Sperm colheita e Inseminação Artificial de Ratos

Published 4/28/2007
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Biology

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Summary

Este protocolo demonstra métodos para a extração de espermatozóides dos testículos dos machos e depois inseminação camundongos fêmeas. Este procedimento é útil quando o tempo preciso é necessário em estudos de desenvolvimento bem como o trabalho transgênicos.

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Duselis, A. R., Vrana, P. B. Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice. J. Vis. Exp. (3), e184, doi:10.3791/184 (2007).

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Abstract

Roedores do gênero Peromyscus (ratos de cervos) são os mais prevalentes mamíferos nativos da América do Norte. Peromyscus espécies são usadas em uma ampla gama de investigação, incluindo toxicologia, epidemiologia, ecologia, comportamento, e estudos genéticos. Aqui eles fornecem um modelo útil para demonstrações de inseminação artificial.

Métodos semelhantes aos apresentados aqui foram usadas anteriormente em estudos com ratos vários veados, mas nenhum protocolo detalhado foi publicado. Aqui demonstramos o método básico de inseminação artificial. Este método consiste na extração dos testículos dos roedores, em seguida, isolar os espermatozóides do epidídimo e canal deferente. O espermatozóide maduro, agora em uma mistura de leite, são colocados no aparelho reprodutivo da fêmea no momento da ovulação. Fertilização é contado como 0 dias para o sincronismo do desenvolvimento embrionário. Embriões pode ser recuperado no tempo desejado ponto-e manipulado.

A inseminação artificial pode ser usado em uma variedade de espécies de roedores onde o tempo exato de embriões é crucial ou difícil de obter. Esta técnica é vital para as espécies ou variedades (incluindo a maioria Peromyscus) que não podem companheiro imediatamente e / ou onde o acasalamento é difícil de avaliar. Além disso, a inseminação artificial proporciona tempo exato para o desenvolvimento do embrião ou no mapeamento progresso do desenvolvimento e / ou trabalho transgênicos. Redução do número de animais pode ser usado desde a fecundação é garantida. Este método tem sido vital para promover o sistema Peromyscus, e esperamos beneficiar os outros também.

Protocol

Inseminação artificial

A inseminação artificial é usado em vez de cruzamentos naturais para aumentar as chances de que todas as fêmeas têm ficará grávida. Dois do sexo masculino foi usado para cada um fêmeas superovuladas ou uma mulher conhecida por estar no cio. Os epidídimos caudae de camundongos machos adultos foram colocados em uma suspensão de leite 9% e cortados aberto com 18 agulhas. O esperma foi permitido nadar livremente por alguns minutos e depois o epidídimos foram tomadas a partir da mistura. A suspensão foi avaliada com um microscópio de confluência e espermatozóides móveis. A bitola 22 blunt 1 ½ polegada de comprimento agulha foi usado para administrar o esperma. A curva ° 120 foi colocado cerca de 3 / 4 ª a caminho da agulha. A agulha foi introduzida na vagina até a curva e 0,025 - 0.05mls injetado. Se um assistente é utilizado para segurar a fêmea na posição adequada, o uso de anestésicos não é necessário.

Preparação

  1. Use 4 machos para 6 fêmeas
  2. Euthanize machos no viveiro
  3. Prepare cerca de 5 ml de leite de 9% de leite em pó
  4. Colocar 1,5 ml em placa de Petri pequena
  5. Cortar os canais deferentes e epidídimo
  6. Coloque em 1,5 ml de leite de 9%
  7. Usando duas agulhas 18, e usando movimento de corte de comprimento com agulhas, uma fatia de abrir o epidídimo e ducto deferente para liberar o esperma
  8. Retire sobra de tecido e verificar se há espermatozóides em microscópio

Injeção

  1. Use agulha sem corte em ângulo de 120 °
  2. Segure na mão do mouse e injetar mistura. Se desconfortável com uma pessoa segurando e injetáveis, duas pessoas podem ser usadas. Nenhum anestésico deve ser utilizado, como no se sabe como isso pode influenciar o procedimento.
  3. Use 0,05 ml de esperma / leite mix por fêmea

Destinatário fêmeas

  1. Fazer esfregaço vaginal em fêmeas receptoras (por esta altura as fêmeas destinatário devem estar em proestro / estro)
  2. Fêmeas que não atingiram estro pelo 5 º dia provavelmente não deve utilizar

