Utilisation de la limule, Limulus Polyphemus, En recherche sur la vision

Biology

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Summary

Dans cette vidéo, nous effectuons l'enregistrement électrorétinogramme, l'enregistrement du nerf optique, et l'enregistrement intrarétinienne avec le crabe fer à cheval, américains,

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Liu, J. S., Passaglia, C. L. Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research. J. Vis. Exp. (29), e1384, doi:10.3791/1384 (2009).

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Abstract

Le crabe fer à cheval, américains, Limulus Polyphemus est l'une des plus anciennes créatures sur terre, et l'animal continue à jouer un rôle indispensable dans la recherche biomédicale. Non seulement leur sang contient des cellules spéciales que les scientifiques utilisent pour détecter bacteriotoxins dans nos médicaments, mais leurs yeux contiennent également un réseau de neurones qui a donné un aperçu beaucoup plus sur les processus physiologiques de fonctionnement de notre système visuel, tels que l'adaptation de lumière et de l'inhibition latérale. La limule reste un modèle attractif pour la recherche de vision parce que l'animal est grand et robuste pour un invertébré, ses neurones rétiniens sont grandes et facilement accessible, son système visuel est compact et largement étudié, et son comportement visuel est bien définie. Par ailleurs, la structure et la fonction des yeux sont modulés sur une base quotidienne par une horloge circadienne dans le cerveau de l'animal s. En bref, le système visuel des limules est assez simple pour être compris encore suffisamment complexe pour être intéressant.

Dans cette vidéo, nous présentons trois paradigmes électrophysiologique pour étudier les bases neurales de la vision qui peut être effectuée in vivo avec limule. Ils sont l'enregistrement électrorétinogramme, l'enregistrement du nerf optique, et l'enregistrement intrarétinienne. Électrorétinogramme (ERG) des enregistrements de mesurer avec une surface de l'électrode de la réponse électrique de résumer toutes les cellules de l'œil à un flash de lumière. Ils peuvent être utilisés pour contrôler la sensibilité globale de l'oeil pour prolonger les périodes de temps. Enregistrements du nerf optique de mesurer l'activité de dopage de fibres nerveuses unique avec une électrode extracellulaire micro-aspiration. Ils peuvent être utilisés pour étudier des messages visuels transmis de l'oeil au cerveau ainsi que l'horloge circadienne-messages renvoyés par le cerveau à l'œil. Intrarétinienne mesure des enregistrements avec une microélectrode intracellulaire des fluctuations de la tension induite par la lumière dans des cellules individuelles de l'œil. Ils peuvent être utilisés pour élucider les mécanismes cellulaires de la rétine de traitement.

Protocol

Partie 1: Préparation expérimentale

Les procédures expérimentales réalisées sur les limules ont été approuvés par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation à l'Université de Boston. Les animaux sont achetés sur le Labs de biologie marine (Woods Hole, MA) ou d'autres fournisseurs et logés dans un réservoir d'eau salée dans une pièce aérée exposés à un marché réglementé cycle lumière-obscurité. Le schéma d'éclairage est important pour entraîner l'horloge circadienne du crabe et du vélo l'oeil quotidiens entre ses Etats diurnes et nocturnes. Immédiatement avant de commencer toute procédure invasive, l'animal est refroidie dans un seau à glace pendant 10-15 minutes jusqu'à ce que son mouvement est ralenti et alors fixé à une plate-forme en bois avec deux vis en acier inoxydable inséré dans le prosoma et deux dans la opisthosome. La plateforme est pondérée en dessous avec le granit afin qu'il s'enfonce dans l'eau. Après des expériences terminal de l'animal est euthanasié en plongeant dans les coulis de glace à nouveau et jonchage le cerveau, qui se trouve au dessus de la bouche, avec un scalpel.

Partie 2: Solutions

Solution de Limulus Ringer est composé de 430 mM de NaCl, 9,56 mM de KCl, 9,52 mM de CaCl2, 9,97 mM de MgCl2, 21,05 mM MgSO4, 50 microns TES, HEPES 50 microns, et 10ml / L Pen-Strep mélange (pénicilline-streptomycine, 10000 unités / ml) .

Partie 3: Enregistrement Électrorétinogramme

Outils nécessaires pour cette procédure comprennent un tournevis, de la vaseline, la solution de Ringer, une pipette de transfert, une LED verte, une chambre d'enregistrement, des vis en acier inoxydable, et un coton-tige.

