin® Delta Select Art No 7395800
Recombinant Human Interleukin-4 Immunotools Cat No 11130045
Cyclosporin A Novartis AG Cat No NDC 0078-0109-01
FBS Lonza Inc. Cat No DE14-802C
HEPES Buffer PAA Laboratories Cat No S11-001
G-418 Sulphate PAA Laboratories Cat No P02-012
Trypsin/EDTA (10x) Invitrogen REF 15400-054
C. Miscellaneous Supplies:
Sterile pipette tips Sarstedt Ltd
6-well plate Nalge Nunc international Cat No 140675
50mL conical tube BD Biosciences Cat No 352070
Tissue culture flask Sarstedt Ltd Cat No 83.1813.002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).
  2. Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).
  3. Bergwelt-Baildon, M. von CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107, 2786-2789 (2006).
  4. Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).
  5. Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma. Blood. 85, 1903-1912 (1995).
  6. Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).
  7. von Bergwelt-Baildon, M. S. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99, 3319-3325 (2002).
  8. Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).
  9. Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15, 955-965 (2008).

Comments

8 Comments

  1. I would like to know if the 3T3 cells seeded are not confluent in the 6-well plate after ²4 hours incubation, can the plate be used for co-culture with PBMC?

    Reply
    Posted by: Ping Lung C.
    October 21, 2009 - 5:48 AM
  2. The 3T3 cells are adherent after 1² to ²4h incubation and yes they can be used for co-culture.

    Reply
    Posted by: Alexander S.
    October 21, 2009 - 8:49 AM
  3. This is quite interesting, but I wonder what is the practical advantage over using an activating anti-CD40 like www.epitomics.com/pdf/440²-1.pdf or simply a soluble CD40L like www.biomol.de/datenblaetter/biomol_de/94894.pdf or ?

    Reply
    Posted by: Oliver T.
    October 21, 2009 - 5:40 PM
  4. You are absolutely right. It would be much simpler to use a soluble ligand instead of the CD40L-expressing cell line. Unfortunately, none of the ligands we tested worked for our purpose. All were able to induce activation of B cells but none of them induced the robust proliferation that we observe with the CD40L-expressing NIH3T3 cells.
    The only ligand that was able to induce proliferation was a trimeric ligand produced by Immunex. Howerver, to our regret Immunex stopped its development and it is not available anymore.

    Reply
    Posted by: Alexander S.
    October 22, 2009 - 10:07 AM
  5. Apart from research developments, what do you think about the use of CD40L-stimulated B cells in clinical settings (such as cellular adiuvants), and how, in these cases, can we avoid the use of reagents and cells not adequate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 14, 2009 - 12:11 PM
  6. where did you obtain the cd40ligand expressing 3t3 cells???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 6, 2010 - 6:56 PM
  7. Hi,
    I am encountering problem with the feeder cell monolayer, after putting the B-Cells on the top of monolayer, cells from monolayer it starts coming up and ultimately leading to loss of B-cells too.
    Have you any time encountered any such issue with monolayer (Cd40)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 4, 2011 - 4:56 PM
  8. i wanna know in daetail about culturing cells and about protein purification

    Reply
    Posted by: Mustafa A.
    September 10, 2012 - 7:34 AM

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