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Acknowledgements

Gostaria de agradecer a Mike Dewey do Centro de Ações Peromyscus Genéticos para a sua percepção de valor, paciência e conhecimento sobre a reprodução de roedores.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Petri Dish Tool Fisher Scientific 08-772-30
18 gauge needle Tool BD Biosciences 305195
Powdered milk Reagent Any Supplier
1 ml syringe Tool National Scientific Company S7510-1
Forceps Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5060
Scissors Tool Roboz Surgical Instruments Co. RS-5882
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Reagent GIBCO, by Life Technologies 14200-075
22 gauge blunt needle Tool Give to me

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Comments

15 Comments

  1. can you tell me the resolution power of the microscope at which you have shown the video and the make of the mcroscope used.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2007 - 12:56 AM
  2. The total magnification to do the AI is between 10-²0x depending on the user for basic dissection. The sperm can be seen at 400x

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 1, 2007 - 2:09 PM
  3. Hello Amanda!  Thank for this article. I d like if you can give me more information about the powered milk, and if there is any posibility of create "make in home" powered milk. Too , if you can please give me the aprox. milimeters that need introduce the nedlle into the vagina. You understand my english? Thank you. Carolina (from Buenos Aires, Argentina)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 29, 2008 - 9:09 AM
  4. Hi Carolina, The milk is a commercial powdered milk bought from a regular grocery store. I am not sure what it contains if you wanted to make it at home. A little less than 1 cm of the needle was inserted into the vagina for sperm delivery but if you want to test it...I would use a dead mouse to check the insertion length when making a new needle. Good luck Amanda  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2008 - 12:19 PM
  5. Would there be any difference in the dimention of the insemination needle for rats. Is there a non-invasive method of extracting sperm in rats. How can the vaginal smear indicate prŒstrus/estrus.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 26, 2008 - 2:28 AM
  6. I know it is been a while since you posted the video. But what is the success rate of this protocol? thanks Ming

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 11, 2008 - 11:45 AM
  7. Amanda, Our lab is just beginning to look into artificial insemination.  After watching your video and looking at a few other artificial insemination protocols, I have a couple of questions: (1) How to you assess or induce ovulation? (²) How do you induce pseudopregnancy? Thank you, Rob

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 2, 2009 - 6:02 PM
  8. Hola, respuesta para Robert Stiles, mira si tu problema es matar a los machos, lo que puedes hacer castrar a los animales, de esa manera no es necesario sacrificarlos. Por lo tanto puedes obtener los espermas necesarios sin sacrificar al animal.   Saludos desde México Roberto Lazzarini, Biologo experimental    

    Reply
    Posted by: Roberto L.
    January 29, 2009 - 8:45 PM
  9. Hy Amanda, I would like to know  some things: 1 - what is your success rate? ² - Do you use the vaginal tampon like described by LECKIE et al, 1973 (Biology of Reproduction, Vol 9, 4²0-4²5)? 3 - I tested the techinique using dye solution and, afterwards, I sacrified the female, but I didn't see any solution inside the uterus. Do you introduce the needle in the cervix (like in human intra-uterine insemination) or you just put the needle very closely to it. Because don't have how to have sure about introducing into the cervix, unless using a special speculus. Thank you Daniela  

    Reply
    Posted by: Daniela F.
    March 4, 2009 - 9:44 AM
  10. Please send me the full video of collection of sperm from mice. Because i could not able to see the full video content in my institution so send full video to my mail. thanking you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 1:18 AM
  11. Hi, please contact us at support@jove.com and we'll see what we can do.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 18, 2009 - 3:19 PM
  12. hi Amanda ,please Iwant a copy of the video and any related subjects if you can support them to me I will very gratful .
    with my regards

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 9, 2009 - 9:16 AM
  13. do you induce pseudopregnancy in the recipient female or do
    you literally just inject the donor sperm??
    If you induce how do you do this?
    What are the pregnancy rates like from using this AI?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 29, 2010 - 4:50 AM
  14. Hi dear Amanda, I want to collect semen from rat, but when I removed the seminal vesicles and I cut them, semen was coagulated immediately. . In fact I need a protocole for rat semen collection. Thanks for help.
    Ameneh immunology MS student

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 12, 2011 - 8:52 AM
  15. Good day maam! Can i ask the procedure how to extract the sperm form the cauda epididymis? thank you.

    Reply
    Posted by: jamee d.
    November 23, 2012 - 6:55 AM

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