  1. Une chambre de la main est utilisée pour enregistrer l'ERG (figure 1A). Le corps de la chambre est conçue pour contenir un réservoir salin en contact avec les yeux. Le couvercle contient un fil de chlorure d'argent pour le couplage de la solution conductrice à un amplificateur et un trou de petite taille pour accueillir une LED. Un ultrabrillant LED avec émission de pic autour 520nm fonctionne le mieux.
  2. Pour commencer, la face inférieure de la chambre est recouvert avec de la vaseline et sécurisé sur l'œil avec deux vis.
  3. La chambre est alors remplie avec une solution saline et plafonné avec le couvercle.
  4. Après fixation de chambre le crabe est placé dans une cage étanche à la lumière dans un réservoir rempli d'eau de mer sur les branchies.
  5. Le câble de LED est inséré dans le couvercle de la chambre.
  6. Le câble de signal est coupé sur le fil du chlorure, et le plomb de référence est accroché à l'un des vis implantées.
  7. Les deux fils sont connectés à l'étape de la tête d'un amplificateur différentiel à haute impédance (X-cell 3x4, Inc FHC) pour l'amplification du signal et le filtre amplificateur est réglé pour passer les fréquences inférieures à 10Hz.
  8. La sortie de l'amplificateur est alimenté à un oscilloscope pour la visualisation et à une carte d'acquisition de données pour l'analyse informatique et du stockage.
  9. Après l'installation de la porte de la cage est fermée pour bloquer la lumière ambiante d'atteindre l'animal.
  10. Les données sont recueillies avec un programme personnalisé écrites dans LabVIEW. Le programme fait clignoter le voyant, les dossiers de l'ERG a évoqué le signal, et les mesures de l'amplitude de la réponse de crête à crête. Le choix du paradigme éclair dépend de l'objectif expérimental. Par exemple, une brève description (100ms) impulsions de 5V appliquée toutes les 10 minutes à la LED évite les effets de l'adaptation à la lumière lors de la surveillance des changements circadiens de la sensibilité des yeux.

Partie 4: enregistrement du nerf optique

Outils nécessaires pour cette procédure comprennent un tournevis, fil, un trépan, la solution de Ringer, rongeurs, des ciseaux Vannas, une chambre d'enregistrement, des pinces courbes, des sondes aiguille fine, une sourde scalpel, ciseaux chirurgicaux, et une électrode de succion.

  1. Une chambre de la main est utilisée pour enregistrer les réponses du nerf optique (figure 1B). L'intérieur de la chambre est de 2cm de diamètre et ouvert qui a une mince ouverture semi-circulaire à fente dans le mur en bas pour accueillir le nerf et l'isoler du tissu environnant.
  2. Avant l'attachement de chambre d'une aiguille de calibre 16 est inséré entre les muscles de charnière dans le cœur et ~ 20cc de sang est drainé par l'animal. Exsanguination n'est pas nécessaire, mais rend la dissection du nerf optique plus facile.
  3. L'emplacement du nerf optique est estimé, en s'appuyant sur la carapace d'une ligne légèrement courbée entre les yeux latéraux et médians.
  4. Un trou circulaire est alors coupé de la carapace avec un trépan. Le trou est le même diamètre que la chambre bien. Le centre du trou est situé à 2-3 cm en avant de l'œil latéral et légèrement dorsale à la ligne de sorte que le nerf longe la partie ventrale du puits.
  5. Le tissu conjonctif est effacé jusqu'à ce que le nerf est entièrement visible et libre de environnantes et qui sous-tendent le tissu.
  6. Un brin de fil est bouclé autour du nerf et a tiré dans la chambre à travers la fente au fond. Grâce à cette même ouverture le nerf est doucement guidé dans la chambre en tirant sur la ficelle. Dans le même temps la chambre est bien insérée dans le trou. La chambre est alors apposée sur la carapaceavec des vis et le puits est rempli d'une solution de Ringer.
  7. Après fixation de chambre de l'animal est placé dans une cage étanche à la lumière dans un réservoir rempli d'eau de mer sur les branchies.
  8. Le puits est visualisé sous un stéréoscope (SMZ-168, Jed Pella Inc) et le coton est rembourré autour de l'ouverture dans le fond pour empêcher la fuite de sang dans une solution saline et hors de la chambre.
  9. Résiduelle de tissu conjonctif autour du nerf est enlevé avec des ciseaux et des pinces fines, et la chambre est remplie avec une solution de Ringer fraîches.
  10. Une incision est faite dans le vaisseau sanguin qui encapsule le nerf et par cette ouverture le nerf est soigneusement desheathed sur toute sa longueur à l'aide de ciseaux fins, pince à épiler, et les sondes à aiguilles.
  11. Un faisceau de fibres minuscules est séparé du nerf à l'aide de la sonde et coupé à l'extrémité opposée de l'œil pour l'enregistrement des fibres afférentes et à l'extrémité la plus proche de l'œil pour l'enregistrement des fibres efférentes. Dans la vidéo à la fin des enregistrements fibre afférente est coupé.
  12. Une électrode de micro-aspiration (AM Systems Inc), rempli de solution de Ringer est utilisé pour l'enregistrement du nerf optique. L'extrémité de l'électrode est montée sur le faisceau nerveux par le feu polissage de l'extrémité d'un verre de borosilicate 1 mm de diamètre capillaire.
  13. L'extrémité de l'électrode est descendue dans la chambre bien avec un manipulateur manuel (WPI Inc) et le faisceau de fibres coupées est aspiré dans l'embout. L'aspiration est fournie par une seringue Gilmont reliée à l'électrode via un tube.
  14. Une connexion BNC fournit le câble de signal et un fil de chlorure d'argent enveloppé autour de l'électrode pour réduire le bruit fournit le fil de référence. Les deux fils sont connectés à l'étape de la tête d'un amplificateur différentiel pour l'amplification du signal et de filtrage du bruit (X-cell 3x4, FHC Inc.) La sortie de l'amplificateur est envoyé à un oscilloscope pour la visualisation et une carte d'acquisition de données pour l'analyse de l'ordinateur et le stockage.
  15. Les données sont recueillies avec un programme personnalisé écrites dans LabVIEW. Le programme de contrôle des stimuli lumineux via un processeur vidéo numérique (Bits + +, Cambridge Research Systems Inc) et les interfaces avec un discriminateur numériques pic (APM, Inc FHC) qui enregistre les trains pic. La lumière peut être livré à des cellules individuelles dans l'oeil via un conduit de lumière en fibre optique ou à l'œil entier via un écran vidéo contrôlé par ordinateur.

Partie 5: enregistrement intrarétiniennes

Outils nécessaires pour cette procédure comprennent un tournevis, une forme de L avec la plate-forme de lucite trous filetés, un porte-microélectrode avec une pipette en verre, des vis en acier inoxydable, des pincettes et un scalpel bien.

  1. Une plaque à la main avec trous de vis lucite prédéfini est utilisé pour enregistrer les réponses intracellulaires. Les trous sont espacés pour le montage d'un micromanipulateur motorisé (PPM5000, WPI Inc.) La plaque est fixée sur l'animal avec deux vis sur le côté et une sur le dessus.
  2. Après fixation de la plaque de l'animal est placé dans une cage étanche à la lumière dans un réservoir rempli d'eau de mer sur les branchies.
  3. Le micropositionneur est vissé dans la plaque, avec son bras mobile alignée sur l'œil.
  4. Un lot de micropipettes de verre sont tirés de 1 mm OD verre borosilicate et les conseils sont remblayés par capillarité en plaçant les micropipettes dans un petit flacon de solution 3M KCl.
  5. Le reste des pipettes sont ensuite remplies manuellement avec la solution de sel et inséré dans un porte-électrode.
  6. Le porte-électrode est connectée à l'étape de la tête d'un amplificateur intracellulaire (IR-283, Cygnus Technology Inc) apposé sur le bras micropositionneur.
  7. Une petite section de la rétine (~ 1mm2) est exposée en coupant l'interface de la cornée avec une lame de rasoir.
  8. Une goutte de solution de Ringer est placé sur la rétine exposée à prévenir le dessèchement et la pointe micropipette est avancé par l'ouverture dans le tissu rétinien.
  9. Lorsque la pointe pénètre dans la solution, le mode d'injection de courant de l'amplificateur intracellulaire est engagé et l'impédance de l'électrode est mesuré. Micropipettes avec une impédance de l'extérieur de la gamme de 20-70 MW sont jetés. Ceux de cette gamme sont avancés dans les étapes micron et empalé dans les cellules en vibrant la pipette électronique ou mécanique.
  10. Trois types de cellules peuvent être rencontrés dans l'œil. Cellules Retinular montrent seulement une réponse à la dépolarisation de lumière, les cellules excentriques montrent un train de potentiels d'action à cheval sur une réponse dépolarisant, et des cellules pigmentaires ne montrent pas de réponse à la lumière du tout.
  11. Les données sont recueillies avec un programme personnalisé écrit en Labview. Le programme de contrôle des stimuli lumineux via un processeur vidéo numérique (Bits + +, Cambridge Research Systems). Les stimuli sont livrés à des cellules empalé avec un tuyau en fibre optique ou écran vidéo. Tension réponses sont observées sur l'oscilloscope et numérisées par le programme d'ordinateur.

Partie 6: Résultats Représentant

Un représentant du GRE est montré dans la figure 2A. La forme d'onde représente la résumer électriquesréponse à la lumière des cellules photoréceptrices principalement retinular, car ils sont beaucoup plus nombreux les cellules excentrique et sont couplés électriquement pour eux. Il n'ya pas de forme d'onde multiples composants de différents types de cellules rétiniennes comme avec les mammifères ERG. Rétroaction circadien d'une horloge dans le cerveau Limulus module les propriétés physiologiques des cellules de la rétine sur une base quotidienne, ce qui provoque le cours amplitude et de temps de l'ERG à varier au fil du temps (1). Comme le montre la figure 2B, l'ERG d'amplitude est plus élevée pendant la nuit subjective de l'animal le plus faible et pendant la journée subjectif.

Une trace représentant d'une réponse unique nerf optique de fibre à la lumière est montré dans la figure 3. Excentrique cellules se comportent tous sensiblement la même, montrant une augmentation transitoire de débit pic suivi d'une décroissance à un niveau soutenu. La décroissance taux reflète l'action combinée de la lumière et l'adaptation pic-dépendante auto-inhibition sur les cellules excentrique (2). Autres modèles de pointe, tels que dépendant de la lumière diminue dans les taux, sont observées dans le cerveau Limulus mais pas l'œil (3).

Représentant des traces de la réponse en tension d'une cellule de la cellule pigmentaire, cellules retinular, excentrique et à la lumière sont présentés dans la figure 4. Seuls les deux derniers types de cellules rétiniennes sont visuelles. Le cours d'amplitude et le temps de leur réponse dépend de la qualité de l'enregistrement et l'emplacement de l'électrode dans la cellule. Habituellement, l'électrode pénètre dans les cellules pigmentaires ou les cellules retinular raison de leur grande taille et en nombre. Si celle-ci, une dépolarisation transitoire qui se désintègre à un niveau soutenu est enregistrée. La décroissance est due à l'adaptation de lumière par les cellules retinular (2). Si l'électrode rentre dans une cellule excentriques, des potentiels d'action grandes sont enregistrées dans l'axone (40-70mV) et les potentiels d'action de petites cheval sur une forme d'onde de dépolarisation (<25mV), près du soma.

Figure 1
Figure 1. Schémas des chambres utilisées pour l'enregistrement de l'électrorétinogramme (A) et l'enregistrement du nerf optique (B). Bar équivaut à 7mm en A et en B. 5mm

Figure 2
Figure 2. Exemple d'un oligo-ERG Limulus évoquée par une LED 100ms pouls de 5V dans le noir (A) et la fluctuation de pic à pic dans l'ERG d'amplitude au fil du temps dans l'obscurité constante (B). L'obscurité a été initié à l'heure indiquée par le triangle blanc. La croissance de l'ERG d'amplitude à travers le temps indiqué par le triangle noir est due à l'adaptation de lumière, ce qui augmente la sensibilité des yeux dans l'obscurité. La variation cyclique dans l'ERG amplitude est par la suite, en raison d'interne de l'animal horloge circadienne. Temps de points dans B sont toutes les 5min.

Figure 3
Figure 3. Oligo Exemple d'une réponse des fibres du nerf optique à la lumière flashé sur un seul récepteur ommatidial. Waveform-dessus de la trace montre le calendrier de relance. Cellules excentrique, dont les axones donner lieu à des fibres nerveuses, tous montrent une tendance similaire de la cuisson car cela sous les conditions d'illumination de l'expérience (5sec flash dans l'obscurité totale). Codage de la rétine avec des pointes est une limule propriété a en commun avec les mammifères, contrairement à d'autres invertébrés.

Figure 4
Figure 4 Exemple de traces de la réponse en tension à la lumière des trois types de cellules présentes dans l'œil de Limulus latéraux:. Cellule pigmentaire (A), la cellule retinular (B), et la cellule excentrique (C). La première cellule est non-visuels. Les deux derniers dépolariser sur un flash de lumière. La dépolarisation est plus important pour les cellules retinular parce qu'ils transduire la lumière et d'envoyer le signal à travers des jonctions communicantes dans la cellule excentrique, avec une certaine perte le long du chemin. Dans la cellule excentriques, des potentiels d'action tiré par l'axone sont vus à cheval sur la dépolarisation due à rétropropagation pointe dans le soma. L'amplitude des potentiels d'action a été atténuée dans la figure pour une meilleure visualisation du potentiel dépolarisants. Le potentiel de repos des cellules est-50mV.

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Discussion

Nous avons illustré comment effectuer des enregistrements ERG, les enregistrements du nerf optique, et les enregistrements sur les limules intrarétinienne in vivo. Les techniques d'enregistrement de chaque fournir des indications différentes dans les bases neurales de la vision, et elles peuvent toutes être utilisées pour étudier la fonction rétinienne chez les animaux vivants grâce aux grands yeux du crabe et de la carapace dure. L'activité du nerf optique peuvent même être enregistrés à partir librement comportement des animaux dans l'océan avec la construction correcte des électrodes (4). Ces techniques peuvent aussi être effectuées sur les yeux excisée avec des modifications mineures de la configuration. La pertinence de telles expériences à l'état naturel serait limitée, car les propriétés physiologiques du changement yeux du crabe lorsqu'elle est retirée de l'animal (5), mais la valeur pédagogique serait formidable pour un laboratoire d'enseignement étant donné l'utilisation généralisée de ces méthodes dans neurosciences.

ERG enregistrement, l'enregistrement du nerf optique, et l'enregistrement intrarétinienne ont été présentés séparément ici pour plus de clarté. En pratique, les méthodes d'enregistrement multiples sont souvent combinés au sein d'une seule expérience à la fois surveiller les changements dans l'activité neuronale et de la sensibilité visuelle dans un ou deux yeux latéraux. La petite chambre que nous utilisons pour l'enregistrement de l'ERG est particulièrement avantageuse à cet égard au cours d'autres modèles (1, 6). En outre, elle détient un réservoir de solution saline qui est scellé de l'air, éliminant ainsi les problèmes de stabilité liés à électrodes conventionnelles mèche qui peut s'assécher au fil du temps. La suite des expériences de vision possible avec limule est encore plus grande que cela parce que les mêmes procédures décrites pour l'enregistrement de nerf peut être utilisé pour la stimulation du nerf en se connectant l'électrode conduit à un stimulateur électrique au lieu d'un amplificateur de signal.

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Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Dr. Birgit Werner pour son aide à la production de cet article vidéo. Cette recherche a été financée par une bourse de carrière NSF.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
LED Light source Newark Inc 33C1292
Suction electrode Electrode A-M Systems 573000
XCell 3*4-Channel Extracellular Amplifier Amplifier FHC, Inc. 40-40-8B
Intracellular Recording Amplifier Cygnus IR-283A
APM Neural Spike Discriminator FHC, Inc. APM
Bits++ Video Board Cambridge Research Systems Bits++
Piezopatch Manipulator Micropositioner World Precision Instruments, Inc. PPM5000
Square Pulse Stimulator Nerve Stimulator Grass Technologies Model S48
P-97 Micropipette Puller Sutter Instrument Co. Model P-97
Borosilicate Glass Capillary Electrode glass World Precision Instruments, Inc. 1B150-4
Horsesh– crab (Limulus polyphemus) Animal Marine Biological Laboratories
Micropipette Puller Glass Puller Sutter Instrument Co. P-97
Zoom Stereoscope Microscope Jed Pella Inc. SMZ-168

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References

  1. Barlow, R. B. Jr Circadian rhythms in the Limulus visual system. J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).
  2. Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. Cell based model of the Limulus lateral eye. J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).
  3. Snodderly, D. M. Jr Processing of visual inputs by the brain of Limulus. J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).
  4. Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. Deciphering a neural code for vision. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).
  5. Barlow, R. B., Kaplan, E. Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye. Science. 174, 1027-1029 (1971).
  6. Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye. J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).

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